Name: 使用声学分离器对CHO收获的细胞培养液进行初步澄清 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 了解如何使用声波分离器对CHO细胞培养液进行初步澄清。该方法占地面积小、污染风险低，适用于连续生物加工流程，可提高下游过滤和层析效率。

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作者谨此感谢Nilou Sarah Arden和Zhong Zhao对本文手稿提出的建设性评审意见。作者还要感谢Lindsey Brown在本项目期间提供的关键性意见。本研究工作部分得到了CDER关键路径计划（CA #1-13）以及CDER制造科学与创新卓越中心计划（Berilla-CoE-19-49）的内部资金支持。本项目还部分得到了美国食品药品监督管理局生物技术产品办公室实习/研究参与计划的支持，该计划由橡树岭科学与教育研究所通过美国能源部与FDA之间的机构间协议进行管理。
本文内容仅代表作者观点，不应被理解为代表美国食品药品监督管理局（FDA）的观点或政策。

1. AWS 的制备
注意：本实验方案使用一个声泳室进行开发。然而， bench-scale AWS 配备五个浊度探头，可根据需要串联运行四个声泳室。
<ol>
	<li>将浊度电缆连接至标有 F、1、2、3、4 的相应端口（例如，1 号浊度探头接入 图1c 和端口1在 图 2a）并将腔室电源BNC电缆连接到AWS系统背面标有1、2、3、4的接口（图2b). 
	注意：请勿连接腔室电源BNC电缆的另一端（图3c)至声泳室的背面图3d）直到第 2.6 步腔室充满液体为止。如果在腔室无液体的情况下开启腔室电源，将损坏腔室内的压电换能器，导致其无法继续使用。</li>
	<li>将浊度探头插入浊度计和温度计套管中，并拧紧螺丝（图1c 和 图3).</li>
	<li>将进料管路连接至进料浊度端口的入口图4a）通过进料泵（图1b 到 1c).</li>
	<li>将 Y 型管从进料浊度端口的输出端连接图4b)至声泳室的入口端口（图 4c).</li>
	<li>将一级管路连接至声泳分离室废液口的图 4d）通过第一级泵输送至细胞收集容器（图1d 通过 1e 到 1f).</li>
	<li>将管道从声泳室的渗透出口连接图 4e) 至探头1浊度端口的输入端图4f).</li>
	<li>将采样管从探头1的浊度端口引出并连接图4g) 转移至产物收集容器（图1c 至 1g).</li>
</ol>
2. 使用 HCCF 预处理系统
注意：本方案采用在化学成分确定的培养基（ActiCHO P 加 6 mM L-谷氨酰胺）中培养的 CHO-K1 细胞开发，用于生产模型 IgG1 单克隆抗体 VRC0113，对于其他细胞系和产物可能需要进行相应调整。本方案所用的收获细胞培养液（HCCF）来自摇瓶或生物反应器培养 CHO-K1 细胞 7–8 天结束时的培养物。
<ol>
	<li>通过打开 AWS 背面和前面的电源开关来启动 AWS。</li>
	<li>启动计算机，然后双击与相关软件对应的桌面图标（参见 材料表）。在“读数”面板中，点击“开始测试”按钮以开始数据记录（图 5）。一旦开始数据记录，所有采集的数据将持续记录在一个可导出的电子表格中，直至测试停止。</li>
	<li>将进料管路的一端连接至正在搅拌的 HCCF 容器中。</li>
	<li>在“进料泵图像”界面内的“控制”屏幕上输入泵速，然后按键盘上的“回车”键以启动进料泵。确保在进料泵图像右侧的灰色框中正确选择“泵转向箭头图标”（顺时针或逆时针），以将 HCCF 从容器泵入声泳分离室。点击进料泵图像下方灰色框中“开启”文字旁的“三角形图标”以“启动”泵（图 6a）。 
	注意：泵的最大流速为 10 L/h（167 mL/min），但建议在本步骤中使用标称流速 60 mL/min，以便快速填充管路和腔室，同时避免在分离开始前腔室过满。</li>
	<li>在声泳分离室填充过程中，通过观察“浊度降低百分比面板”（图 5c）来监测进料浊度测量值。如果 HCCF 在 HCCF 容器中充分混合，则在腔室加载过程中浊度值将保持稳定。</li>
