Name: 植物圈和蔬菜发酵微生物群研究的侏儒生物系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 了解无微生物大白菜培养方法，用于研究叶面微生物相互作用及蔬菜发酵过程中的群落动态变化。该技术为农业微生物生态学研究提供了可控实验模型。

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本工作由美国农业部国家食品与农业研究所资助项目（编号：2017-67013-26520）支持。Tracy Debenport 和 Claire Fogan 提供了技术支持，Ruby Ye 和 Casey Cosetta 对本稿件的早期版本提出了有益的修改意见。

1. 无菌甘蓝的培养
<ol>
	<li>准备无菌白菜培养设备
	<ol>
		<li>清洗煅烧黏土以去除细小粉尘
		<ol>
			<li>用自来水至少冲洗煅烧黏土（材料表）3次，每次冲洗后弃去水分。 
			注意：煅烧黏土会产生极细的粉尘，建议在清洗时佩戴防护口罩（材料表）。</li>
			<li>将煅烧黏土均匀铺成薄层（约4 cm）放入高压灭菌托盘中，使用干热循环进行高压灭菌（121 °C加热20分钟，干燥20分钟）以实现灭菌。</li>
			<li>将灭菌后的煅烧黏土摊开于托盘中，置于温暖的培养箱（30−37 °C）内至少一周，使其完全干燥。每隔3天搅拌一次，确保黏土彻底干燥，以便其均匀吸收Murashige和Skoog（MS）营养液（见第1.2节）。 
			注：干燥还有助于在将煅烧黏土称量装入试管时保持体积一致。也可采用其他干燥方式（如干燥烘箱），同样适用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>清洗用于培养无菌白菜的玻璃器皿
		<ol>
			<li>每次使用后应彻底清洁并灭菌玻璃试管（材料表）。先将试管浸泡在30%次氯酸钠溶液中30分钟，再用自来水充分冲洗，随后在细菌学模式下进行酸洗。每次使用后也应对双通试管帽（材料表）进行酸洗处理。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>白菜种子表面灭菌
		<ol>
			<li>将最多100粒大白菜（B. rapa var pekinensis）种子放入1.5 mL微量离心管中。 
			注：向一个微量离心管中加入超过100粒种子或更换管子尺寸，可能因种皮去除不充分而影响种子发芽率。</li>
			<li>向种子中加入1 mL 70%乙醇，涡旋振荡5分钟，然后用移液器吸弃乙醇。</li>
			<li>加入1 mL 50%次氯酸钠溶液，涡旋振荡5分钟，再用移液器吸弃漂白液。</li>
			<li>加入1 mL高压灭菌的去离子水，涡旋振荡5分钟，然后用移液器吸弃去离子水。</li>
			<li>重复步骤1.1.3.4共3次，以彻底去除残留漂白剂。播种前将种子在无菌去离子水中浸泡2−8小时，以软化种皮。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养无菌白菜 
	注：大白菜（B. rapa var pekinensis）在含有浸透Murashige和Skoog（MS）营养液的煅烧黏土的玻璃试管（15 cm × 2.5 cm）中培养（图1）。
	<ol>
		<li>将10 g洁净的煅烧黏土称量至洁净的玻璃试管（15 cm × 2.5 cm）中。</li>
		<li>将4.4 g MS培养基溶解于1 L去离子水中，配制MS营养液。用移液器向每支试管中加入约9 mL MS营养液，使煅烧黏土完全浸润。 
		注：若试管中存在过多游离液体，会阻碍种子发芽，因此可能需要略微减少部分试管中的MS营养液用量。</li>
		<li>用22 mm双通试管帽松盖试管，进行高压灭菌（121 °C，60分钟）。从高压灭菌器中取出后，将试管帽压紧以密封试管。待试管冷却至室温后再使用。</li>
		<li>使用无菌超长（25.4 cm）镊子，小心地将一颗无菌白菜种子置于每支试管中央。将试管放入7孔托盘中，置于光照培养架下（使用全光谱T5荧光灯或其他植物生长照明系统），设置16小时光照周期，温度为24 °C。 
