为高浓度单分子显微镜制造零模式波导

这里介绍的用于制造零模波导的纳米球光刻协议是一种易于理解的低成本方法，不需要任何专门的制造工具或设施。该方法将适用于单分子生物物理学，并允许更多研究人员在生物学相关浓度的荧光试剂下进行单分子实验。为了为胶体颗粒的蒸发沉积创造一个干净的表面，将光学硼硅酸盐玻璃盖玻片放入 Coplin 玻璃染色罐的凹槽插件中。

在染色罐中加入足够的丙酮以覆盖盖玻片并盖住染色罐。在 40 摄氏度下对罐子进行 10 分钟的超声处理。倒出丙酮，用蒸馏水冲洗盖玻片 3 次。

重复超声处理和丙酮后，在罐子中加入足够的氢氧化钾以覆盖盖玻片。再次对罐子进行超声处理，盖上盖子，在 40 摄氏度下放置 20 分钟。用蒸馏水冲洗盖玻片 6 次，然后在 40 摄氏度下用乙醇超声处理 10 分钟。

用蒸馏水洗涤盖玻片 3 次后，用镊子轻轻地拿起边缘的每个盖玻片。用氮气干燥每个盖玻片，并放置每个干净、干燥的盖玻片及其自己的培养皿。离心 50 μL 的 1 微米非官能化聚苯乙烯珠子。

丢弃上清液，留下尽可能少的水。将珠子重悬于 50 μL 溶剂中，然后通过移液彻底混合。要设置用于沉积的湿度室，请将六个培养皿排成一排。

在每个培养皿中放置一个盖玻片，让盖子略微半开，盖玻片的位置要暴露在环境中。将湿度计和小电风扇放在培养皿后面，然后记录实验室中的相对湿度。在 200 毫升烧杯中加入 150 至 200 毫升水，温度约为 75 摄氏度，然后将烧杯放在风扇后面。

打开风扇，然后用翻转的透明塑料储存容器盖住培养皿、风扇、烧杯和湿度计。当相对湿度达到 70% 至 75% 时，轻轻提起塑料储存容器并迅速关闭培养皿的盖子，以防止盖玻片过度润湿。当腔室中的相对湿度达到 85% 时，将 5 微升微珠悬浮液移液到每个盖玻片的中心。

沉积后立即盖上每个培养皿，并在两次沉积之间将所有东西都盖在储存容器中。应尽快完成珠子沉积，以尽量减少湿度的损失。如果沉积物太干或太湿，则腔室湿度是需要优化的最重要变量。

当所有六次沉积完成后，记录腔室中的相对湿度，并让珠滴扩散并干燥 5 分钟。为了为聚苯乙烯珠的退火提供均匀的温度表面，将一块平坦的铣削铝板放在标准陶瓷热板的顶部，并将热板的温度设置为 107 摄氏度，即聚苯乙烯的玻璃化转变温度。将包含珠子模板的盖玻片放在热铝板上。

退火 20 秒后，从铝板上取下盖玻片，立即将其放在室温铝表面上冷却。使用热蒸发沉积，以每秒 2 埃的速度将 300 纳米的铜沉积在包含微珠模板的盖玻片上。这将在珠子之间的空隙中产生柱子。

要从珠子上去除多余的铜，请轻轻地将一条胶带压在表面上，然后慢慢撕下胶带。将盖玻片放入容许状中并放置过夜，溶解聚苯乙烯珠子。小心处理盖玻片，用氯仿冲洗一次，用乙醇冲洗两次。

用氮气干燥模板。将它们放入氧气等离子清洗剂中 30 分钟，以去除残留的聚合物和污染物。使用热蒸发沉积，以每秒 1 埃的速度沉积 3 纳米的钛粘附层，然后以每秒 4 埃的速度在铜柱周围和顶部沉积 100 到 150 纳米的铝。

确保样品在沉积过程中不会像某些沉积装置中自动所做的那样旋转。要溶解铜柱，请将盖玻片浸泡在铜蚀刻剂中 2 小时。用蒸馏水冲洗盖玻片后，用氮气擦干，然后用镜头纸轻轻擦拭表面，露出仍然覆盖在覆层中的任何柱子。

将盖玻片再浸泡在铜蚀刻剂中 2 小时，然后再次用蒸馏水冲洗并用氮气干燥。表面钝化后，可以使用双面胶带将零模式波导盖玻片与石英载玻片配对，以制造用于单分子成像的微流体流动室。胶体模板自组装的成功在很大程度上取决于相对湿度。

在格式正确的模板中，微珠区域是圆形的，其边界由不透明的多层环定义。在格式正确的模板中，大多数模板应包含六边形紧密排列的微珠。由于蒸发沉降过程中的堵塞，晶粒之间会有一些缺陷。

苯乙烯珠沉积铜和溶解后，铜柱的直径应低于 150 纳米。对于 300 纳米的铜沉积深度，焊柱高度约为 250 纳米。在铝包层沉积和随后的铜柱溶解后，波导应通过原子力显微镜可见，并且间隔约 550 纳米。

将聚苯乙烯模板退火 20 秒，产生直径为 118 纳米的铝波导，其尺寸足够小，足以切断可见光的传播。用于成像的 ZMW 的典型视野在 40 x 80 微米的视场中包含 3， 000 个波导。进行单分子 FRET 以测试 ZMW 功能。

在所有浓度的环境 Cy5 荧光团测试中均可检测到单分子 FRET 痕量。相比之下，单分子只能在皮摩尔到低纳摩尔浓度的 TERF 照明下检测到。在零模式波导制造之后，可以使用聚合物对器件进行钝化，以减少单分子成像过程中的非特异性相互作用。

零模式波导的玻璃底部也可以略微蚀刻，以增强单分子发射。总体而言，这种新的零模式波导制造方法将使研究人员能够更轻松地研究动态生化过程，例如以更接近细胞中的浓度和速率进行转录或翻译。