	<li>当液体液面升至声泳分离室后部的压电换能器上方时，点击进料泵图像下方灰色框中的“关闭”以停止泵运行。将 BNC 电源线缆（图 3c）连接至声泳分离室（图 3d）。 
	注意：每个声泳分离室的持液量约为 190 mL。</li>
</ol>
3. AWS 的操作
<ol>
	<li>当声泳分离室已充满且 BNC 电源线已连接到声泳分离室背面时，将进料泵的流速调整至所需的运行速率（图6a 和 Table 1）。应测试多个进料泵流速，以确定特定工艺的理想操作参数。</li>
	<li>通过将功率模块中的滑块移至 10 W（图6d），并点击 Stage 1 模块右侧的“开启”图标（图6c），启动 Stage 1 压电电源。根据制造商建议，使用 10 W 这一推荐功率设置用于 CHO 细胞。这将产生 2 MHz 的固定频率进行操作。数秒后，细胞将在声泳分离室的波节处明显聚集（图7a）。</li>
	<li>当细胞开始沉降至声泳分离室底部时（图7b），根据细胞密度和进料泵流速设定适当的 Stage 1 泵流速（图6b）。根据制造商提供的优化方案和稳态操作电子表格，可通过以下公式，结合细胞压实质量百分比和进料流速，计算 Stage 1 泵流速： 
	<img alt="使用进料泵流速和细胞压实质量计算 Stage 1 泵流速的公式。" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1">
	<ol>
		<li>为计算细胞压实质量，先将空的 15 mL 离心管（或其他适用于离心的管）置于天平上归零。将进料液加入管中，记录管与进料液的总重量。以 3,700 × g 离心 10 分钟。将上清液倾入另一容器中。称量含有细胞沉淀的管的重量。进料液的细胞压实质量百分比 =（倾析后管重 / 加料后管重）× 100%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当声泳分离室的溢流进入浊度探头1时，监测 Stage 1 浊度的浊度变化曲线（图8）。</li>
	<li>随着细胞分离过程的持续，细胞去除效率 <img alt="浊度降低，公式，方程，水处理，效率计算，科学分析。" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 将逐渐提高。</li>
	<li>此外，监测进料液与 Stage 1 之间的温差，该温差将随细胞分离的持续而升高（图9）。当使用较高细胞密度的进料液时，温度可能上升，但通常可通过调节进料流速来降低。 
	注意：当使用多个声泳分离室时，可依次通过浊度探头将前一个声泳分离室的管路连接至当前声泳分离室的入口。此外，可通过 Stage 泵将声泳分离室底部的管路连接至细胞收集容器。如有需要，最多可串联四个声泳分离室，以实现最佳的细胞去除效率。</li>
</ol>
4. 结束戒断症状
<ol>
	<li>运行结束后，分别点击进料泵和一级泵图像下方灰色框内的关闭按钮，停止进料泵和一级泵的运行。</li>
	<li>通过点击一级模块右侧的关闭按钮，关闭腔室电源，并拔下BNC电源线。</li>
	<li>收集产物收获液，用于后续澄清和纯化操作，如深层过滤和层析方法。废弃细胞收获液。</li>
	<li>将废液管放入空容器中，从声泳分离腔的进样口和透过口断开管路，并将废液管从泵头中取出，排空腔内残留液体。</li>
	<li>重新连接管路，将废液管放回泵头，使用进料泵以60 mL/min的流速、一级泵以60 mL/min的流速，从进料管末端泵入去离子水（DI水），持续15–20分钟。废弃透过液。</li>
	<li>使用进料泵将70%异丙醇（IPA）泵入管路和腔室，持续15–20分钟。废弃透过液。</li>
	<li>重复使用去离子水（DI水）清洗管路和腔室，通过进料泵运行15–20分钟。废弃透过液。</li>
	<li>拆下浊度探针和声泳分离腔的管路，使用70%异丙醇清洁相关区域。</li>
	<li>拆下浊度探针，用70%异丙醇清洗探针内部。让所有部件自然风干，然后重新组装以备下次使用。 
	注：声泳分离腔设计为一次性使用，但如果按照本方案所述正确操作和清洗，可重复使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者对本文所述产品无任何经济利益，亦无其他事项需要披露。