		注：种子通常在一夜之间发芽，5天后长出第一片真叶。真叶是指子叶形成后出现的第一片具维管组织的叶片，边缘更皱褶，在Brassica rapa中表面覆盖有毛状体（trichomes）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>检测无菌白菜的无菌性 
	注：为检测白菜是否处于无菌状态，可从每批中随机选取少量（5−10株）植株进行平板培养，以判断是否存在可培养的微生物菌落。
	<ol>
		<li>用灭菌镊子夹住植株基部，轻轻将白菜从玻璃试管中取出。在完全取出植株前，使用灭菌解剖剪小心剪下根部。将白菜叶片压缩后装入1.5 mL微量离心管中。 
		注：较大的白菜植株在仍处于试管中时，可能需要先移除一至两片较大的叶片，以便更容易将其装入1.5 mL微量离心管。若需保留整株样品，可在其余部分装入后，再将这些大叶片加入同一离心管中。</li>
		<li>向每个1.5 mL微量离心管中加入400 µL 1×磷酸盐缓冲液（PBS）。使用无菌微型研杵，上下研磨30次，充分匀浆化白菜组织。</li>
		<li>取100 µL白菜匀浆液涂布于琼脂平板上，检测样品中是否存在污染物。大多数叶表微生物可在胰蛋白胨大豆（TS）琼脂平板上生长。由于白菜匀浆液较粘稠，易堵塞普通移液器吸头，因此涂布时应使用宽口移液器吸头。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用微生物溶液接种植物叶表
<ol>
	<li>制备接种菌株的甘油保存液 
	注意：表1列出了可用于本步骤的微生物分离株。其他叶际分离株也可在此使用。
	<ol>
		<li>从新鲜划线培养的平板上选取单菌落，密集划线接种至两到三个相同培养基的新平板上，以获得大量菌落。</li>
		<li>培养2−5天后，将所有平板上的菌落刮下，收集至一个含有15 mL 15%甘油的15 mL锥形离心管中，涡旋振荡充分混匀。</li>
		<li>取1 mL充分混匀的甘油保存液转移至1.5 mL微量离心管中，于-80 °C保存备用。剩余14 mL甘油保存液也于-80 °C保存，因接种白菜时需要使用相对大体积的接种液。</li>
		<li>使用前一周，将步骤2.1.3中含1 mL甘油保存液的1.5 mL离心管置于冰上解冻，进行系列稀释（例如10-4、10-5和10-6），涂布平板以测定14 mL接种液的浓度（每微升菌落形成单位[CFU]数）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对接种喷雾瓶进行灭菌
	<ol>
		<li>拆卸琥珀色圆形波士顿喷雾瓶（59 mL），将所有组件（泵头、导管、瓶盖和瓶体）放入一个带紧密盖子的大塑料容器中，用30%次氯酸钠溶液浸泡30分钟。</li>
		<li>浸泡完成后，轻轻抬起容器盖子的一角，小心倾倒出所有次氯酸钠溶液。</li>
		<li>用去离子水（约1 L，根据容器大小调整）注满塑料容器以冲洗瓶子，再次仅抬起盖子一角小心倒出水。</li>
		<li>用70%乙醇溶液喷洒生物安全柜内部，并开启紫外灯照射30分钟进行灭菌。 
		注意：后续操作应在生物安全柜内进行，以避免瓶子在空气中干燥过程中受到微生物污染。</li>
		<li>从大塑料容器中取出瓶子，使用移液器向每个瓶内加入灭菌去离子水。重新组装泵头并插入每个瓶中，对每个瓶子喷压10次，使去离子水通过泵头组件，以去除残留的次氯酸钠。</li>
		<li>重复步骤2.2.5，确保玻璃瓶中所有次氯酸钠均被彻底清除。</li>
		<li>通过以下方法检测瓶子是否无菌：待瓶子完全干燥后，在每瓶侧面贴上标签编号，向每瓶加入10 mL 1x PBS缓冲液，并向TS琼脂平板喷压3次。喷洒后，将平板在室温下培养一周。若平板上出现任何菌落生长，则表明相应瓶子未达到无菌状态，不应在实验中使用。</li>
		<li>在储存无菌瓶之前，倒掉所有残留的PBS缓冲液，并让瓶子在生物安全柜内彻底干燥。将无菌瓶存放于无菌塑料容器中（通常使用之前用于漂白的容器），直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备微生物接种液并喷雾接种无菌白菜 
	警告：所有操作均应在生物安全柜内进行，因为喷雾过程会产生气溶胶，若在实验台面操作可能污染工作区域或带来健康风险。 
	注意：白菜在播种后5天将长出真叶，因此建议在播种一周后再进行微生物接种。由于培养管已密封，无需额外浇水。实验最好在播种后一个月内完成，因为小培养管会限制白菜的生长。
