Name: 同时筛查1型糖尿病和多种自身免疫性疾病的高通量电化学发光7重检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: 了解电化学发光多重检测技术，用于同时筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病。该方法将七种自身抗体检测整合于单一孔中，实现高通量、低成本的大规模临床筛查，提高诊断效率。

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本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目DK32083，以及青少年糖尿病研究基金会（JDRF）资助项目2-SRA-2015-51-Q-R和2-SRA-2018-533-S-B支持。

本研究方案已获科罗拉多州多个机构审查委员会批准。
1. 缓冲液配制
<ol>
	<li>配制标记缓冲液（2x PBS，pH 7.9）。取400 mL去离子蒸馏水，加入100 mL 10x PBS。用NaOH调节溶液pH至7.9。</li>
	<li>将1 mg生物素溶解于溶液中，配制成3 mM生物素 588 &#181;L 先前配制的标记缓冲液。通过将150 nmol的Ru Sulfo-NHS溶解于缓冲液中制备3 mM的Ru Sulfo-NHS。 50 &#181;L 标记缓冲液的量。</li>
	<li>取500 mL 1×PBS，加入5 g牛血清白蛋白（BSA），配制抗原缓冲液（1% BSA）。配制0.5 M乙酸溶液。使用Trizma Base配制1 M Tris-HCl缓冲液，并将pH值调节至9.0。</li>
	<li>对于包被缓冲液（3% 封闭剂 A），取 500 mL 1x PBS 并加入 15 g 封闭剂 A。通过将 5000 mL 1x PBS 与 2.5 mL Tween 20 混合制备洗涤缓冲液（0.05% Tween 20，PBST）。通过加入 500 mL 去离子水和 500 mL 4x 含表面活性剂读取缓冲液制备读取缓冲液（2x 含表面活性剂读取缓冲液 T）。 
	注意：为了保持各检测之间的一致性，生物素和Ru Sulfo-NHS溶液必须在标记步骤前 freshly 配制，不得提前配制并储存以供后续使用。</li>
</ol>
2. 分别用生物素和Ru Sulfo-NHS标记每种抗原蛋白
注意：为了获得更有效的标记反应，请使用浓度≥0.5 mg/mL的抗原蛋白。
<ol>
	<li>计算每种抗原蛋白的摩尔数以及生物素和Ru Sulfo-NHS的摩尔数。根据抗原蛋白与生物素或Ru Sulfo-NHS的摩尔比，向抗原蛋白中加入适量的生物素或Ru Sulfo-NHS进行标记反应。
	<ol>
		<li>对于分子量较小（≤10 kDa）的抗原，如胰岛素原蛋白，使用1:5（抗原:生物素和Ru Sulfo-NHS）的摩尔比；对于分子量较大（&gt;50 kDa）的抗原，如GAD蛋白，使用1:20的摩尔比；对于分子量中等（10–50 kDa）的抗原，使用介于1:5至1:20之间的摩尔比进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于生物素和Ru Sulfo-NHS，将每种抗原的质量除以其相应的分子量，得到各自的抗原摩尔数；再将摩尔数除以浓度，计算出所需生物素的体积。对Ru Sulfo-NHS重复相同步骤。</li>
	<li>按照步骤2.2中确定的适当摩尔比，将抗原蛋白与生物素混合，然后对Ru Sulfo-NHS进行同样的操作。 
	注意：为了提高标记反应效率，缓冲体系中任何还原性化学物质（如Tris或甘氨酸）需通过尺寸排阻离心柱更换为2x PBS缓冲液（pH 7.9）。生物素和Ru Sulfo-NHS的标记方案完全相同。</li>
	<li>用铝箔包裹反应管，并在室温（RT）下孵育1小时。使用铝箔包裹的原因是生物素和Ru Sulfo-NHS试剂均对光敏感。</li>
	<li>在反应管孵育的同时，对2 mL或5 mL离心柱进行预处理（离心柱的规格由上样体积决定）。向离心柱中加入2x PBS缓冲液，每次以1,000 × g 离心2分钟，共重复三次。</li>