本文描述了一种在CHO细胞系的HCCF中对模型单克隆抗体进行初级澄清时，实施台式规模交替式切向流过滤（AWS）的逐步操作方案。如代表性结果所示，在初级澄清中使用AWS可有效实现细胞去除和产物回收。此外，由于其维护和操作要求较低，并具备可放大性，因此在初级澄清中具有更广泛的应用潜力。
重要的是，代表性结果表明，进料泵速率对于细胞分离至关重要。此外，由于浊度测量在检测高细胞密度时存在局限性，因此工作细胞密度是在使用 AWS 系统时需要考虑的另一个因素。当进料物料的细胞密度较高时，浊度探针可能会达到饱和，因此，通过离线测量进料物料和澄清后细胞培养液的细胞密度来计算细胞分离效率可能是更佳的方法。通过准确的离线澄清度测量，一种可考虑用于解决这些问题的工艺策略是串联使用多个腔室。尽管本方案主要聚焦于单个腔室的使用，但该系统还可运行三个额外的腔室，以实现细胞的逐级澄清，从而对细胞状态的影响最小，并实现高产物回收率。此外，其他参数，如 AWS 的功率和细胞去除流速，也可针对特定细胞类型或操作模式进一步优化。总体而言，在实施 AWS 之前，建议基于上述因素对操作参数和策略进行优化。
在众多应用潜力中，交替切向流过滤（AWS）在连续生物工艺中的应用前景广阔。由于AWS可替代离心操作，并显著减少过滤所需的膜面积14，其应用将能够为后续的过滤和层析工艺持续提供无细胞的料液，从而与连续生物制造过程相兼容。鉴于这种兼容性，以及灌流技术在高细胞密度（例如，&#62;50 × 106 个细胞/mL）和长周期培养（例如，&#62;14 天）方面的成熟应用，AWS除了可用于主要的澄清步骤外，还具备开发新型连续细胞排液策略的潜力。
在某些情况下，稳态操作期间，细胞排放物中可能损失高达30%的治疗性蛋白15,16。此外，若要将排放物中去除的单克隆抗体与常规收获物料合并，必须满足特定的质量属性要求。当这些标准未被满足时，可能导致物料被拒收，从而影响产品收率。为弥补此类产品损失，可在长期灌流过程中稳态条件下，采用AWS对细胞排放物进行连续澄清17。该策略可减少排放物中的产品损失，提高所产蛋白的利用率。此外，经过AWS连续澄清后的细胞可根据需要重新回输至生物反应器，以实现更高的细胞密度和生产效率。因此，在特定工艺中，采用AWS对细胞排放物进行连续澄清可能有助于提高收率和/或减少二级过滤膜面积。
总之，AWS 的用途不仅限于简单的初级澄清，还可应用于连续生物加工，有望提高生产速率和操作灵活性。