	<ol>
		<li>将甘油保存液置于冰上解冻，并用1x PBS缓冲液稀释至所需接种浓度（浓度根据步骤2.1.4中解冻并涂布1 mL样品所测定的结果确定）。 
		注意：可采用多种不同的接种浓度，但叶际分离株在10天内可在白菜匀浆液中从104增长至108 CFU/mL。</li>
		<li>向无菌喷雾瓶中加入10 mL稀释后的甘油保存液，先向大废液收集瓶中喷压5次，以清除喷雾瓶泵头组件中残留的PBS缓冲液。</li>
		<li>打开白菜培养管盖，将白菜植株倾斜朝向喷雾瓶，对每株白菜喷压3次接种液，每次约提供200 µL，共约600 µL接种物。</li>
		<li>接种后，取部分白菜样本用于测定实际接种输入浓度。使用灭菌镊子将白菜从培养管中取出，用灭菌解剖剪切除根部，然后小心地将植株放入已预先称重的无菌1.5 mL微量离心管中。如需计算每克白菜的CFU数，请记录白菜重量以供后续计算。</li>
		<li>向每个含有白菜的1.5 mL微量离心管中加入400 µL 1x PBS缓冲液，使用无菌微型研磨杵反复研磨30次，将白菜组织充分匀浆于1x PBS中。</li>
		<li>根据需要对白菜匀浆液进行稀释，并取样涂布平板。由于匀浆液较黏稠且含有较多植物组织碎片，移液时应使用宽孔枪头。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 制备无菌蔬菜提取物
注意：本方法是白菜无菌培养基制备方法的改良版本18,19。
<ol>
	<li>从超市购买一颗卷心菜。在实验室中，去除并丢弃卷心菜最外层的叶片。将剩余的卷心菜切碎至适合放入搅拌机的大小，然后均质化成细腻的浆状物，即继续搅拌也不会使质地变得更细。 
	注意：任何能够将卷心菜切碎成均匀细腻浆状物的搅拌机均适用于本方法。</li>
	<li>称量均质后的卷心菜匀浆，按每克卷心菜加入2 mL蒸馏水的比例添加蒸馏水。将混合后的卷心菜浆液通过两层篮式咖啡滤纸（未漂白纸）进行过滤。</li>
	<li>将卷心菜浆液分装至离心管中（管子尺寸需根据离心机型号确定）。在20,000 × g 条件下离心20分钟，直至大颗粒物质完全沉淀。 
	注意：必须进行较长时间的离心，因为卷心菜颗粒会迅速堵塞滤器灭菌装置。</li>
	<li>使用血清移液管小心吸取上清液，避免扰动沉淀的卷心菜残渣。若需模拟使用标准盐浓度的发酵条件，可在本步骤加入2% w/v的NaCl（即在滤器灭菌前加入）。</li>
	<li>使用连接真空泵的0.2 µm滤器（500 mL或1 L）对蔬菜提取物进行过滤除菌。分装至无菌管中（可使用50 mL或15 mL离心管），并于-80 °C冷冻保存，直至使用。</li>
</ol>
4. 无菌蔬菜提取物的接种
<ol>
	<li>将SVE解冻，并分装490 µL至1.5 mL微量离心管中。每种处理在每个时间点至少需设置五个重复，因为每个时间点的测定均为破坏性取样。</li>
	<li>将微生物分离株的甘油保存液置于冰上解冻，并用1×PBS稀释至所需浓度。乳酸菌在SVE中的浓度可低至每毫升5,000 CFU。为达到该浓度，需将保存液稀释至250 CFU/µL，因接种时将使用10 µL加入总体积为500 µL的SVE中。</li>
	<li>向SVE中加入10 µL稀释后的微生物分离株，上下吹打数次以充分混匀。在设定温度下培养（14 °C适用于泡菜发酵条件，24 °C适用于较高温的酸菜发酵）。</li>
	<li>通过在第1、2、4、7和14天收集重复样本管，测定微生物分离株在SVE中的生长速率。 
	注意：发酵初期进程较快，随后逐渐减缓。因此，设置较多的早期时间点可更清晰地解析出发酵动态变化过程。</li>
	<li>在每个时间点，通过上下吹打数次充分混匀接种后的SVE。用1×PBS对SVE进行系列稀释后涂布于琼脂平板。在计数前将平板培养4−7天。 
	注意：应使用Man、Rogosa和Sharpe（MRS）琼脂平板计数所有乳酸菌，酵母菌使用酵母胨葡萄糖（YPD）琼脂，大多数来自叶表微生物组的其他细菌分离株则使用TS琼脂。</li>
	<li>使用微型pH探针在每个时间点记录样品的pH值。 
	注意：此步骤应在涂布平板之后进行，因为pH探针可能在不同管或处理之间转移细胞。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