	<li>反应管孵育结束后终止标记反应。通过将标记后的抗原蛋白溶液一次性通过预处理过的离心柱进行纯化，从而终止反应，随后以1,000 × g 离心2分钟。</li>
	<li>通过将存在的抗原蛋白量除以最终体积，计算总的标记抗原浓度。将纯化后的标记抗原蛋白按每管50 µL分装，并于-80 °C长期保存。 
	注意：需注意的是，每次抗原蛋白通过离心柱时，回收率约为90–95%。</li>
</ol>
3. 确定检测中两种标记抗原的最佳浓度和比例（棋盘式滴定实验）
注意：由于本7重检测中的ECL-IAA检测需要对血清样本进行酸处理，因此每种抗原的棋盘式检测都必须在与标记抗原混合物孵育之前完成此步骤。
<ol>
	<li>在运行多重检测之前，需对每种抗原分别进行棋盘式滴定实验。步骤 3.2–3.6 以 GAD65 为例进行说明。</li>
	<li>计算标记的 GAD65 蛋白的稀释度。建议生物素标记的 GAD65 第一混合液的目标浓度为 2000 ng/mL，Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 为 1000 ng/mL。如果生物素标记和 Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 储存液浓度均为 1.0 µg/µL，则在 560 µL 工作液中所需生物素标记 GAD65 的体积为 1.12 µL，在 700 µL 工作液中所需 Ru Sulfo-NHS 标记 GAD65 的体积为 0.7 µL。</li>
	<li>在一个离心管中加入 1.12 µL 生物素标记的 GAD65 蛋白、240 µL 链霉亲和素偶联的连接子 1 和 160 µL 1% BSA，混匀。室温孵育 30 分钟。向管中加入 160 µL 终止液，再于室温孵育 30 分钟。</li>
	<li>进行系列稀释。取 280 µL 上述混合液加入新管，加入 280 µL 终止液，制成 1:2 稀释液。准备多个新管，重复此步骤，对生物素标记的 GAD65 抗原进行横向系列稀释（参见先前发表的研究12）。</li>
	<li>将 0.7 µL Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 蛋白（1 µg/µL）与 700 µL 终止液混合。取 350 µL 该混合液加入新管，加入 350 µL 终止液，制成 1:2 稀释液。准备多个新管，重复此步骤，对 Ru Sulfo-NHS 标记的 GAD65 抗原进行纵向系列稀释。</li>
	<li>准备两份血清样本，一份为 GADA 高度阳性，另一份为 GADA 阴性，每份体积为 0.75 mL。将 15 µL 阳性血清加入 96 孔 PCR 板左侧每一孔中，将 15 µL 阴性血清加入右侧每一孔中。</li>
	<li>向每孔中加入 18 µL 0.5 M 乙酸并混匀。室温孵育 45 分钟。准备一个新的 96 孔 PCR 板，根据系列稀释方案，向每孔中加入 17.5 µL 生物素标记抗原和 17.5 µL Ru Sulfo-NHS 标记抗原（参见先前发表的研究12）。</li>
	<li>继续执行步骤 5.2 至 9.1 中描述的其余检测步骤。</li>
	<li>计算强阳性样本信号与相应阴性样本信号的比值。通过确定阳性信号与阴性信号比值最高或接近最高的点，选择生物素标记抗原和 Ru Sulfo-NHS 标记抗原的最佳浓度。在计算该比值时，应考虑阴性样本产生的低背景信号。 
	注意：棋盘式滴定实验确定的 Ru Sulfo-NHS 和生物素标记抗原蛋白的最优浓度如下：GAD65 为 30 ng/mL 和 200 ng/mL，胰岛素原为 120 ng/mL 和 120 ng/mL，IA-2 为 10 ng/mL 和 42 ng/mL，TG 为 80 ng/mL 和 80 ng/mL，TPO 为 8 ng/mL 和 16 ng/mL，ThG 为 31 ng/mL 和 31 ng/mL，IFNα 为 12 ng/mL 和 12 ng/mL。</li>
</ol>
4. 配制混合连接剂偶联抗原溶液
<ol>
