基于点击化学的荧光检测法用于载脂蛋白N-酰基转移酶的酶学表征及高通量筛选

本方案涉及两个重要方面：细菌必需的内膜结合载脂蛋白酰基转移酶的表征，以及在HDS格式下建立用于筛选该酶抑制剂的检测方法。该方法具有高灵敏度，适用于筛选目的，可为开发潜在新型抗生素提供支持。

本视频将重点展示该实验方案中的关键步骤，例如在处理含有非均相脂质和去垢剂的悬浮液时的混合、涡旋和超声处理。本实验操作将由我团队中的两位成员 Karine Nozeret 和 Aurelia Pernin 演示。首先，配制载脂蛋白和酰基转移酶或 LNT 测定所需的试剂混合液。

在1.5毫升离心管中，将炔基POPE和FSL-1-生物素与LNT反应缓冲液混合，终体积为18微升。针对所有测试条件，均需制备三份平行试剂混合物。将试剂混合物置于超声水浴中处理3分钟，并在37摄氏度孵育5分钟。

然后加入活性或非活性的LNT，使其终浓度为每微升一纳克，用移液器吹打混匀。将反应体系置于带有加热盖的恒温混匀仪中，在37摄氏度孵育16小时。同时，配制浓度为每毫升二毫克的链霉亲和素储存液。

然后将其稀释至每毫升10微克，以制备工作溶液。将100微升该溶液加入96孔板的每个孔中。随后将板置于37摄氏度下孵育过夜，不加盖，使各孔自然干燥。

第二天，配制以下储备液：5 毫摩尔的 Azido-FAM、50 毫摩尔的 TCEP、2 毫摩尔的 TBTA 以及 50 毫摩尔的五水合硫酸铜。取 0.2 微升 Azido-FAM 储备液、0.4 微升 TCEP 储备液和 0.2 微升 TBTA 储备液，加入 1.5 毫升 LNT 反应管中，进行点击化学反应。涡旋振荡溶液 5 秒钟。

然后加入0.4 µL的硫酸铜储备液。再涡旋5秒，将反应液在室温避光条件下孵育1小时。在点击化学反应混合物孵育的同时，用200 µL PBST1洗涤链霉亲和素包被板的孔3次。

将18微升点击化学混合物转移至链霉亲和素包被的孔中，加入100微升PBST1，使N-酰基-FSL-1-生物素FAM产物结合到孔板上。将生物素荧光素加入孔板中，作为链霉亲和素结合和荧光检测的阳性对照。然后在室温下避光孵育1小时，同时以300 RPM振荡。

孵育结束后，使用多通道电子移液器，每孔加入 200 µL PBST2，手动洗涤 6 次。每次用移液器冲洗 3 次。再用 200 µL PBS 洗涤 3 次，每次同样冲洗 3 次。

每孔加入 200 微升 PBS，在酶标仪中于 520 纳米处检测荧光。将所有结果保存在电子表格中，然后计算每个反应的标准差，以及通过非配对 t 检验计算阴性对照和阳性样本的 P 值。此处所述的体外 LNT 检测使用含有炔基脂肪酸的磷脂和 FSL-1-生物素作为底物，生成炔基 FSL-1-生物素。

通过与叠氮基-FAM发生点击化学反应，该产物可被荧光标记，并可通过荧光光谱法检测。反应条件已优化，以在520纳米处获得最大荧光信号。阴性对照包括无酶、使用酶的失活变体或加入巯基特异性抑制剂MTSES的反应体系。

生物素荧光素用作最大荧光信号的内参对照。为了建立高通量筛选实验，反应直接在384孔板中进行。洗涤步骤实现自动化，并减少了试剂用量。

该反应具有较高的灵敏度和可重复性，阴性对照与活性酶之间的荧光信号存在显著差异。对于高通量筛选，Z' 因子用于判断检测中的响应是否足够大，以满足筛选要求。在384孔板体系中进行的LNT检测，其平均Z'因子大于0.6，表明该检测性能优异。

本视频中的试管实验已开发成与高通量筛选（HDS）兼容的多孔板格式，可用于研究来自多种生物的其他酰基转移酶。