在涉及分泌型治疗性蛋白的生物制造过程中，一个关键步骤是从收获的细胞培养液（HCCF）中去除生物量。传统上，生物制药企业生产单克隆抗体时，主要采用离心法结合深层过滤作为初级澄清方法1。然而，离心过程可能对细胞产生较高的剪切应力，导致HCCF中细胞碎片增加。这可能导致过滤过程中滤膜污染，并在过滤后引入额外的污染物，进而降低下游色谱纯化的效率1,2,3。此外，针对特定工艺定制离心设备可能成本较高，且可能需要额外连接在线清洗（CIP）和在线灭菌（SIP）系统，这在一定程度上限制了工艺的可放大性。使用深层过滤器可在一定程度上弥补离心法的局限性，并可利用一次性技术的优势4。然而，深层过滤器主要用于二级澄清，因其无法耐受高密度的细胞培养液5。另一种替代方案是采用切向流过滤（TFF）细胞截留装置以减轻剪切应力，但可能面临膜极化和收获率低等问题6。上述基于离心结合深层过滤或TFF方法所存在的问题，为HCCF初级澄清工艺的优化提供了改进空间。
声学分离技术被提出可用于从细胞培养物中收获分泌蛋白，以获得高质量的蛋白质产品7,8。声学分离通过多维驻波的传播与反射实现，这些驻波与悬浮液体及滞留颗粒相互作用9,10。颗粒受到三种力的作用：流体拖曳力、重力和声辐射力。当这三种力相互平衡并达到稳态时，颗粒将在超声驻波中被悬浮并捕获10。在细胞培养悬浮液中，细胞被固定在驻波的压力节点平面上；随着细胞聚集，节点逐渐增大，最终这些细胞节点簇因重力作用而沉降9。沉降后的细胞从培养基中被去除，从而可将澄清的培养基泵出，用于后续下游处理。超声波作为分离手段的应用已逐步拓展至多种生物学领域，包括脂质颗粒和红细胞的分离11，以及哺乳动物灌流细胞培养12。由于声学分离无需离心、深层过滤或切向流过滤（TFF），可在降低生产成本、减少人力需求和细胞应激方面展现出相对优势，因此生物制造企业正在积极探索其潜在应用价值。
本研究提供了一个用于操作台式声波分离器（AWS）以澄清CHO细胞培养物的通用方案，展示了代表性数据，并演示了如何实现有效的细胞澄清和产物回收。

<table><tbody><tr><td>声泳分离室</td><td>Pall</td><td>CAS-AC-K1 Cadence 声学分离室套件</td><td></td></tr><tr><td>ActiCHO P</td><td>GE</td><td>SH31025.01</td><td>粉末培养基</td></tr><tr><td>AWS</td><td>Pall</td><td>CAS-SYS (60500101-SP)</td><td></td></tr><tr><td>Cadence 声学分离器软件</td><td>Pall</td><td>Cadence 声学分离器界面 Ver. 1.0.4</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1 细胞</td><td>VRC</td><td>VRC01</td><td></td></tr><tr><td>计算机</td><td>Dell</td><td>Latitude 3470</td><td>Windows 7，64 位操作系统</td></tr><tr><td>异丙醇（70%）</td><td>LabChem</td><td>LC157605</td><td>20 L 配制好的 70% 异丙醇</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>25-005-CV</td><td>200 mM 储存液</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 14 管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-14</td><td>过氧化物固化的硅胶管，25 英尺</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 16 管路</td><td>Cole-Parmer</td><td>96400-16</td><td>过氧化物固化的硅胶管，25 英尺</td></tr><tr><td>管路组件</td><td>Pall</td><td>CAS-FP-K1 管路组件</td><td></td></tr><tr><td>浊度探头</td><td>Pall</td><td>CAS-TS-S1 (60500106)</td><td></td></tr></tbody></table>

使用声学分离器对cho收获的细胞培养液进行初步澄清

Primary Clarification of CHO Harvested Cell Culture Fluid using an Acoustic Separator

初级澄清是生物制造过程中的关键步骤，用于从收获的细胞培养液中初步去除治疗性产品中的细胞。尽管离心或过滤等传统方法已广泛用于细胞去除，但这些工艺所用设备占地面积大，操作过程中可能存在污染风险和滤膜堵塞问题。此外，传统方法可能并不适用于连续生物工艺中的初级澄清环节。因此，本研究探索了一种利用声波进行细胞连续分离的替代方案。本文展示了一项详细的实验方案，介绍如何使用台式声波分离器（AWS），对来自CHO细胞生物反应器收获液中含有单克隆IgG1抗体的培养液进行初级分离。研究提供了来自AWS的代表性数据，展示了如何实现有效的细胞澄清和产物回收。最后，讨论了AWS在连续生物工艺中的潜在应用。总体而言，本研究为在CHO细胞培养的初级澄清中应用AWS提供了一套实用且通用的实验方案，并进一步阐述了其在连续生物工艺中的应用前景。

