Name: 使用双标记 （MADM） 的马赛克分析开发脑皮质的血统跟踪和克隆分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学习使用双标记马赛克分析（MADM）技术进行小鼠脑皮质谱系追踪和克隆分析的方法。该技术可在单细胞水平定量测量祖细胞增殖行为及其子代细胞输出，为发育生物学中的功能基因分析提供可靠方案。

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我们感谢Hippenmeyer实验室所有成员的讨论，感谢奥地利科学技术研究所（IST Austria）的生物成像设施、生命科学设施和临床前设施提供的技术支持。本工作得到了奥地利科学技术研究所机构经费的支持；R.B. 获得了奥地利科学基金（FWF）Lise-Meitner项目（M 2416）的支持；N.A. 获得了奥地利科学基金（FWF）Firnberg项目（T 1031）的支持；GC 作为ISTplus博士后研究员，获得了欧盟“地平线2020”研究与创新计划下的玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议（No. 754411）的支持；A.H. 获得了奥地利科学院（ÖAW）DOC博士生奖学金（Doctoral Fellowship of the Austrian Academy of Sciences）的支持。本研究还获得了欧洲研究理事会（ERC）在欧盟“地平线2020”研究与创新计划下授予S.H.的资助（基金协议No 725780 LinPro）的支持。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种利用MADM在发育中的新皮层体内追踪单个放射状胶质前体细胞（RGP）谱系的方法。当与他莫昔芬（TM）诱导型CreERT2系统联合使用时，MADM事件的发生时间可被精确控制，从而在单细胞水平上对干细胞分裂模式提供高度定性和定量的可视化读出。通过调节TM的给药剂量，在理想情况下，每个大脑半球皮层平均可获得少于一个克隆，从而实现足够的空间分离，明确区分各个独立克隆。该方法在保持组织完整性的前提下，还能获取有关细胞位置、形态以及绝对细胞数量的关键信息。目前已有研究在染色体11（Chr. 11）7,11,12,46,56,57、染色体7（Chr. 7）51以及Rosa26位点的原始MADM系统47,53,59上开展MADM克隆分析研究。该技术在单细胞水平上的高分辨率，前所未有地揭示了子代细胞的形态特征及其克隆关系，并允许对增殖中的干细胞及新生克隆进行活体成像46,52。
剖宫产及通过代孕母鼠哺育幼鼠，以分析出生后时间点的克隆情况，是本实验方案中必要且关键的步骤。根据经他莫昔芬（TM）处理的妊娠母鼠的健康状况，可能无需进行剖宫产。然而，仍需使用代孕母鼠哺育幼鼠，因为经TM处理的母鼠可能存在泌乳困难。在使用不同CreERT2驱动系时，对代孕哺育的需求未观察到差异。MADM小鼠品系和代孕母鼠均维持在远交CD-1遗传背景上。如果无需进行剖宫产，则用于产生实验幼鼠的经TM处理的妊娠母鼠，可根据3R原则重复用于后续的实验性交配（需注意，仅当动物实验许可允许时方可执行此操作）。代孕母鼠可在其自身分娩后2天内用于哺育幼鼠，但当代孕母鼠与需寄养的实验小鼠同日分娩时，寄养成功率更高。因此，在步骤1.1中，必须同步安排代孕母鼠的定时交配。维持寄养幼鼠数量与代孕母鼠自身产仔数相近，有助于提高寄养幼鼠的存活率，因此可能需要移除部分甚至全部代孕母鼠的亲生幼鼠。其他可能提高寄养成功率的措施包括：用垫料和食物擦拭实验人员的手套（以去除手套的气味）；剖宫产后用代孕母鼠污染过的垫料和巢材轻轻擦拭幼鼠；以及在将寄养幼鼠放入代孕母鼠笼具前，先使其与代孕母鼠的亲生幼鼠密切接触。
与其他基于报告基因的谱系示踪方法类似，在为MADM克隆实验选择最合适的CreERT2驱动子时，必须仔细考虑。首先，所使用的启动子必须在时间和空间上针对目标前体细胞群体表达重组酶。找到这样的启动子可能具有挑战性，因为某些启动子在发育的不同阶段可能会改变表达模式或被沉默。为了提高细胞类型特异性，已有研究采用多个位点特异性重组酶，每个重组酶由不同的启动子驱动。当一个或两个重组酶在同一细胞中表达时，该细胞及其子代将被荧光报告基因标记74,75,76,77。总之，选择一个特异性针对所分析前体细胞群体的CreERT2驱动子至关重要。
该方法中最关键的步骤是克隆的鉴定，因为所有细胞必须明确地源自单个重组事件（步骤 8.1）。通过滴定他莫昔芬（TM）浓度，可确保每侧脑半球中红色/绿色细胞簇少于一个，从而最大化分析单个克隆的概率（步骤 2.2）7,11。如果目标克隆周围 500 µm 范围内存在相邻的细胞簇，则应舍弃该克隆。因此，在克隆出现前后需检查多个切片，以确保附近无其他重组事件。由于荧光信号较弱，对胚胎期克隆需进行 eGFP 和 tdT 的免疫组织化学染色（见第 6 节）。仅当需要共标记其他抗原时，才建议对成年期克隆进行此操作。在成像克隆时，必须完整捕获克隆所在皮层的全层宽度（即从软脑膜表面至胼胝体；见步骤 8.4），以免遗漏任何细胞。这也有助于图像处理过程中的图像对齐（第 9 节）。本方案的第 8 节需要倒置共聚焦显微镜，但可根据实际可用的显微镜配置进行调整。可使用落射荧光显微镜，但推荐使用共聚焦显微镜，因其可减少焦平面外的光污染。同时，必须调整激光强度和增益，以便明确区分绿色、红色和黄色细胞。无论使用何种配置，均建议采用至少 20x 的物镜，以确保紧密排列的细胞之间实现充分的空间分离。除记录所有细胞的皮层深度外（步骤 8.6），还必须利用脑图谱（如 Allen 脑图谱或其他立体定位坐标图）确定克隆所在的皮层区域。此外，应采用统一的文件命名规范，以确保克隆图像易于识别。文件名中可包含以下信息：唯一图像编号、成像日期、动物基因型、诱导年龄、分析年龄，以及该图像在同一批克隆图像中的序号。