	<li>根据棋盘式实验确定每种抗原的最佳浓度。将生物素和Ru Sulfo-NHS标记的抗原稀释至合理的使用浓度。</li>
	<li>将不同的连接子分别与各特异性生物素标记的抗原蛋白结合。对于一个96孔板检测，将4 µL生物素标记的GAD65、TPO、tTG、ThG、胰岛素原、IFN-α和IA-2蛋白分别与240 µL链霉亲和素偶联的连接子1、2、3、4、8、9和10加入不同的离心管中（图1）。然后每管加入156 µL PBS/1% BSA。室温孵育30分钟。</li>
	<li>每管加入160 µL终止液，再于室温孵育30分钟。从每管中取400 µL连接子偶联的抗原，将全部7种抗原混合在一起。加入1.2 mL终止液，然后向混合液中加入4 µL Ru Sulfo-NHS标记的GAD65、TPO、tTG、ThG、胰岛素原、IFN-α和IA-2抗原。此时抗原溶液已准备好，可用于检测。</li>
</ol>
5. 将血清样本与标记的抗原孵育
注意：由于本7重检测中的ECL-IAA检测需要对血清样本进行酸处理，因此每份血清在与标记抗原混合物孵育前，均需先进行酸处理步骤。
<ol>
	<li>在96孔PCR板中，每孔分装15 µL血清。每孔加入18 µL 0.5 M乙酸，混匀。室温孵育45分钟。另取一个新的96孔PCR板，每孔分装35 µL抗原溶液。</li>
	<li>在板子孵育期间，向抗原板的每孔中加入13 µL 1 M Tris pH 9.0缓冲液。将缓冲液加至每孔侧壁，以减少Tris缓冲液与抗原的混合。孵育结束后，取25 µL酸处理后的血清，立即移入抗原板的每孔中。轻轻振荡混匀，并用PCR密封膜封板，避免光照。</li>
	<li>室温下将板子置于摇床上，低速振荡1小时。随后将板子置于4 °C，继续孵育18–24小时。</li>
</ol>
6. 准备多重检测板
<ol>
	<li>从 4 °C 冰箱中取出一块多重检测板，使其升至室温。当多重检测板达到室温后，向每孔加入 150 µL 3% 封闭剂 A。用密封膜覆盖多重检测板，在 4 °C 冰箱中孵育过夜。 
	注意：第 1 天实验步骤包括步骤 4 至步骤 6。</li>
</ol>
7. 将血清/抗原孵育液转移至多重检测板
<ol>
	<li>次日，将纸巾铺在实验台上，从冰箱中取出正在孵育的多重检测板。将板内所有缓冲液倒出。具体操作为：将板倒置，轻拍于准备好的纸巾上，直至各孔中无残留缓冲液。</li>
	<li>通过向每孔加入 150 µL PBST 对多重检测板进行洗涤。弃去缓冲液（如步骤 7.1 所述），重复此步骤三次。向多重检测板的每孔中加入 30 µL 血清/抗原孵育液。用铝箔覆盖该板，以减少光照暴露。将板置于平板摇床，室温下低速振荡孵育 1 小时。</li>
</ol>
8. 洗涤平板并加入读板缓冲液
<ol>
	<li>将多重检测板倒置，轻弹去除血清/抗原孵育液。向所有孔中加入150 µL PBST，再次将板倒置并轻弹去除洗涤液。重复此步骤三次。第三次洗涤完成后，向每孔中加入150 µL读取缓冲液。 
	注意：气泡会影响酶标仪准确分析结果，应尽可能避免。</li>
</ol>
9. 读取酶标板并分析数据
<ol>
	<li>使用酶标仪读取已准备好的反应板，读取所有以每秒计数（CPS）为单位的数值。</li>
	<li>根据酶标仪获得的抗体水平，使用以下公式计算检测的相对指数： 
	指数值 = [CPS（样本） - CPS（阴性标准品）] / [CPS（阳性标准品） - CPS（阴性标准品）]。</li>
	<li>根据已建立的临界值判断各抗体结果为阴性或阳性。 
	注：检测第2天包括步骤7至步骤9。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在多项针对1型糖尿病的国家级和国际级临床试验中，单重电化学发光（ECL）检测法在检测胰岛自身抗体以及乳糜泻相关的转谷氨酰胺酶自身抗体（TGA）方面的性能已得到充分验证8,9,10,11。在这些试验中，与现有的“金标准”放射性结合检测法（RBA）相比，该检测法在自身抗原检测方面的灵敏度和特异性均有所提高。在区分高亲和力、高风险胰岛自身抗体与低风险、低亲和力信号方面，单重ECL检测法相较于RBA展现出更高的疾病特异性14,15,16,17。在单重ECL检测法的基础上，我们提出了一种新型高通量多重ECL自身抗体检测方法，可同时实现对1型糖尿病及多种相关自身免疫性疾病的联合筛查。