如方案所述，使用 AWS 在 12.4 × 106 个细胞/mL 的密度下对 HCCF 进行澄清，如图 1所示。进料泵设置为 3.5 mL/min（5 L/天），代表了在 10–20 L 培养体系中预估适宜范围内的细胞排放速率。当 HCCF 进入 AWS 腔室时，进料浊度探头的浊度测量值保持稳定，约为 1,000–1,100 NTU，而 probe1 浊度探头的测量值保持在约 40–50 NTU（图 8）。利用这两个测量值，可计算细胞去除效率
<img alt="浊度降低、公式、方程、水处理、效率计算、科学分析" src="/files/ftp_upload/61161/61161equ02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程 2">
计算得出的平均值为95%。研究发现，40–50 NTU的浊度是可达到的最低浊度水平，因此无法通过串联额外的AWS腔室实现进一步分离。
尽管在较低流速下，AWS 能够实现高效的分离，但 HCCF 在腔室内停留时间延长会导致温度升高，因此在选择较低流速时应考虑这一因素。 图9 是HCCF在进入声泳分离室之前与在声学分离之后的温度差异示例，进样流速为3.5 mL/min，结果显示 &gt;6 °C 由于在声学腔室内停留时间过长导致的温度升高。
进行高细胞密度收获（即 >20 × 106 个细胞/mL）时，另一个重要考虑因素是浊度探头的饱和问题。进料浊度探头的浊度测量值在超过 4,400 NTU 时发生饱和（图 10），这可能导致细胞去除效率的计算结果被低估。
为了测试不同进样流速对细胞澄清效果的影响，在不同进样流速下测定了细胞去除效率。如图11所示，随着进样泵流速的增加，细胞去除效率从约100%显著下降至57%。通常情况下，进样泵流速越慢，细胞澄清效果越好。然而，建议针对每种具体应用优化进样流速。
<img alt="蛋白质纯化色谱系统的示意图，包含软件界面和收集瓶。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：AWS系统设置。 启动软件后开启泵（a），HCCF通过进料泵（b）导入，经过进料浊度探针（c），然后进入AWS腔室（d）。在腔室内，声学力将流动中的细胞捕获于声波节点并促使其聚集。细胞浮力降低后在重力作用下下沉，随后由一级泵（e）从声泳腔室的废液口排出，收集至细胞收获瓶（f）；而澄清的物料则从腔室的透过液口流出，经过探针1浊度探针（c）进入产物收获瓶（g）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="带有散热风扇、电缆连接和用于数据采集的以太网端口的实验室设备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：AWS 系统背面。 浊度探头和腔室通过浊度探头以太网电缆（a）和腔室电源 BNC 电缆（b）连接至 AWS 系统背面的相应端口。此外，计算机通过 PC 以太网电缆（c）连接。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="离子选择性电极系统；离子测量装置示意图；电极阵列；水质分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：浊度探头及其外壳。每个浊度探头（a）必须正确插入相应的浊度计和温度计外壳（b）中，并用螺丝拧紧。腔室电源BNC电缆（c）仅可在腔室内压电换能器充满液体后，再连接至声泳腔室背面（d）。探头标识如下：F = 进样浊度，1 = 探头1浊度，2、3和4为未使用的探头（也可用于串联实验步骤）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="超滤系统示意图，显示蛋白质纯化过程中的标记端口与连接方式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：浊度检测室与声泳分离室之间的连接。 进料管路连接至进料浊度端口的输入端（a) 通过进料泵进入。进料浊度端口的输出（b) 连接到声泳室的入口端口（c）通过Y型管连接。一级管路从声泳室的废液口引出（d) 通过一级泵输送至细胞收集容器。声泳室的渗透液端口（e) 连接到探头1浊度端口的输入端（f收获管路从探头1的浊度端口（g）连接至产物收集容器。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="声学分离界面示意图、浊度读数、数据记录、实验控制面板。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：声学分离器软件中的读数面板。该程序包含两个面板：“读数”和“控制”。在“读数”面板中，可监测浊度（a）、温度（b）和去除率百分比（c）。要开始数据记录，需点击“开始测试”按钮（d），该按钮颜色将变为绿色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="声学分离器接口示意图；用于流体分离过程的泵控制和功率设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：程序中的控制面板。