在距离一个MADM盒较远的位置引入突变，可特异性地产生遗传嵌合体71，并能够在克隆水平上解析调控谱系和细胞类型多样性的分子机制7,11,46,62。为了利用MADM生成遗传嵌合体，MADM盒必须在减数分裂过程中与目标基因位于同一条染色体上（繁殖方案见图2）。因此，目前使用MADM进行的克隆分析仅限于位于7号染色体51、11号染色体46、12号染色体51以及位于Rosa26位点远端的6号染色体上的基因47。未来的研究将开发靶向任意染色体的MADM盒，从而几乎可在克隆水平上对小鼠基因组中的所有基因进行嵌合分析。
最后，MADM 并不限于分析发育中新皮层中的前体细胞。许多干细胞微环境的研究都可以受益于解析克隆相关细胞时空排列的能力。通过将 MADM 应用于大脑的其他区域、疾病状态（例如癌症）或其他组织47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59，研究揭示了来自不同类型前体细胞和干细胞克隆的谱系关系（当前 MADM 克隆研究的完整列表见表1）。MADM 另一个有趣的未来应用方向是将其与额外的功能性或亚细胞报告系统相结合，这将提高从克隆中获取信息的广度和深度。

大脑皮层是一个高度有序的结构，由六个不同的层次组成。皮层包含多种细胞类型，包括神经元和胶质细胞，它们相互作用形成功能性的神经回路。大多数（如果不是全部）皮层兴奋性投射神经元和胶质细胞均来源于一类共同的神经干细胞（NSCs），称为放射状胶质前体细胞（RGPs）1,2,3。RGPs本身则起源于组成早期胚胎神经上皮的神经上皮干细胞（NESCs）。在小鼠胚胎发育第9天（E9），NESCs开始向RGPs转变4。RGPs的谱系进展需要精确的时间和空间调控，当这一过程受到阻碍时，可能导致严重的神经系统疾病，如巨脑症、小头症、无脑回畸形，或精神分裂症和自闭症等神经功能障碍5,6。在E10阶段，大多数RGPs进行对称性增殖分裂，导致神经前体细胞池的扩增4,7。随后，RGPs逐渐开始进行不对称分裂，以特定的时间顺序产生皮层投射神经元。通过连续的神经发生波，新生神经元迁移至皮层板，形成皮层层状结构，其中早期生成的神经元位于深层，晚期生成的神经元则位于浅层8,9,10。由于克隆相关的锥体神经元在向皮层迁移时几乎不发生横向扩散，其子代细胞倾向于形成一种柱状或圆锥形结构，被称为神经元放射状功能单位4,11,12,13。到E17时，小鼠胚胎的神经发生扩增过程已完成14。RGPs还可产生室管膜细胞以及某些类型的胶质细胞，包括星形胶质细胞和少突胶质细胞1,15,16,17,18,19。RGPs具有同时生成神经元和星形胶质细胞的潜能，这一特性在所有皮层区域中似乎是一致的18，大约有1/6的产神经RGPs也会同时产生胶质细胞11。
目前，调控干细胞沿其谱系发生时间进程的遗传和表观遗传因素在很大程度上尚不清楚。基因表达的时间模式可能对放射状胶质前体细胞（RGPs）的谱系决定产生重大影响20,21,22,23,24。这种时间模式与空间模式之间紧密关联的关系如何导致不同皮层区域成年神经元类型的分子多样性，目前仍不清楚。同样，单个干细胞潜能及其细胞输出在细胞和分子水平上如何被调控，也是一个尚未解决的重要问题。未来的研究有望解答其中一些问题，最终加深我们对功能性皮层环路形成机制的理解。
发育神经生物学旨在理解脑内细胞之间的谱系关系。最初，可用于研究这一问题的工具非常有限，许多早期研究依赖于对透明生物体（如Caenorhabditis elegans）中细胞分裂模式的直接观察25。近几十年来，可用技术的数量和复杂性显著增加13,26,27,28,29。CRISPR-Cas9基因组编辑系统的出现使得通过引入可进化的DNA条形码来人工重建细胞谱系关系成为可能27,30。最近两种条形码策略的实例包括：使用归巢向导RNA将CRISPR-Cas9靶向特定的DNA条形码位点，或利用与切口酶Cas9融合的胞苷脱氨酶靶向内源性散在重复序列区域31,32。这些技术通过引入随时间逐步且稳定积累独特突变的条形码，实现了高度多重化的分析方法。基因组编辑方法具有极高价值，因为它允许基于这些条形码的共同遗传特征，对任意两个细胞之间的关系进行回溯性分析。然而，为了读取单个细胞中的条形码，通常必须破坏组织，因此来自单个前体细胞的位置信息、形态学特征以及绝对细胞数量等信息将丢失。