无菌大白菜植株已被用于研究乳酸菌在大白菜叶表微生物组中的扩散限制17。无菌大白菜还可用于检测单个或成对微生物在叶表中的生长情况（图1）。针对三种不同类型的卷心菜——红卷心菜、绿卷心菜和大白菜，已测试其无菌蔬菜提取物的制备方法。这些SVE均可作为可靠的生长培养基，接种的微生物在不同培养基中均表现出一致的生长特性。SVE中单菌株的生长速率（图2）显示，乳酸菌生长迅速，并能快速酸化培养基，其过程与预期的发酵过程一致17。
无菌植物与无菌蔬菜提取物可结合使用，以解决多种不同的生态学问题，例如叶际或发酵环境中的优先效应与群落演替。通过将卷心菜匀浆后涂布培养，获得叶际分离菌，或通过酸菜培养获得乳酸菌，即可简便地构建合成微生物群落16。可在叶际或SVE中开展成对相互作用实验或剔除单一种群的实验，以评估群落成员的重要性或功能。可在SVE中...

叶际微生物多样性在维持植物健康方面发挥着重要作用，同时也可能影响植物抵抗环境胁迫的能力1,2,3,4,5。反过来，作物的健康状况直接影响食品安全与品质6,7。植物在生态系统功能中扮演重要角色，其相关的微生物组不仅影响植物执行这些功能的能力，也直接对环境本身产生影响8。尽管科学家已开始解析叶际微生物组的功能与组成，但影响叶际微生物群落组装的生态过程尚未被完全阐明9,10。叶际微生物组是研究微生物组生态学的一个理想实验系统11。这些微生物群落结构相对简单，且许多群落成员可在标准实验室培养基上培养10,12,13。
发酵蔬菜是植物叶表微生物群落结构具有重要意义的一个体系。在酸菜和泡菜的制作过程中，天然存在于蔬菜叶片上的微生物（芸薹属Brassica物种的叶表微生物群落）即作为发酵的接种源14,15。乳酸菌（LAB）被认为是蔬菜微生物组中普遍存在的成员，但在叶表环境中的丰度可能较低16。发酵过程中强烈的非生物选择作用促使微生物群落组成发生变化，从而使乳酸菌丰度增加。随着乳酸菌的生长，其产生乳酸，形成发酵蔬菜产品的酸性环境17。叶表微生物群落与发酵过程之间的关联为利用蔬菜作为模型来研究微生物组的构建机制提供了机会。
我们已开发出无菌种植纳帕白菜的方法，并可使用喷雾瓶将其接种特定的微生物群落。这是一种经济且可靠的方法，可均匀地将单一微生物或混合群落接种到白菜上。此外，我们还开发了一种无菌蔬菜提取物（SVE），来源于三种不同类型的白菜/品种：红甘蓝和绿甘蓝（Brassica oleracea）以及纳帕白菜（B. rapa）。在这些SVE中添加盐分可模拟发酵环境，从而实现对发酵微生物组组装过程的小规模且相对高通量的实验研究。这些方法可用于研究叶表微生物群落的组装机制，以及叶表微生物群落动态如何影响蔬菜发酵的成功。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>VWR</td><td>20170-650</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>7 孔托盘</td><td>Sigma Magenta</td><td>T8654</td><td></td></tr><tr><td>琥珀色圆形波士顿玻璃瓶</td><td></td><td>GPS 712OZSPPK12BR</td><td>从 Amazon.com 上不同供应商处订购</td></tr><tr><td>篮式咖啡滤纸</td><td>If you care</td><td></td><td>（未漂白纸）购自 Wholefoods</td></tr><tr><td>漂白剂（无汞）</td><td>Austin's</td><td>50-010-45</td><td></td></tr><tr><td>硼硅酸盐玻璃管</td><td>VWR</td><td>47729-586</td><td></td></tr><tr><td>煅烧黏土</td><td>Turface</td><td>MVP</td><td>从 Root Naturally 购买 6 夸脱袋装产品，Amazon.com 上订购。