在“控制”面板中，可以开启或关闭泵，并可调节进样（a）及其他阶段（b）的泵送速率。此外，可开启或关闭压电换能器腔室的功率（c），并通过滑动条调节功率大小（d）。本实验采用10 W的功率设置，因为这是制造商推荐的CHO细胞操作推荐功率。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="发酵过程的生物反应器装置，显示含有橙色培养基并配有密封盖的培养容器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：AWS 腔室。 细胞进入腔室后，声学力将细胞捕获在声波的波节处，导致细胞聚集（a）。这些细胞聚集体逐渐增大，直至失去浮力，并最终在重力作用下沉降（b）。随后，沉降的细胞通过一级泵从声泳腔室的废液口转移至细胞收集瓶（c）。产物则通过渗透口离开腔室（d），同时收获的细胞培养液（HCCF）通过入口持续注入腔室（e）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="浊度分析图；进料 vs. 第一阶段；时间 vs. NTU；水处理过程评估。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig08.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图8"> 
图8：以3.5 mL/min进料泵速率下，浓度为12 × 106 cell/mL的CHO细胞培养液的浊度测量结果。进料液浊度（蓝色）约为1,000 NTU，第一阶段浊度仪出口的透过液浊度（橙色）为40–60 NTU。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="实验装置中进料和一级温度在90分钟内的温度与时间关系图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig09.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：3.5 mL/min进料泵速率下，细胞密度为12 × 106 个细胞/mL的CHO细胞培养的温度测量结果。进料温度（蓝色）约为21 °C，从一级浊度计流出的透过液温度（橙色）约为27 °C。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig09large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="浊度分析图：进水与一级处理出水浊度随时间变化，NTU，实验结果图表" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig10.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图10"> 
图10：高细胞密度样品的浊度测量示例。 当细胞密度达到 &gt;20 x 106 细胞/mL时，进水浊度测量值达到4,400 NTU的最大值而饱和，导致对细胞去除效率的低估。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="细胞去除效率柱状图；流速范围为1.5-35 ml/min；随着流速增加，效率下降。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61161/61161fig11.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图11"> 
图11：细胞去除效率比较。随着进样速率的增加，细胞分离效果降低。因此，进样速率越高，细胞澄清效率越低。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61161/61161fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>参数</td>
			<td>规格</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>流速</td>
			<td>0 – 10 L/h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>压力范围</td>
			<td>0 – 2 bar (0 – 30 psi)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>进料液温度</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>工作温度</td>
			<td>0 – 40 °C (32 – 104 °F)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：操作条件。 AWS制造商推荐的流速、压力范围、进料液体和操作温度等操作条件。