多重ECL检测利用多重检测板，可将多达10种自身抗体检测合并至单个孔中。在本研究中，共合并了7种自身抗体检测。这些自身抗体包括3种胰岛自身抗体（IAA、GADA和IA-2A）、2种自身免疫性甲状腺疾病自身抗体（TPOA和ThGA）、乳糜泻自身抗体（TGA），以及针对干扰素α的APS-1自身抗体（IFNαA）。该检测的基本原理总体上基于此前已发表的单重ECL检测方法9,10,12,18，并进行了部分改进。多重ECL检测与单重ECL检测的主要区别在于，在液相中形成的每种抗体-抗原复合物会通过特定的连接系统被固定在孔内的特定位置（图1）。生物素标记的抗原与链霉亲和素偶联物（一种用于形成特定抗原-连接物复合物的连接物）共同孵育。在与患者血清孵育后形成抗体-抗原免疫复合物，并通过多重板各孔中的特异性连接系统被捕获至特定位置。同时，由抗体捕获的Ru Sulfo-NHS标记抗原产生电化学发光信号。酶标仪可从每个孔内的不同信号源位置检测多达10种不同的信号。为了在不同检测板之间以及长期研究过程中保持自身抗体检测的一致性，我们建议使用相同的连接物。
在建立多重电化学发光（ECL）检测方法之前，需先分别将每种自身抗体的单重ECL检测优化至多重检测板上，并使用常规ECL板上的放射性结合检测（RBA）和单重ECL检测进行验证。为了优化棋盘式滴定实验，在多重检测板上针对相应的自身抗体检测，分别使用了强阳性患者样本和阴性患者样本。在完成棋盘式滴定实验后，计算出7种自身抗体检测中每种检测对应的Ru Sulfo-NHS和生物素标记抗原的最佳浓度：GAD65为30 ng/mL和200 ng/mL，胰岛素原为120 ng/mL和120 ng/mL，IA-2为10 ng/mL和42 ng/mL，TG为80 ng/mL和80 ng/mL，TPO为8 ng/mL和16 ng/mL，ThG为31 ng/mL和31 ng/mL，IFNα13分别为12 ng/mL和12 ng/mL。在将所有检测合并为完整的多重检测后，根据实际检测结果，部分抗原在棋盘式滴定实验中确定的浓度可能需要进一步调整。
由于本研究中的多重 ECL 检测包含了 IAA，因此在将血清样本与抗原孵育之前，必须对血清样本进行酸处理，如先前研究所述12。通常情况下，当向多重检测中添加额外的自身抗体时，检测背景会受到影响，某一检测点产生的极高信号可能会通过串扰干扰同一孔中邻近检测点的结果。因此，对于信号最强的阳性样本，每种自身抗体的最大 CPS 需限制在 20,000 计数或更低。根据我们的经验，为了减少串扰的影响，在设计点阵图时，应将背景信号较低的自身抗体检测点与计数频率较高的检测点相隔较远。
每次实验均使用高阳性与阴性对照，以准确计算待测样本的指数。为准确评估和监测实验的灵敏度，还使用了接近实验上限的低阳性对照。这些标准的阳性和阴性对照被大量制备后分装，长期保存于 -20 °C 或更低温度下，以确保不同实验间的一致性。出于质量控制目的，每个样本在每次实验中均重复检测两次，且所有阳性结果均需在次日通过新的电化学发光实验重新检测并确认。若首次实验与第二次确认实验结果不一致，则需进行第三次实验。在三次实验中，以两次结果一致（例如，+，+ 或 -，-）的结果作为样本的最终结果（阳性或阴性）。
近十年来，许多研究团队一直在寻求一种高通量的检测方法，利用多重技术将多种自身抗体检测整合到一个孔中，以实现对大规模人群的筛查。已有少数研究采用不同技术平台开展多重自身抗体检测19,20,21,22，但在研究1型糖尿病（T1D）时，这些检测方法均未与当前的“金标准”放射性结合检测法（RBA）在敏感性和特异性方面进行过比较。这些不同的检测平台尚未通过国际胰岛自身抗体标准化项目（IASP）研讨会验证，也未在大规模临床试验队列中得到验证。在德国最近一项基于普通人群的筛查中，正在使用Kronus公司提供的高通量联合检测试剂盒3 Screen ICATM ELISA作为一线筛查工具，用于检测三种胰岛自身抗体（GADA、IA-2A和ZnT8A），以实现儿童T1D的早期诊断23。