Name: CCL5诱导小鼠骨膜骨骼干细胞迁移的实时成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 了解利用活体显微成像技术实时追踪CCL5诱导小鼠骨膜骨骼干细胞迁移的方法。该方案可评估损伤和细胞因子处理下的细胞定向运动，为组织再生研究提供标准化工具。

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本研究由德克萨斯州骨科疾病项目奖、Caroline Wiess Law 基金奖以及美国国立卫生研究院国家关节与肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIAMS）资助，项目编号分别为 R01 AR072018、R21 AG064345、R01 CA221946，授予 D.P.。&#160; 我们感谢贝勒医学院光学成像与活体显微技术核心实验室的 M.E. Dickinson 和 T.J. Vadakkan&#160;以及&#160;BCM先进科技核心平台&#160;由中国国家卫生研究院（NIH）资助（AI036211，&#160;CA125123 和 DK056338）。
。

所有小鼠均饲养于无病原体环境中，所有实验程序均经贝勒医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 小鼠准备
<ol>
	<li>将 Mx1-Cre17 小鼠和 Rosa26-loxP-stop-loxP-tdTomato (Tom)18 小鼠（购自杰克逊实验室）与 αSMA-GFP 小鼠（由 Ivo Kalajzic 博士和 Henry Kronenberg 博士提供）杂交，以生成 Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+ (Mx1/Tomato/αSMA-GFP) 报告基因小鼠（图 2A）。&#160;</li>
	<li>为诱导 Mx1-Cre 表达，每隔一天向小鼠注射一次 25 mg/kg 的 pIpC，持续 10 天。&#160;</li>
	<li>在静脉移植 1 × 106 个野生型 C57BL/6 小鼠全骨髓单个核细胞（WT-BMT）19 前 1 天，对小鼠进行 9.5 Gy 的照射。&#160;</li>
	<li>恢复 6 至 8 周后，对小鼠实施下文所述的活体成像观察骨膜细胞迁移的实验方案。 
	注意：对 Mx1-Cre 小鼠进行照射和野生型骨髓移植（WT-BMT）是必要的，以清除内源性被 Mx1 标记的造血细胞，这些细胞可能对损伤产生反应。照射后 6 至 8 周，宿主的造血细胞比例低于 &#60;5%，此时可用于成像19。</li>
</ol>
2. 小鼠固定与成像装置
<ol>
	<li>使用一个50 mL的锥形管制作小鼠固定装置（图1A）。
	<ol>
		<li>使用尖头剪刀，在锥形管底部戳一个孔，然后从底部的孔沿管壁向上剪至管口（剪开的一侧作为固定装置的顶部）。&#160;</li>
		<li>在距固定装置顶部约2 cm处，沿与前一切口平行的方向再剪一条长约4–5 cm的切口。移除该部分管壁，并在必要时将边缘打磨光滑。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用可调角度板、0.5”光学支架和适用于0.5”支架、0.1875”六角的直角夹具，构建锥形管成像支架（图1B和材料表）。
	<ol>
		<li>将角度板调节至35°角。在角度板左侧，将光学支架拧入板背面起第二个孔中。</li>
		<li>在可调板右侧，将一个弹簧加载式0.1875”六角锁紧0.25”手拧螺钉插入板前面起第二个孔以及最后一个孔中。直角夹具将与光学支架配合使用，以固定锥形管小鼠固定装置。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 术前手术步骤
<ol>
	<li>小鼠麻醉
	<ol>
		<li>为进行疼痛管理，在手术前30–60分钟，皮下注射缓释丁丙诺啡（1 mg/kg 体重）。</li>
		<li>使用含有37.5 mg/mL 氯胺酮、1.9 mg/mL 赛拉嗪和0.37 mg/mL 乙酰丙嗪的啮齿类动物III CCM复合麻醉剂（combo III）对小鼠进行麻醉。小鼠的合适剂量为每1 kg体重0.75–1.50 mL。该剂量可维持30–45分钟。</li>
		<li>小鼠麻醉后，使用无菌棉签将眼用软膏涂抹于眼睛，以防止眼部脱水。</li>
		<li>对于长期成像（&#62;45分钟），需再次给予麻醉以维持适当的麻醉深度，方法如下：
		<ol>
			<li>准备1 mL注射器，加入足量的combo III，以维持计划成像时间所需的麻醉（每额外镇静30分钟，剂量为0.75 mL/kg 体重）。将带有12英寸管路的25 G蝶形针输注装置连接至注射器，并推动麻醉剂通过管路和针头。</li>
			<li>将蝶形针插入腹腔，然后用胶带固定针头。&#160; 