组合标记方法可保留空间信息，原则上还能区分定位紧密或甚至重叠的克隆33,34。一种具有信息价值的谱系示踪方法必须以稀疏且不可逆的方式标记单个前体细胞及其子代细胞。值得注意的是，Brainbow35 和 Confetti36,37 方法利用基于随机多色 Cre 重组酶的报告系统，从单一基因座表达多种荧光蛋白的组合。在体内可实现大量同时存在的颜色组合，使其在示踪大脑皮层放射状胶质前体细胞（RGP）克隆和星形胶质细胞时成为一种强大工具34。此外，已有研究开发出基于转座子的系统，可实现编码荧光报告蛋白的转基因在基因组中的稳定整合，从而用于皮层前体细胞的谱系示踪33,38,39,40,41。基于转座子的系统具有一项额外优势：报告结构可稳定整合至基因组中，从而可靠地标记具有亲缘关系的子代细胞。为特异性示踪星形胶质细胞谱系，已发展出多种方法，包括电穿孔导入piggyBac转座酶的方法，例如Star Track，该方法采用编码不同荧光蛋白的多种构建体组合40,42。另一种方法MAGIC markers则将Brainbow载体作为可移动的转基因引入。该方法已成功用于示踪胚胎期神经前体细胞及星形胶质前体细胞34,43。最近发现，通过双重组酶介导的盒式交换（MADR）进行嵌合体分析，能够稳定地标记那些从染色体上精确定义位点表达转基因元件的突变细胞44。这些强大的体内组合标记技术为前体细胞谱系动态提供了大量深入见解。然而，这些分析均在固定组织上进行，仅能提供特定发育阶段单个克隆的静态图像。为了观察单个克隆谱系动态随时间的变化，需要应用类似于在成年齿状回中所采用的慢性活体成像技术45。
双标记嵌合体分析（MADM）是一种强大的双色标记方法，可在小鼠体内对单个前体细胞进行谱系示踪46,47。实现MADM标记需要两个组分：第一，必须将MADM盒靶向整合到同源染色体上的相同位点。MADM盒包含两个嵌合型荧光报告基因，即eGFP（绿色，[G]）和串联二聚体番茄荧光蛋白（红色，tdT[T]）。GT盒包含eGFP的N端和tdT的C端，二者之间由含有loxP位点的内含子隔开；TG盒则相反，包含tdT的N端和eGFP的C端。第二，必须在同一细胞中表达Cre重组酶。在缺乏Cre的情况下，嵌合盒无法表达有功能的eGFP或tdT，因为其编码序列是断裂的。loxP位点作为Cre介导的染色体间重组的靶点，可同时重建两个表达盒。若重组发生在细胞周期的G2期并随后发生X型分离（G2-X），则两个子细胞将各自表达一种荧光蛋白。通过他莫昔芬（TM）对CreERT2活性进行时间调控，可精确获得MADM克隆的出生时间及其子代细胞的分裂模式信息（图1A）29,46,47。
MADM 能够以高单细胞分辨率系统地标记小鼠大脑中的单个克隆，其效果类似于传统的高尔基染色48或染料填充49等方法，但后者缺乏特异性且操作繁琐。由于克隆性 MADM 标记的细胞类型特异性仅由驱动CreERT2的启动子决定，因此原则上 MADM 可应用于小鼠任何器官和组织中的克隆谱系示踪47,50,51,52。事实上，已有研究利用 MADM 揭示了来自多种组织的克隆之间的谱系关系47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59。MADM 实验范式已被用于研究皮层投射神经元、胶质细胞以及发育中新皮层中出生后干细胞的谱系关系7,11,12,46,60,61,62,63,64,65。此外，MADM 还被用于在克隆水平上研究成年齿状回、丘脑、小脑颗粒细胞以及中间神经元的细胞谱系（详见表1中的完整列表）47,53,54,56,57,66。
MADM 的一个独特特征是能够将远离 MADM 基因盒的突变进行遗传连锁，从而产生遗传嵌合体（图 1B 和 图 2）。这使得野生型子代细胞被一种荧光标记标记（图 1B 中的 tdT），而纯合突变型同胞细胞则被另一种荧光标记标记（图 1B 中的 eGFP），且整个过程发生在一个未标记的杂合环境中。MADM 的独特之处在于，可在体内同一组织环境中对对照和突变亚克隆进行比较分析。最初，MADM 基因盒被靶向插入到 Rosa26 位点47，但该方法将 MADM 对基因功能的分析限制在了该位点远端的基因。为了克服（至少部分克服）这一限制并拓展基于 MADM 的基因分析可能性，研究人员已将 MADM 基因盒敲入到 7 号染色体（Chr. 7）51、11 号染色体（Chr. 11）46 和 12 号染色体（Chr. 12）51 的着丝粒附近。目前，针对小鼠全部 19 对常染色体的 MADM 基因盒靶向工作正在进行中，未来将几乎可用于研究任意基因，从而为发育谱系关系研究与功能遗传学分析的结合提供无与伦比的平台。

<table><tbody><tr><td>1 mL 结核菌素注射器（Omnifix Luer Lock）</td><td>Braun</td><td>9204512N</td><td></td></tr><tr><td>1,4-二氮杂二环辛烷（DABCO）</td><td>Roth</td><td>0718.2</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器（Omnifix Luer Lock）</td><td>Braun</td><td>8508429N</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形离心管</td><td>Sarstedt</td><td>65.554.502</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Roth/Greiner