粒径约为 3–5 mm</td></tr><tr><td>美膳雅搅拌机</td><td>Cuisinart</td><td></td><td>Cuisinart Mini-Prep Plus 食品加工机，3 杯容量</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>7-389-A</td><td>American Educational Products</td><td>Amazon.com 上订购</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Aven</td><td>18434</td><td>Amazon.com 上订购</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>KleenGuard M10</td><td>Kimberley-Clark</td><td>64240</td><td></td></tr><tr><td>大型塑料容器</td><td>Rubbermaid</td><td></td><td>Amazon.com 上订购</td></tr><tr><td>光照培养架</td><td>Gardner's Supply</td><td>39-357</td><td>全光谱 T5 荧光灯管</td></tr><tr><td>Magenta™ 2 孔盖</td><td>Millipore Sigma</td><td>C1934</td><td></td></tr><tr><td>Man、Rogosa 和 Sharpe 培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0881-17-5</td><td>该培养基用于液体培养，添加 15 g 琼脂以制备平板</td></tr><tr><td>微型 pH 探针</td><td>Thermo Scientific</td><td>8220BNWP</td><td></td></tr><tr><td>微型研磨棒</td><td>Carolina</td><td>215828</td><td>也称为沉淀研磨棒</td></tr><tr><td>MS 营养肉汤</td><td>Millipore Sigma</td><td>M5519</td><td>Murashige 和 Skoog 基础培养基</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>大白菜种子</td><td>Johnny's Select Seeds</td><td>2814G</td><td>&lt;em&gt;B. rapa var pekinensis (Bilko)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>培养皿（100 mm × 15 mm）</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>用于制备琼脂平板</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-842-941</td><td>Teknova</td></tr><tr><td>植物组织培养盒</td><td>Sigma</td><td>Magenta GA-7</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>无菌棉签棒</td><td>Puritan</td><td>10805-018</td><td>使用前需高压灭菌</td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m 过滤灭菌滤器</td><td>Nalgene</td><td>974103</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶大豆琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-17-3</td><td>该培养基用于液体培养，添加 15 g 琼脂以制备平板</td></tr><tr><td>宽口移液器吸头</td><td>Rainin</td><td>17007102</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0428-17-5</td><td>该培养基适用，也可自行配制含酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖的培养基，制备平板时添加 15 g 琼脂</td></tr></tbody></table>

