商业化品系快速生长无菌肉鸡的生产及其在微生物组研究中的应用

迄今为止，无菌鸟类的制备仅限于用于研究的动物品系。本文表明，使用商业用途的动物同样可以实现这一目标。该技术使得利用家禽的遗传背景开展微生物群影响的相关研究成为可能。

在尝试本实验方案时，重要的是在标准条件下控制所选物种的繁殖，并具备在隔离器中操作的丰富经验。首先，在正压刚性隔离器内准备好50毫升离心管、塑料移液管、辐照饲料、高压灭菌水以及无菌密封的塑料容器。用2%季铵盐溶液填充转移杀菌陷阱，并使用甲醛蒸汽对隔离器进行三次灭菌，每次灭菌之间移动隔离器内的材料，以确保所有接触表面均被彻底消毒。

在引入鸡蛋前至少两天，将隔离器温度设置为 37 摄氏度。在引入当天，将湿度计调节至相对湿度 65% 至 70%。选择干净无瑕疵的鸡蛋后，立即将其浸入 1.5% 过氧乙酸溶液中 5 分钟，对蛋壳表面进行去污处理，然后使用经甲醛蒸汽消毒的盒子将鸡蛋运送至实验场所。

将卵在 14 摄氏度下储存 24 小时，然后用 1.5% 过乙酸再次进行消毒，并将卵置于孵化培养箱中孵化 19 天。第 19 天时，在无菌条件下使用透射光检卵灯检查胚胎的受精率、活力及发育情况。选取存活且已胚胎化的卵，用 1.5% 过乙酸溶液喷洒消毒 30 秒，或直至每个卵的整个表面均被覆盖。

将卵转移至无菌孵化隔离器中，用无菌去离子水冲洗后，放入孵化空间。孵化后，动物维持在无菌隔离器中，自由摄食经γ射线辐照灭菌的商用饲料，并饮用高压灭菌的自来水。孵化后一天，直接从不同雏鸡的直肠采集粪便样本，并将样本汇集于一支灭菌玻璃管中。

将一毫升粪便样本加入含有刃天青的九毫升巯基乙酸盐肉汤中，并将剩余样本加入九毫升脑心浸液（BHI）肉汤中。将试管置于37摄氏度下静置培养18至48小时。在培养18小时后，肉眼观察试管中培养基是否发生任何变化。

48小时后，从BHI粪便肉汤培养基中取一滴培养物，置于玻璃载片上，在显微镜下观察。若怀疑存在细菌，可从BHI培养物中取样，并接种至BHI琼脂平板，随后在37°C条件下培养18至48小时。若出现菌落，可采用高通量技术（如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，MALDI-TOF）进行细菌鉴定。

共进行了六批次无菌雏鸡的制备，所用ROSSL PM3鸡蛋来自法国两个不同的农场。总共收集了853枚鸡蛋，经过两次去污步骤并孵化19天后，86.40%的鸡蛋保持存活。在存活的鸡蛋中，有490枚接受了第三次去污处理，并被放入不同的孵化隔离器中，平均孵化率为79.80%。相对于最初收集的鸡蛋总数，该孵化率为68.94%。

孵化结果差异显著，与收集的卵数相比，可孵化出的健康雏鸡比例在41.67%至88.16%之间。该效应与产蛋母鸡的年龄直接相关，来自较年长母鸡的卵活力较低。这六次试验使用了四种不同的孵化隔离器进行。

经过细菌学检测确认，16个隔离器中的14个内的动物被证实为无菌状态，成功率为86.5%。该操作的关键在于维持隔离器的无菌环境，这需要严格遵守消毒程序，尤其是通过液体锁通道控制物品的引入。本方法可提供用于评估微生物群对鸟类生理和健康影响的实验动物。

如果能够获取蛋类样本，该方法可经调整后用于研究其他养殖鸟类或野生动物的微生物群。