Bio-one</td><td>CE56.1</td><td></td></tr><tr><td>27号×3/4英寸针头（Sterican）</td><td>Braun</td><td>16010256E</td><td></td></tr><tr><td>玉米油</td><td>Sigma</td><td>C8267-500ML</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片（24 × 60 mm，1号）</td><td>赛默飞世尔科技（Menzel）</td><td>15747592</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat Cryostar NX70</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>957000H</td><td></td></tr><tr><td>Dako笔（蜡笔标记笔）</td><td>安捷伦</td><td>S200230-2</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>一次性切片刀（MX35 Ultra）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>705830</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子（Dumont #5）</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>玻璃防滚板</td><td>组织相容性</td><td>M 449980</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>LSM 800 共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td></td><td></td><td>25 mg/mL DAPCO，6 g 甘油，2.4 g Mowiol 4-88，6 mL dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0.12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Roth</td><td>0713.2</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>创新研究</td><td>IGDNSER100ML</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td><td>Watson-Marlow</td><td>036.3124.00A</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S8501-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 玻璃载片</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNT</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma</td><td>T5648</td><td></td></tr><tr><td>组织包埋模具 T-12（22 mm 方形）</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Trizma盐酸盐</td><td>Sigma</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>吐温-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;软件与插件：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>1.52p</td><td>&lt;a href=&quot;http://fiji.sc/&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;Fiji&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>MultiStackReg</td><td>1.45</td><td>&lt;a href=&quot;http://bradbusse.net/sciencedownloads.html&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;下载链接&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>TurboReg</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/&quot; 目标=&quot;_blank&quot;&gt;EPFL 