用于研究叶际和蔬菜发酵中微生物组组装的无菌系统

A Gnotobiotic System for Studying Microbiome Assembly in the Phyllosphere and in Vegetable Fermentation

叶表层（phyllosphere）是植物地上部分可被微生物定殖的区域，是研究微生物群落组装过程的一个有用模型系统。本实验方案概述了一种用于研究纳帕卷心菜（Napa cabbage）叶表层中微生物群落动态的系统。该方法描述了如何在试管中使用煅烧黏土和营养肉汤基质培养无菌植物。通过将特定的微生物培养物接种到无菌植物上，可对叶表层中的微生物生长及群落动态进行定量分析。此外，通过使用由卷心菜制备的无菌蔬菜提取物，还可评估发酵过程中微生物群落的变化。该系统在实验室中建立起来相对简单且成本较低，可用于探讨微生物群落组装中的关键生态学问题。同时，它也为理解叶表层群落组成如何影响蔬菜发酵过程中的微生物多样性和品质提供了研究机会。这种构建已知菌群卷心菜叶表层群落的方法也可推广应用于其他野生和农作物植物种类。

Napa白菜的生长速率 
种子消毒方法已用多种不同的大白菜进行测试（B. rapa var. pekinesis; 补充图1) 来自多家供应商，均表现出一致的生长状态且生长速率相似。然而，在不同物种中验证这些方法时 芸薹属 (B. rapa： 芜菁紫顶 B. oleracea： 开罗杂交种，热带巨人杂交种； 芸薹（B. campestris）： 玩具 Choi 杂交型小白菜 B. juncea 芥菜红巨人）效果有限（补充图2）。与能够形成紧密整齐莲座状结构、适合放入玻璃管中的大白菜不同，这些 芸薹属 spp. 在灭菌后萌发率较低，或茎迅速伸长，导致植株细弱、生长不良。此外，对较老的种子进行灭菌时（&gt;不建议使用存放一年以上的种子，因为种皮会变干，导致在灭菌过程中更难去除。应定期购买新种子，并在实验前对部分白菜进行测试，以确定其是否无菌。<...

已开发出一种无菌种植大白菜的方法，该方法可使研究人员评估单一微生物物种或多种微生物群落如何在大白菜叶片表面相互作用。同时提供了一种无菌蔬菜提取物，可用于检测蔬菜发酵过程中微生物群落组成的变化。