3-Screen ELISA检测可在三个独立孔中分别检测三种自身抗体，但会消耗大量血清；也可在单个孔中混合进行三项检测。若3-Screen ELISA检测中某一孔结果为阳性，则无法区分是哪一种自身抗体呈阳性。该检测最大的缺点是无法包含对IAA的检测。所有基于ELISA方法检测IAA的结果，如IASP研讨会所证实，均缺乏可接受的敏感性和特异性24。IAA通常是最早出现的胰岛自身抗体，在年幼儿童中具有很高的阳性率。对于儿童而言，包含IAA的自身抗体筛查是必要的，若不检测IAA，则不能被接受作为社区中评估T1D风险的筛查手段。此外，目前尚无已发表的研究或数据表明Kronus公司的胰岛自身抗体试剂盒在T1D疾病特异性方面更优，或能够有效区分高风险与低风险的自身抗体。本研究中的7重ECL检测已使用大量新确诊T1D患者队列进行了验证13。与当前标准RBA及成熟的单重ECL检测相比，7重ECL检测能够保持100%的阳性检出率，同时具有相同的检测特异性（表4）。目前，4重ECL检测正与标准RBA平行应用于一项正在进行的大规模临床试验：儿童自身免疫筛查（ASK）研究。该试验对美国丹佛大都会区普通人群中的儿童进行T1D和乳糜泻的筛查。与ASK研究中使用的标准RBA相比，多重ECL检测显示出优异的敏感性和更高的疾病特异性，结果与我们此前使用单重ECL检测的研究报告一致25。此外，与相应的4种单重ECL和RBA检测相比，我们的4重ECL检测在人力、成本和血清用量方面均显著降低了70%。通过使用多重ECL检测，我们可以根据特定临床需求，定制每个孔中包含的不同数量的检测项目（最多可达10项），以检测与特定临床场景相关的不同自身免疫性疾病。
在本研究中观察到，使用多重孔板的多重电化学发光（ECL）检测方法存在一些局限性。血清与抗原孵育后的最终稀释度无法针对单孔中组合的每种自身抗体检测均调整至最优条件。在1型糖尿病（T1D）患者中，有9份样本（9/1026）在特定自身抗体检测中出现假阴性结果。在7重ECL检测中，这7例假阴性中有7例为甲状腺过氧化物酶自身抗体（TPOA），2例为甲状腺球蛋白自身抗体（ThGA），但在单重ECL检测和放射性结合检测（RBA）中均显示强阳性结果（图2 &amp;#38; 3）。对这9份样本进一步稀释后，在多重孔板上检测转为阳性。该现象由我们称为“前带效应”（prozone）所致，即因抗体滴度过高而影响抗原-抗体晶格结构的形成，从而导致样本呈现假阴性结果。在建立多重检测时，建议对每种组合的自身抗体中具有极高滴度的样本预先进行预实验，以确定抗原孵育时血清的最佳稀释比例。或者，应选择具有相似最优化条件的自身抗体检测组合，以实现每种自身抗体检测的最佳灵敏度和特异性。在本研究中，来自健康对照者的7份样本（7/1022）在7重ECL检测中表现为多种自身抗体的假阳性，但在进行单重ECL检测和RBA检测后（图2 &amp;#38; 3），这些自身抗体在两种检测中均被确认为阴性。目前尚不清楚在多重孔板上出现此类假阳性结果的具体原因。针对当前多重ECL检测的应用，所有阳性样本均需通过相应的单重ECL检测重复验证以确认阳性结果，从而消除多重ECL检测中的假阳性误差。

1型糖尿病（T1D）是一种严重的慢性疾病，多见于儿童时期。目前，美国约有140万人患有T1D；值得注意的是，全球范围内T1D的发病率正以每年3-5%的速度持续上升，在过去二十年中已翻倍，尤其在幼儿中更为显著1,2。血液循环中的胰岛自身抗体（IAbs）是目前最可靠的生物标志物。这些自身抗体可能在临床T1D发病前数年就已出现3。目前，广泛用于T1D诊断和风险筛查的四种主要IAbs包括：抗胰岛素自身抗体（IAA）、抗谷氨酸脱羧酶-65自身抗体（GADA）、抗胰岛瘤相关抗原-2自身抗体（IA-2A）以及抗锌转运蛋白-8自身抗体（ZnT8A）。这四种IAbs在预测T1D发生方面具有同等重要性。最近，T1D的分类已被重新定义：在血糖代谢正常的情况下，若存在上述4种IAbs中的至少2种，即为疾病1期4。
在青少年糖尿病自身免疫研究（DAISY）中发现，每四位有T1D风险的儿童中就有一位可能进展为胰岛、乳糜泻、甲状腺或类风湿自身免疫；更引人注目的是，约40%已被诊断为T1D的患者最终会发展出另一种自身免疫性疾病5,6,7. 自身抗体的鉴定对于这些自身免疫性疾病的预测和诊断至关重要，应能为患者提供更佳的临床诊疗。目前尚无简便且经济的方法用于筛查这些多种自身免疫性疾病。现有的筛查方法采用标准放射性结合试验（RBA），每次仅检测单一自身抗体，对于大规模筛查而言操作繁琐且效率低下。