生物成像&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>禅蓝</td><td>2.6</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.zeiss.com/microscopy/zh_cn/products/microscope-software/zen.html#introduction&quot; 目标=&quot;空白&quot;&gt;Zeiss&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;实验模型：生物体/品系：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠： &lt;4℃过夜，置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛中。&gt;Emx1-CreER&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX:027784</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 &lt;在4℃下，将脑组织置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛中固定过夜。&gt;MADM-11-GT&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX:013749</td><td></td></tr><tr><td>小鼠： &lt;在4℃下，将收获的器官置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛中过夜。&gt;MADM-11-TG&lt;/em&gt;</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX:013751</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;一抗：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>鸡抗GFP 1:500</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗tdTomato 1:500</td><td>Sicgen 抗体</td><td>AB8181-200</td><td></td></tr><tr><td>兔抗 RFP 1:500</td><td>MBL</td><td>PM005</td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;二抗：&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡 Alexa Fluor 488 1:500</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>715-475-150</td><td></td></tr><tr><td>驴抗山羊Cy3 1:500</td><td>杰克逊免疫研究</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>驴抗兔 Cy3 1:500</td><td>杰克逊免疫研究</td><td>711-165-152</td><td></td></tr></tbody></table>

利用双标记嵌合体分析技术（madm）对发育中大脑皮层进行谱系追踪与克隆分析

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

从数量有限的前体细胞开始，哺乳动物的大脑皮层形成了高度有序的功能性神经环路。然而，在发育中的神经上皮中，调控神经干细胞（NSCs）谱系转变并最终产生神经元和胶质细胞的细胞与分子机制仍不明确。用于追踪神经干细胞分裂模式并绘制克隆相关细胞谱系的技术已取得显著进展。然而，当前许多谱系追踪技术仍缺乏对子代细胞命运的细胞级分辨率，而这种分辨率对于解析前体细胞分裂模式至关重要。本文介绍了一种利用双标记嵌合分析（MADM）进行体内克隆分析的实验方案。MADM能够在单细胞分辨率下同时操控单个前体细胞，并可视化其精确的分裂模式和谱系进展。在有丝分裂的G2-X期发生的基于MADM的染色体间重组事件，结合时间可诱导的CreERT2系统，能够精确提供克隆的出生时间及其分裂模式的信息。因此，MADM谱系追踪可在单细胞水平上以前所未有的精度提供干细胞前体细胞增殖模式的定性和定量光学读出。MADM还可用于研究候选基因在神经干细胞谱系进展中的机制及功能需求。该方法的独特之处在于，可在同一组织微环境内体内直接比较对照与突变亚克隆。本文详细描述了该实验方案，并展示了在发育中的大脑皮层中应用MADM进行克隆分析和谱系追踪的实验范式。重要的是，只要存在CreERT2驱动元件，该方案可被推广应用于任何小鼠干细胞微环境中的MADM克隆分析。

