A High-Throughput Electrochemiluminescence 7-Plex Assay Simultaneously Screening for Type 1 Diabetes and Multiple Autoimmune Diseases

电化学发光测定可以同时筛查 1 型糖尿病和其他相关的自身免疫性疾病，包括自身免疫性冷冻疾病、乳糜泻和自身免疫性多腺综合征-1。非常复杂的 ECR 检测在单个孔中结合了多达 10 种多种抗体检测，可实现高通量、更少的文库和更便宜的检测，需要的体积更少。演示该程序的是 Xiaofan Jia，这是我实验室的一篇博文。

要制备混合接头偶联抗原溶液，首先根据棋盘格测定为每种抗原选择最佳浓度，然后将生物素和钌标记的抗原稀释至合理的工作浓度。为了将不同的接头与每种独特的生物素化抗原结合，对于一项 96 孔 play 测定，将 240 μL 适当的链霉亲和素偶联接头与 4 μL 目标生物素化蛋白混合。然后每管加入 156 微升 1% BSA，并在室温下孵育混合物 30 分钟。

孵育结束时，向每管中加入 160 μL 终止液，并在室温下再孵育 30 分钟。孵育结束时，从每管中取出 400 μL 接头偶联抗原，并将所有 7 种抗原悬液拉入一根管中。然后，向混合物中加入 1.2 毫升终止液和 4 微升 Ru sulfo-NHS 标记的 GAD65、TPO、tTg、ThG、胰岛素干扰素-α 和 IA-2 抗原。

在将血清样品与标记的抗原混合物一起孵育之前，在 96 孔 PCR 板的每孔中加入 15 μL 血清，并将 18 μL 0.5 摩尔酸性酸与每孔血清混合，在室温下孵育 45 分钟。在孵育过程中，在新的 96 孔 PCR 板的每孔中加入 35 μL 抗原和 13 μL 1 摩尔 Tris 缓冲液。孵育结束时，立即将 25 μL 经酸处理的血清转移到抗原板的每个孔中。

用 PCR 吊膜盖住板，并将板在室温下低速放在摇床上 1 小时。孵育结束时，将板置于 4 摄氏度下 18 至 24 小时。将板子从冰箱中取出，让它达到室温。

然后向每个孔中加入 150 微升 3% 阻断剂 A 缓冲液。处理完所有孔后，用天花板箔覆盖板，并将板放入 4 摄氏度的冰箱中过夜。第二天早上，将板倒置，用每孔 150 微升 PBS-T 洗涤样品 3 次，每次洗涤。

轻拍板，直到任何孔中没有缓冲液。向每个孔中加入 30 μL 血清抗原孵育液。加入所有孵育液后，用箔纸盖住板，并将板在室温下以低速放在摇床上 1 小时。

在孵育结束时，轻弹除去孵育物，并用每孔 150 微升 PBS-T 洗涤孔 3 次，如图所示。最后一次洗涤后，向每个孔中加入 150 μL 读数缓冲液，并在读板器上以每秒计数读取板。在对来自 1026 名新诊断的 1 型糖尿病患者的大量样本的分析中，将来自 7 加电发光测定的自身抗体水平与来自每个相应的已建立的单一电致发光测定和每个相应的单一标准放射性结合测定和 ELISA 的水平进行了比较。

所有自身抗体检测的第 99 个百分位数的检测特异性相同，但甲状腺自身抗体除外，该抗体使用第 95 个百分位数。在每次测定的临界值边界附近发现了 7 种自身抗体中每一种的少量不一致样品。在这里，可以观察到每个测定的 1022 个健康对照的相应数据。

要记住的最重要的事情是为每个独特的生物素化抗原找到不同的接头，并将每个抗原与特性混合以提供偶联接头。这种检测技术将使研究人员能够计划在大规模人群中同时筛查多种自身免疫性疾病，并使诊所能够轻松筛查多种与 1 型糖尿病相关的疾病。