本文将介绍一种新开发的简易多重电化学发光（ECL）检测方法，该方法已在单重ECL检测平台的基础上进行了验证8,9,10,11。该多重ECL检测法仅需15 µL血清，即可在单个孔中同时完成7种自身抗体的检测，能够同步筛查1型糖尿病（T1D）以及多种相关自身免疫性疾病，包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和APS-1。由于在本研究进行时尚未建立ZnT8A的ECL检测方法，因此该抗体未被纳入多重检测体系。该多重ECL检测法为在普通人群中大规模筛查T1D及多种自身免疫性疾病提供了高效且可靠的工具。

<table><tbody><tr><td>4 &amp;deg;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;ndash;80 &amp;deg;C 和 -20 &amp;deg;C 冰箱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔板摇床</td><td>Wallac - Delfi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔圆底板</td><td>Fisher</td><td>8408220</td><td></td></tr><tr><td>乙酸溶液</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗原蛋白</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>人GAD65全长蛋白</td><td>Diamyd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人甲状腺球蛋白全长蛋白</td><td>BioMart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>人甲状腺过氧化物酶全长蛋白</td><td>BioMart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IA-2 胞内结构域蛋白</td><td>BioMart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN-&amp;alpha; 蛋白</td><td>Abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰岛素原蛋白</td><td>AmideBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tTG 蛋白</td><td>DiaRect</td><td></td><td></td></tr><tr><td>生物素</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>500 mL 瓶顶滤器单元</td><td>Fisher</td><td>0974064A 或 B</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A-7906</td><td></td></tr><tr><td>去离子蒸馏水（DD 水）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>制冰机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>冰盒</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD 赛道</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>纸塔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH计</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette-Aid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>移液器/吸头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ru Sulfo-NHS</td><td>MSD (R91AN)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Fisher</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>Uplex 开发套件</td><td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔UPlex板</td><td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>阻断剂 A</td><td>MSD</td><td>R93AA</td><td></td></tr><tr><td>连接素-链霉亲和素</td><td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>读取缓冲液</td><td>MSD</td><td>R92TC</td><td></td></tr><tr><td>终止液</td><td>MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZeBa 柱</td><td>Pierce</td><td>89892</td><td></td></tr></tbody></table>

一种高通量电化学发光7重联检方法同步筛查1型糖尿病及多种自身免疫性疾病

A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

胰岛自身抗体（IAbs）广泛应用于1型糖尿病（T1D）的诊断与预测。针对胰岛素（IAA）、谷氨酸脱羧酶-65（GADA）、胰岛瘤抗原-2（IA-2A）和锌转运蛋白-8（ZnT8A）的四种主要IAbs在疾病预测中具有同等重要性。目前，高达40%被诊断为T1D的患者后续会发展出其他自身免疫性疾病。然而，现有的筛查方法通常仅检测单一自身抗体，操作繁琐，难以适用于大规模筛查研究。我们近期开发了一种简便的多重电化学发光（ECL）检测方法，以解决上述问题。该检测方法将全部7种自身抗体检测整合至一个孔中。每个孔包含三种IAbs（IAA、GADA和IA-2A），以及用于检测自身免疫性甲状腺疾病的甲状腺过氧化物酶抗体（TPOA）和甲状腺球蛋白抗体（ThGA）、用于乳糜泻的组织转谷氨酰胺酶抗体（TGA）和用于自身免疫性多腺体综合征-1（APS-1）的干扰素α抗体（IFNαA）；从而可同时筛查T1D及其他相关自身免疫性疾病。该多重ECL检测基于单重ECL检测平台，但采用多重检测板，可将多达10种自身抗体检测整合至单个孔中。与单重ECL检测的主要区别在于，液体相中形成的每种抗体-抗原复合物通过多重板上的连接系统被固定在孔内的特定位置。本研究中的7重ECL检测使用大量新确诊T1D患者及年龄匹配的健康对照者样本，与标准放射性结合检测（RBA）和单重ECL检测进行比对验证，表现出优异的检测灵敏度和特异性。

我们建立了一种简单的多重电化学发光（ECL）检测方法，可将7种自身抗体检测整合在一起。该检测能够同时筛查1型糖尿病（T1D）以及多种其他自身免疫性疾病，包括乳糜泻、自身免疫性甲状腺疾病和自身免疫性多腺体综合征1型。