MADM 技术可在 G2-X 染色体分离事件后，使两个子细胞分别表达功能性的绿色或红色荧光蛋白（图 1A）。由于 MADM 事件会对两个子代细胞谱系实现永久且可区分的标记，因此可对表达绿色和红色荧光蛋白的子代细胞谱系（亚克隆）进行定量分析。由此可确定原始前体细胞的分裂模式（例如对称性与非对称性分裂）及其分化潜能（例如产生的子代细胞数量）。在逆向推断原始前体细胞在他莫昔芬（TM）诱导时是否正在进行对称性增殖分裂或非对称性神经源性分裂时，对每种荧光标记的亚克隆进行定量具有重要意义。以往研究将皮层中来源于 Emx1-CreERT2 或 Nestin-CreERT2 的兴奋性投射神经元克隆分为两大类7,11,46。第一类称为“对称性增殖克隆”，平均包含数量较多的神经元，且绿色和红色两个亚克隆各自均含有四个或更多神经元。第二类为“非对称性克隆”，其特征是“少数”亚克隆包含少于三个神经元，而“多数”亚克隆则含有四个或更多神经元11。这些定义特指皮层放射状胶质前体细胞（RGPs），在应用于其他脑区或组织时可能需要重新评估。对于这两类皮层克隆，其子代细胞均会分布于皮层的浅层和深层区域。
在设计MADM克隆研究时，必须考虑若干因素。通过给予他莫昔芬（TM）诱导MADM事件的时间是一个关键考虑因素（图3）。在E10时期，使用Emx1-CreERT2或Nestin-CreERT2标记皮层兴奋性投射神经元的MADM克隆时，几乎所有放射状胶质前体细胞（RGPs）仍处于对称分裂阶段11。因此，在E10给予TM可捕获多轮增殖性RGP扩增过程，从而产生包含大量神经元的克隆。然而，E10时期的RGP数量通常较少，因此TM处理产生的MADM事件非常稀少（有时每只脑组织中不足一个）。大多数RGP在约E12时期由对称分裂转变为不对称的神经源性分裂。为了特异性靶向不对称神经源性克隆，最佳诱导时间应为E12或更晚（图3）。TM诱导与在皮层中观察到MADM重组事件之间的时间通常短于24小时。对于胚胎期TM给药，腹腔注射（IP）是首选方法，因其在克隆诱导方面具有更高的可重复性。同时，将TM剂量保持在最低水平也至关重要，原因有二：首先，若MADM重组频率升高，则可能诱导出多个甚至重叠的克隆；其次，若TM剂量过高，可能导致更高的胚胎流产率、胚胎重吸收率以及产仔数量减少。当在E10给予TM注射时，约半数妊娠母鼠出现流产现象，该频率自E11起逐渐下降，至约三分之一的妊娠母鼠发生流产。有关以往MADM研究中使用的TM剂量、诱导时间及CreERT2驱动子的总结，请参见表1。某些TM可诱导的CreERT2驱动子在未给予TM的情况下可检测到报告基因活性69。然而，在未给予TM的情况下，使用Emx1-CreERT2或Nestin-CreERT2驱动子均未观察到异位表达或MADM重组事件。这可能部分归因于TM介导的染色体反式重组发生频率比顺式重组低约1:1,000至1:10,000，从而降低了异位MADM标记的可能性。
在规划MADM克隆分析实验时，另一个需要考虑的因素是研究的持续时间。通过改变他莫昔芬（TM）诱导与实验分析之间的时间长度（A）（即时间窗口），可以展示干细胞随时间推移的动力学特征64。较短的胚胎期时间窗口（例如，TM/E11−A/E13；TM/E11−A/E16）可捕捉到胚胎期神经发生的动态过程（图4）。比较来自两个或多个不同时间窗口的克隆，可定量揭示不同时期谱系进展过程中产生的细胞数量以及神经元分布的变化情况64。为了全面捕捉单个克隆的发育潜能，有必要将分析的时间窗口延伸至出生后或成年阶段7,11,12。在胚胎期诱导并在成年期进行分析的新皮质克隆示例如图5所示。值得注意的是，皮质神经发生主要在E17前完成，而胶质发生则在此之后逐渐增加。约有1/6的神经源性放射状胶质前体细胞（RGP）还会进一步生成星形胶质细胞和/或少突胶质细胞11。
当放射状胶质前体细胞（RGPs）经历一轮或多轮增殖性分裂时，会形成对称克隆11。在胚胎第10至12天（E10−E12）之间诱导产生的RGP克隆平均体积更大，并提供了更多关于最终神经元分布的空间特征（图4A-C）。神经元在深层和浅层皮质中相对均匀分布的克隆呈现“圆柱”形状，而神经元在浅层比深层更分散的克隆则呈现“圆锥”形状11。为了全面获取克隆的空间和形态学信息，有必要利用连续图像进行计算重建以还原每个克隆的三维结构。为测量克隆的弥散程度，将克隆在浅层皮质（LII−VI）中的最大侧向弥散（在所有维度上测量）与深层皮质（LV/LIV）中的神经元弥散程度进行比较。该比值（上层分布∶下层分布）可作为克隆整体形态的可量化读数。
不对称克隆中，当少数亚克隆数量为三个或更少时，可揭示单个放射状胶质前体细胞的神经元输出图4D-F 和 图5A-F)7,11,12主要群体（大亚克隆）可标记为红色或绿色，当使用特定方法诱导时，每个克隆平均约含七个兴奋性投射神经元。 Emx1-CreERT2 或 Nestin-CreERT2(图5G)7,11,12通过分析大亚克隆中神经元在浅层和深层皮质层的分布，可进一步解析MADM克隆中的细胞总数。少数群体（小亚克隆）以互补颜色标记，平均每克隆含1−2个细胞图5H）。通过将小亚克隆和大亚克隆相加，可计算出总的“单位大小”，平均为8−9个神经元（图5I)7,11,12需要注意的是，尽管放射状胶质前体细胞（RGPs）的神经元输出具有高度可预测性，但其克隆群体中仍存在一定程度的克隆异质性。12,70.