叶际（phyllosphere），即植物地上部分可被微生物定殖的区域，是研究微生物过程的一个有用模型系统，可用于识别……

通过本实验方案，我们可以探究微生物在叶表环境中如何组装及相互作用的关键问题。该方法还有一个额外优势：通过使用无菌的蔬菜提取物，可将叶表微生物群落的结构与其在蔬菜发酵过程中的功能联系起来。这些技术使科学家能够验证微生物在叶表环境中的相互作用，并追踪这些叶表微生物群落如何影响发酵过程。为了对白菜种子进行表面灭菌，首先将100粒种子放入一个1.5毫升的微量离心管中。向管中加入1毫升70%乙醇，涡旋振荡5分钟。然后用移液器吸除乙醇。加入1毫升50%次氯酸钠溶液，涡旋振荡管子5分钟，然后弃去次氯酸钠溶液。用1毫升灭菌去离子水冲洗种子，涡旋振荡管子后弃去水，重复此步骤共冲洗四次。最后一次冲洗后，将种子浸泡在灭菌去离子水中2至8小时，以软化种皮，随后进行种植。称取10克洁净的钙粘土放入一根15厘米×2.5厘米的玻璃试管中。向每根试管中加入约9毫升配制好的MS肉汤，以浸没钙粘土。用22毫米双通试管帽松松地盖住玻璃试管。在 121 摄氏度下对试管进行高压灭菌 60 分钟。从高压灭菌器中取出试管时，将管盖推入玻璃试管以密封，然后将试管冷却至室温后再使用。待试管冷却后，使用超长镊子将一颗无菌白菜种子轻轻放入每支试管的中央。将试管放入七孔托盘中，并将托盘置于光照培养架下，在24°C条件下进行16小时光照周期培养。种子在五天后将长出第一片真叶，即子叶形成后的第一片具维管组织的叶片。该叶片边缘呈皱褶状，并密布腺毛。为了检测无菌白菜的无菌性，用灭菌镊子轻轻夹住植株基部并将其拔出。在将白菜完全从试管中取出之前，用灭菌的解剖剪小心剪去根部。然后，将白菜叶片压实至1.5毫升微量离心管中。向每个微量离心管中加入 400 µL PBS，并使用无菌的微型研磨杵匀浆白菜。用宽口移液器吸头将 100 µL 白菜匀浆液涂布于琼脂平板上。为制备接种菌株的甘油保存液，需轻轻划线分离单个菌落至两到三个相同培养基的新平板上。将菌落培养两到五天，然后用15毫升15%甘油将其从平板上刮下，收集至15毫升锥形管中。充分涡旋振荡管子以混匀。取1毫升混匀的甘油菌种分装至微量离心管中，其余14毫升甘油菌种一同于-80摄氏度保存，直至使用。使用前一周，将1毫升分装样品置于冰上解冻，并进行不同倍数的稀释，以确定接种液的浓度。准备接种白菜时，将甘油保存菌种置于冰上解冻，并稀释至所需浓度。取10毫升稀释后的菌液加入无菌喷瓶中，向一个较大的废液收集烧杯中喷洒五次。 打开卷心菜管的盖子，将卷心菜管倾斜朝向喷雾瓶。每株卷心菜喷洒三泵接种液，然后收获部分卷心菜以评估实际的接种浓度。收获卷心菜时，使用灭菌镊子将其从管中取出。用无菌解剖剪剪去根部，并小心将其放入预先称重的无菌微量离心管中。记录卷心菜的重量，以供后续计算使用。向每支含有卷心菜的离心管中加入 400 µL PBS，用微型研杵研磨 30 次，然后使用宽口移液器吸头将卷心菜匀浆接种到平板上。去除并丢弃卷心菜最外层的叶片，将剩余的卷心菜切碎至适合放入搅拌机。将其搅打成细浆，称取卷心菜匀浆的质量。按每克卷心菜加入2毫升蒸馏水。然后将卷心菜匀浆通过两层篮式咖啡滤纸过滤。将滤液分装至离心管中，在20,000 × g条件下离心20分钟，或直至大颗粒物质完全沉淀。小心移除上清液，注意不要扰动沉淀的卷心菜残渣。为了重现具有标准盐浓度的发酵条件，向提取物中加入2%（重量/体积）的氯化钠。使用连接真空泵的0.2微米滤器过滤蔬菜提取物，将其分装至无菌试管中，并在-80摄氏度下冷冻保存。种子灭菌方法已在多颗中国大白菜上进行测试，所有样本均表现出相似的生长速率。然而，其他芸薹属物种的实验效果有限，因为这些植物在灭菌后要么发芽率较低，要么茎迅速伸长，形成细弱而不健康的植株。微生物分离物以单菌株分离物形式接种，或与其他分离物组合接种。每种处理方式下共测试了15株无菌白菜，并在接种后立即、第4天或第10天进行采收。这些分离菌株在大白菜叶际中表现出快速生长。将两种酵母菌和三种细菌分别接种至由红甘蓝、青菜和大白菜制成的三种不同类型的无菌蔬菜提取物（SVE）中。通过将每种处理的5微升样品点种于MRS或YPD琼脂平板上，记录接种物在14天内的生长情况。在整个发酵过程中对pH值的测定显示，乳酸菌能够将SVE酸化至pH值低于4的水平，表明该发酵产物可安全食用。这些方法虽专门应用于大白菜微生物组，但也可适用于其他植物体系。保持系统无菌可能具有挑战性，我们所概述的实验方案虽已详尽，但发现每一步骤均至关重要。