胰岛自身抗体（IAbs）广泛用于1型糖尿病（T1D）的诊断和预测。针对胰岛素（IAA）、谷氨酸脱羧酶-65（GADA）、胰岛瘤抗原-2（IA-2A）和锌转运蛋白-8（ZnT8A）的四种主要IAbs在疾病预测中具有同等重要性。目前，多达40%被诊断为T1D的患者后续会发展为其他自身免疫性疾病。然而，现有的筛查方法通常仅检测单一自身抗体，对于大规模筛查研究而言费时且效率低下。我们近期开发了一种简便的多重电化学发光（ECL）检测法，以解决上述问题。该检测法将全部7种自身抗体检测整合于一个孔中。每个孔包含三种IAbs（IAA、GADA和IA-2A），以及用于检测自身免疫性甲状腺疾病的甲状腺过氧化物酶自身抗体（TPOA）和甲状腺球蛋白自身抗体（ThGA），用于乳糜泻的组织转谷氨酰胺酶自身抗体（TGA），以及用于自身免疫性多腺体综合征-1（APS-1）的干扰素α自身抗体（IFNαA）；从而可同时筛查T1D及其他相关自身免疫性疾病。该多重ECL检测基于单一ECL检测平台，但采用多重检测板，可将多达10种自身抗体检测整合于单个孔中。与单一ECL检测的主要区别在于，液体相中形成的每种抗体-抗原复合物通过多重板上的连接系统被固定于孔内特定位置。本研究中的7重ECL检测已在大量新确诊T1D患者和年龄匹配的健康对照人群中，与标准放射性结合检测（RBA）和单一ECL检测进行了验证，结果显示该检测具有优异的灵敏度和特异性。

电化学发光法可同时筛查1型糖尿病及其他相关自身免疫性疾病，包括自身免疫性甲状腺疾病、乳糜泻和自身免疫性多腺体综合征-1。这种更为复杂的多联电化学发光（ECR）检测方法将多达10种不同的自身抗体检测整合于单个孔中，从而实现高通量、更少的试剂消耗、更低的成本，并且所需样本体积更小。本实验操作将由我实验室的博士后贾晓凡（Xiaofan Jia）进行演示。为制备混合连接子偶联抗原溶液，首先根据棋盘式实验确定每种抗原的最佳浓度，并将生物素和钌标记的抗原稀释至合理的使用浓度。为将不同的连接子结合至各自特异的生物素化抗原，对于一个96孔板检测，将240微升适当浓度的链霉亲和素偶联连接子与4微升目标生物素化蛋白混合。然后每管加入156微升1% BSA溶液，在室温下孵育30分钟。孵育结束后，向每根试管中加入160微升终止液，并在室温下继续孵育30分钟。孵育结束后，从每根试管中取出400微升与连接剂偶联的抗原，将全部七种抗原悬浮液合并至同一根试管中。然后，向该混合物中加入1.2毫升终止液以及4微升Ru sulfo-NHS标记的GAD65、TPO、tTg、ThG、胰岛素原、干扰素-α和IA-2抗原。在将血清样本与标记的抗原混合物孵育之前，向96孔PCR板的每孔中加入15微升血清，并向每孔血清中加入18微升0.5摩尔的乙酸，在室温下孵育45分钟。孵育期间，向一个新的96孔PCR板的每孔中加入35微升抗原和13微升1摩尔Tris缓冲液。孵育结束后，立即将25微升经酸处理的血清转移至抗原板的每孔中。用 PCR 封板膜覆盖板孔，并将板置于室温下低速摇床上孵育一小时。孵育结束后，将板置于 4 摄氏度环境中 18 至 24 小时。从冰箱中取出板，使其恢复至室温。然后向每个孔中加入150微升3%封闭液A缓冲液。所有孔处理完毕后，用封板膜覆盖酶标板，并将酶标板置于4摄氏度冰箱中过夜。次日早晨，将酶标板倒置，每孔每次用150微升PBS-T缓冲液洗涤三次。轻拍酶标板，直至各孔中无缓冲液残留。每孔加入 30 微升血清抗原孵育液。待所有孵育液加完后，用铝箔覆盖酶标板，并于室温下低速振荡孵育一小时。孵育结束后，通过轻弹去除孵育液，并用每孔150 µL的PBS-T洗涤各孔三次，操作如图所示。最后一次洗涤后，向每孔加入150 µL读数缓冲液，并在酶标仪上以每秒计数读取结果。在本研究中，对来自1026例新确诊1型糖尿病患者的大量样本进行了分析，将七重电化学发光检测法测得的自身抗体水平与各对应的已建立的单重电化学发光检测法、单重标准放射性结合检测法及ELISA测得的水平进行了比较。除甲状腺自身抗体采用第95百分位外，其余所有自身抗体检测的特异性均在第99百分位时完全相同。在每种检测的临界值附近，发现每种自身抗体均有少量结果不一致的样本。此处可观察到每项检测对应的1022名健康对照者的数据。最重要的是要为每种独特生物素标记的抗原找到不同的连接子，并将每种抗原与具有共轭连接子特性的物质混合。该检测技术将使研究人员能够在大规模人群中同时规划多种自身免疫性疾病的筛查，并使临床机构能够方便地对与1型糖尿病相关的多种疾病进行筛查。

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