在MADM盒远端引入突变可实现遗传嵌合体的构建，从而提供一种独特的方法来解析干细胞谱系发育的分子调控机制。因此，MADM为研究基因的细胞自主性功能（例如其与小头畸形或大头畸形的关联）提供了无与伦比的实验平台。通过比较在MADM遗传嵌合体中诱导产生的克隆与对照MADM中诱导的克隆，可以获得神经元数量和分布变化的高度定量读数。以往基于MADM的研究已在克隆水平上定量分析了Otx1在小头畸形形成中的细胞自主性功能（代表性示例见图6A-E）11。在另一项研究中，MADM克隆分析表明，Ndel1并不细胞自主地调控投射神经元的数量，而是调控新生神经元进入皮层板或在其中迁移的能力，而皮层板最终将发育为成年大脑皮层46。这些研究展示了MADM克隆分析在研究调控皮层发育基因的细胞自主性功能方面的高度定量特性。目前文献中尚无在克隆水平上利用MADM研究与大头畸形相关基因的实例。然而，在未来的研究中，对总体上调控皮层大小的相关基因进行分析，将能在分子和细胞水平上提供极具价值的见解。
<img alt="Cre介导的染色体间重组示意图，DNA复制，GeneX功能分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：在单个干细胞水平上进行谱系示踪和克隆分析的MADM原理。（A）为了使用MADM进行谱系示踪和克隆分析，必须具备两个组分。首先，MADM盒必须被靶向至同源染色体上的相同位点。MADM盒由两个嵌合荧光报告基因组成：eGFP（绿色，[G]）和串联二聚体番茄荧光蛋白（红色，tdT[T]）。GT盒包含eGFP的N端和tdT的C端，两者之间由一个含有loxP位点的内含子隔开。TG盒则相反构建，包含tdT的N端和eGFP的C端。其次，表达Cre重组酶的细胞必须含有已靶向的MADM盒。loxP位点作为Cre介导的染色体间重组的靶点，从而同时重建两个表达盒。如果该重组发生在细胞周期的G2期，并随后经历X型分离（G2-X），则两个子细胞将分别表达两种荧光蛋白中的一种。（B）在单克隆水平上进行遗传嵌合体分析的MADM原理。可通过减数分裂重组将突变等位基因（如点突变、缺失、插入、如图1B所示的loxP侧翼条件性等位基因等）引入TG-MADM盒的远端（详见图2及Hippenmeyer等人的文献46，了解如何将突变等位基因引入MADM系统）。当MADM盒之间发生由Cre重组酶介导的G2-X期染色体间反式重组时，将产生一个GFP+的纯合突变细胞（GeneX-/-），用于研究目标基因，以及一个tdT+的纯合野生型细胞（GeneX+/+），二者均处于未标记的杂合环境中46,47,71。其他类型的标记结果（例如黄色细胞）在克隆分析中不被使用，其机制已有详细描述11,46,47。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MADM小鼠制备示意图；遗传分析；谱系示踪，重组基因过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：用于谱系示踪实验MADM小鼠的繁育方案。 用于克隆分析的对照MADM（A）和Gene X MADM（B）实验小鼠的繁育方案。有关MADM繁育模式的更多信息，请参见Beattie等7和Hippenmeyer等7,46。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="MADM谱系分析示意图；时间过程取样、大脑皮层、纵向与间隔取样。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：基于MADM的克隆谱系分析的时间过程范式。 实验设计时间窗口的示意图。在纵向取样范式中，克隆诱导的时间点保持恒定，而分析前的持续时间有所不同。在渐进式间隔取样中，分析的时间点保持恒定，但诱导时间有所变化。根据所研究的具体问题，可选择使用其中一种或两种方法的组合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="对称与不对称RGP分裂示意图，通过GFP和tdT在细胞层定位中可视化MADM事件。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：发育期及成年新皮层中的MADM克隆分析。 在对称性增殖型（E10时给予TM诱导）（A-C）和不对称性神经发生型（E12时给予TM诱导）（D-F）的放射状胶质前体细胞（RGP）分裂中，由他莫昔芬（TM）介导的MADM克隆诱导。图中展示了在发育期（TM/E10−A/E16 和 TM/E12−A/E16）（B,E）以及成年期（TM/E10−A/P21 和 TM/E12−A/P21）（C,F）体内单个MADM克隆的情况，所用小鼠品系为 MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/-（B,E）和 MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/-（C,F）。在对照条件下，神经元产出与亚克隆颜色无关，绿色为主/少数亚克隆可与红色为主/少数亚克隆进行比较7,11。约六分之一的成年期克隆还包含星形胶质细胞和/或少突胶质细胞，以白色星号标示。图 B 和 F 分别经 Hippenmeyer 等人46 和 Rulands 与 Simons72 许可转载。CP = 皮层板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经发生克隆取样过程；MADM 方法；克隆重建与定量示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig5a.