本文介绍了一种利用声学分离器对CHO细胞培养物进行初级澄清的实验方案。该方案可用于摇瓶培养物或生物反应器收获液的初级澄清，并可潜在应用于灌流培养过程中细胞排放物的连续澄清。

使用声学分离器对CHO收获的细胞培养液进行初步澄清

初级澄清是在收获物中从治疗产品中初步去除细胞所必需的生物制造工艺步骤。

本方案展示了如何使用台式声波分离器，从含有模型单克隆抗体的收获培养液中实现CHO细胞的初步分离。与传统的初级澄清方法（如离心和过滤）相比，声波分离具有一些优势，例如占地面积小、污染风险低，以及降低滤膜污染的风险。由于声波分离可为后续的过滤和色谱工艺持续提供无细胞物料，因此在连续生物工艺中具有应用潜力。准备声波分离器时，将浊度电缆连接到相应的端口，并将腔室电源BNC电缆连接到声波分离器系统的背面。将浊度探头插入浊度计和温度计套管中，并拧紧螺丝。通过进料泵将进料管连接至进料浊度端口的输入端。将Y型管路从进料浊度检测口的出口端连接至声泳分离腔的入口端。将一级管路从声泳分离腔的废液口经由一级泵连接至细胞收集容器，并将声泳分离腔的透过液口管路连接至探头1浊度检测口的输入端。然后，将收获管路从探头1浊度检测口的出口端连接至产物收集容器。为了使用收获的细胞培养液对系统进行预处理，打开声波分离器并启动相关软件程序。在“读数”面板中，单击“开始测试”以启动数据记录。将进样管路末端连接至正在搅拌的收获细胞培养液容器中。启动进料泵时，输入泵速并按 Enter 键。确认泵的方向箭头正确指向，以确保细胞液从容器泵入声泳分离室，然后单击三角形图标启动。在声泳分离室填充过程中，监测“百分比降低面板”中的进料浊度测量值。如果收获的细胞培养液在细胞液容器中已充分混匀，则在加载样品至腔室的过程中，浊度值将保持一致。当液体超过声泳腔后部的压电换能器时，单击“关闭”以停止泵送。然后将BNC电源线的另一端连接到声泳腔上。当声泳分离室充满并通电后，将进料泵的流速调整至所需的运行流速。开启第一级压电电源时，将电源模块中的滑条调至10瓦，并点击“开启”。当细胞开始在声泳分离室底部聚集时，在密切观察声波分离腔室的同时，根据细胞密度和进料泵流速，以适当的流速启动第一级泵，并根据需要调节泵的流速。为计算浓缩细胞质量，先用一个空的15毫升离心管对天平去皮归零，然后用进料样品将离心管装满。记录装有培养物的离心管总质量后，将离心管进行离心，并将上清液倾入新容器中。测量含有细胞沉淀的离心管质量。随后，当声泳室的溢流进入浊度探头1时，监测第一阶段浊度的浊度分布情况。运行结束后，停止进样泵和一级泵，并关闭腔室电源。断开BNC电源线缆，收集产物收获物料用于后续分析。为排空声泳腔室中残留的液体，将废液管放入空容器中。断开声泳分离室入口和透过端口的管路，并将废液管路从泵头中取出。当分离室排空后，重新连接管路，将废液管路放回泵头中，使用进料泵和一级泵流速为60毫升/分钟，从进料管末端冲洗去离子水15至20分钟。水洗结束后，用70%异丙醇通过管路和分离室冲洗15至20分钟，随后再用去离子水冲洗15至20分钟。在此代表性分析中，当收获的细胞液进入声波分离室时，进料浊度探头的浊度测量值保持稳定，约为 1000 至 1100 NTU。探头 1 浊度探头的测量值则保持在约 40 至 50 NTU。将收获的细胞液在室内停留更长时间会导致温度上升，例如本例中，细胞液在进入声泳分离室前与声学分离后之间的温差超过六摄氏度。进行高细胞密度收获时，另一个重要考虑因素是浊度探头的饱和问题，因为进料浊度探头的浊度测量值在超过 4600 NTU 时会达到饱和，这可能导致细胞去除效率计算结果偏低。此外，随着进料泵流速的增加，细胞去除效率显著下降，从约 100% 降至 57%；通常情况下，较低的进料泵流速与更优的细胞澄清效果直接相关。随着生物技术产品制造商向连续化生产模式推进，声波技术在连续生物加工及灌注式生物反应器操作中可能具有更广泛的应用前景。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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