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科研

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Environment

环境

植物圈和蔬菜发酵微生物群研究的侏儒生物系统

来源：Nathoo, N.，等．一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统．J. Vis. Exp.

一种用于研究植物宿主与互作细菌分子响应的共培养系统

所述的水培共培养系统利用金属网筛支撑完整植物，并与细菌进行共培养。随后可分别收集植物组织、细菌及分泌的分子，用于下游分析，同时可对植物宿主及其相互作用的微生物或微生物组的分子响应进行研究。...

一种用于植物/微生物分子互作与信号传导同步系统分析的水培共培养系统

本文详细描述了生态系统器件制造装置（EcoFABs）的构建方案，该装置可在高度受控的实验室条件下用于研究植物及其与微生物的相互作用。...

用于研究植物-微生物互作的实验室生态系统构建（EcoFAB）协议

本文介绍了一种获取土壤、根际和根内微生物组扩增子序列数据的实验方案。该信息可用于研究与植物相关的微生物群落的组成和多样性，适用于多种植物物种。...

探索根系微生物组：从土壤、根际和根内圈提取细菌群落数据

本文详细描述了从田间挖掘植物根系以及将样品处理为内生圈、根际和土壤的方法，包括DNA提取和数据分析方法。本文旨在使其他实验室能够采用这些技术来研究土壤、内生圈和根际微生物组。...

多年生草本植物实验中土壤、根际及根部微生物群落的分离与分析

本文介绍了一种水培植物生长检测方法，用于量化物种的存在并可视化细菌在植物根部初始定植期间以及转移到不同生长环境后的空间分布情况。...

监测细菌定植与维持 拟南芥 漂浮式水培系统中的根系

堆肥微宇宙实验将自然界中存在的微生物多样性引入实验室，以促进对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

堆肥微宇宙作为微生物组研究中微生物多样性高且接近自然环境的实验体系 秀丽隐杆线虫

我们介绍一种基于玻璃器皿的半水培实验系统，该系统可支持多种系统发育上不同的植物在有或无微生物条件下的生长。该系统适用于不同的生长培养基，并允许对根系分泌物进行非破坏性取样，用于后续分析。...

一种用于半水培根系分泌物分析的多功能玻璃罐系统

我们提出了一种优化的扫描电子显微镜实验方案，用于观察包含植物和真菌生物量以及微生物群和生物膜的高度异质且脆弱的样品。该方案可用于描述微生物群空间结构的维度特征。...

切叶蚁菌圃的微生物群落：通过扫描电子显微镜可视化微生物景观

本方案详细介绍了用于在厌氧条件下进行复杂粪便菌群连续流培养的微型生物反应器阵列的组装方法。我们还讨论了反应器的组装、接种以及取样方法，以便后续分析。...

复杂粪便菌群连续培养的生物反应器组装

了解无微生物大白菜培养方法，用于研究叶面微生物相互作用及蔬菜发酵过程中的群落动态变化。该技术为农业微生物生态学研究提供了可控实验模型。

用于研究叶际和蔬菜发酵中微生物组组装的无菌系统

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