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：利用 MADM 进行克隆分析以量化 RGP 介导的神经元输出。 使用 MADM7,11 在克隆水平上分析单个神经发生型放射状胶质前体细胞（RGP）产生的兴奋性神经元（单位）。(A) 在发育中的大脑皮层中诱导主要为不对称 MADM 克隆的实验范式。(B) 可能的不对称克隆结果，其中大部分亚克隆标记为绿色或红色。(C) 跨越单个神经发生型不对称克隆的代表性连续切片。(D,E) 在 MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- 小鼠中，于 E12 期给予他莫昔芬（TM）诱导并在 P21 期进行分析，得到的代表性不对称 G2-X MADM 克隆的三维重建图像，其中多数细胞群标记为红色 (D) 或绿色 (E)。注意：绿色和红色标记的细胞均为野生型。(F) 示意图显示两种可能的实验性 MADM 克隆结果。(G) 对来自自我更新 RGP 的 MADM-11 克隆中多数细胞群大小的定量分析。(H) 对来自自我更新 RGP 的 MADM-11 克隆中少数细胞群大小的定量分析。(I) 不对称神经发生型 MADM-11 克隆的单体大小定量分析。假设数值可表示为均值 ± 标准误（SEM）。比例尺 = 100 µm (D 和 E)。TM = Tamoxifen。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="MADM克隆分析示意图及图表；基因对神经元投射的影响，突变组与对照组。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：利用MADM克隆分析研究导致小头症和大头症的基因。 对导致小头症或大头症的候选基因进行功能遗传学解析时，假想的MADM克隆分析结果。为了剖析目的基因（Gene X）在神经元输出中的细胞自主性功能，MADM技术需要通过减数分裂重组将突变等位基因引入MADM盒的远端（有关如何将突变等位基因引入MADM系统的详细信息，请参见图2、Hippenmeyer等46以及Laukoter等46,73）。(A,B) 用于克隆性RGP单元功能分析的实验性MADM范式示意图。突变亚克隆可构成少数（A）或多数（B）细胞群体。(C-E) 在定量分析对照MADM（白色柱状图）、Gene-X MADM小头症（灰色柱状图）和Gene-X MADM大头症（黑色柱状图）非对称克隆时的假想MADM克隆分析结果。(C) 多数群体大小的定量分析。(D) 少数群体大小的定量分析。(E) 非对称神经发生克隆的单体大小定量分析。假想数值可表示为均值 ± 标准误（SEM）。S = 假想情景，其中亚克隆细胞数量相对于对照组可能达到统计学显著性差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：文献中的MADM克隆研究。 文献中包含MADM克隆谱系实验的研究汇总，包括所使用的CreERT2驱动子、他莫昔芬（TM）剂量及注射时间。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147_table1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。</a>

本文介绍了一种利用双标记嵌合分析（MADM）在单细胞水平上对候选基因进行谱系示踪和功能遗传学分析的实验方案。MADM克隆分析提供了一个定量框架，用于测量单个前体细胞及其子代细胞的增殖行为、细胞产出及谱系关系。

利用双标记嵌合体分析技术（MADM）对发育中大脑皮层进行谱系追踪与克隆分析

从数量有限的前体细胞开始，哺乳动物大脑皮层形成了高度有序的功能性神经环路。然而，其背后的……

双标记嵌合体分析技术是一种强大的方法，可提供关于单个干细胞增殖行为和细胞输出的高度定量信息。该技术的一个独特之处在于，它能够在单细胞水平上实现谱系示踪和对候选基因的功能性遗传学分析。本次演示将由我的实验室成员完成：技术员 Carmen Streicher、博士后 Nicole Amberge 和 Gisselle Cheung，以及博士生 Andy Hansen。为了在实验小鼠中诱导 MADM 重组事件，使用配备25号针头的1 ml注射器，向妊娠时间已知的母鼠腹腔内单次注射他莫昔芬。从MADM克隆分析到出生后时间点，在胚胎发育第18至19天，将怀孕小鼠置于仰卧位，并用70%乙醇对毛发进行消毒。在子宫上方的下腹部皮肤做一小切口，再穿过肌肉层和腹壁做第二个切口以暴露腹膜。使用剪刀将子宫从周围组织中分离，然后将完整的子宫放入装有温水的手套中。接着用精细尖头剪刀和手指小心打开子宫壁以释放胚胎。轻轻按压新生幼崽胸部，间歇性促进其呼吸，随后将产前动物转移至代孕母鼠处。为获取神经系统的MADM克隆组织，将麻醉后的动物置于灌注手术托盘上并保持仰卧位，用70%乙醇消毒毛发。使用剪刀和镊子分别穿过皮肤和肌肉层各做一切口。当胸腔可见时，剪断并提起膈肌以暴露心脏，然后小心修剪肋骨并将其固定在手术托盘上。将连接至装有PBS的蠕动泵管路的针头插入心脏左心室下部，同时使用小型虹膜剪刀在右心房后端做一切口。先用PBS灌注心血管系统，紧接着立即使用新配制的冰上预冷的含4%多聚甲醛的PBS溶液进行灌注。灌注完成后，通过精细解剖取出脑组织，并将所获取的器官置于至少五倍于脑体积的新鲜4%多聚甲醛溶液中，于4°C下固定过夜。

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科研

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