			注：在成像过程中通过此方式给予额外的combo III，从而无需移动动物或干扰成像视野平面。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在整个操作过程中，使用保持在37°C的加热垫提供热支持。&#160;对于长时间成像（&#62;1小时），需要额外的液体支持。&#160;可在成像期间通过腹腔给予额外的combo III，或皮下注射33 mL/kg生理盐水（0.9 NaCl）作为补充液体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠固定及手术区域准备
	<ol>
		<li>使用电推剪尽可能去除头部顶部的毛发。在剃毛区域涂抹脱毛膏，以清除手术部位残留的任何毛发。&#160;</li>
		<li>通过脚趾夹捏无反应来确认小鼠已完全麻醉。15分钟后，若小鼠仍未完全麻醉，可给予第二剂较小剂量的combo III（&#60;0.75 mL/kg 体重）。</li>
		<li>将小鼠尾部朝前放入锥形管中，向后滑动至鼻部略微悬于锥形管边缘的位置。&#160;</li>
		<li>使用医用胶带将前肢固定在锥形管底部。</li>
		<li>将装有小鼠的锥形管放置在设定为35°角的成像支架上，并使用直角夹固定（图1C）。</li>
		<li>小鼠在成像支架上固定后，交替使用聚维酮碘溶液和70%异丙醇对手术区域进行三次清洁消毒。再次检查动物是否完全镇静。</li>
		<li>将小鼠转移至干净的吸水垫上，并在其上方覆盖手术巾，以建立较大的无菌区域。   </li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 手术步骤
<ol>
	<li>切口打开
	<ol>
		<li>使用尖头镊子夹住右耳正内侧的皮肤。用显微解剖剪刀剪开镊子夹持的皮肤。&#160; 
		注意：采用上述方法开始切口可形成圆润的切口，更利于术后缝合。</li>
		<li>从初始切口处开始，向左耳方向做一横向切口（&#60;1 cm）。&#160;再从初始切口处向动物鼻部方向做另一切口（约超过右眼2–3 mm）。</li>
		<li>用镊子和剪刀将皮肤与骨膜分离，轻轻剪开皮肤与颅骨骨膜之间的结缔组织。&#160;</li>
		<li>使用无菌棉签，在皮肤瓣表面涂抹适量眼科软膏。&#160;轻轻提起皮肤瓣并将其折叠覆盖于左眼上方。矢状缝与冠状缝的交点应清晰暴露（图1E）。 
		注意：使用眼科软膏可使皮肤瓣保持固定位置。</li>
		<li>用无菌PBS冲洗暴露的表面，清除血液和残留毛发。&#160; 
		注意：如有必要，可用尖头镊子清除冲洗后残留的毛发，但需注意避免损伤骨膜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微骨折处理
	<ol>
		<li>为在颅骨上制造微骨折，取下29 G胰岛素注射器的活塞，并在注射器后端约300–400 uL刻度处剪断。 
		注意：此步骤可使操作在解剖显微镜下更易进行。</li>
		<li>将针尖斜面置于冠状缝前方（向鼻部方向）一个至两个针宽处，并位于矢状缝右侧一个至两个针宽处（图1E）。</li>
		<li>轻轻顺时针旋转注射器数次，再逆时针旋转数次。 
		注意：在年轻小鼠中，仅需施加极轻微的向下压力即可形成圆形微骨折。注意避免针头刺入脑组织，否则会引起出血并干扰成像。</li>
		<li>使用27 G针头将微骨折扩大至约0.4 mm。若微骨折内仍有骨碎片残留，用PBS冲洗该区域。若骨碎片仍存在，可用29 G针头轻轻将其刮出。&#160;</li>
		<li>重复步骤4.2.1–4.2.4，在矢状缝左侧制造另一处损伤。 
		注意：此时有两种选择：1）立即进行CCL5处理（第4.3节）和成像（第5节）；或2）按照第6节的术后操作关闭手术部位。24小时后再次麻醉小鼠，重新打开手术部位，对损伤处进行CCL5处理（第4.3节），并进行活体成像（第5节）及术后护理（第6节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CCL5处理
	<ol>
		<li>从RANTES储备液（100 ng/mL）中，使用基底膜基质（材料表）配制10 ng/mL的工作液。将该溶液置于冰上，以保持基质处于液态。</li>
		<li>使用2–20 μL移液器向每处损伤部位加入2 μL CCL5（10 ng/μL）（该移液器吸头直径较大，适用于黏稠液体）。让基质自然凝固。</li>
		<li>待基质完全凝固后，轻轻将皮肤瓣覆盖回颅骨上，以防止组织脱水。成像前孵育1小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 活体成像
<ol>
	<li>显微镜设置
	<ol>
		<li>打开多光子激光器（飞秒钛宝石激光器）。将波长设置为 880 nm，并调节功率以进行骨组织的二次谐波生成（SHG）成像（440 nm）。</li>
		<li>打开 488 nm 和 561 nm 固体激光器，分别用于激发表达 GFP 和 tdTomato 的细胞。</li>
		<li>开启用于检测二次谐波信号（405–455 nm 检测）和 GFP 信号（505–550 nm 检测）的 PMT（光电倍增管）探测器。开启 HyD 3 探测器用于检测番茄荧光信号（590–620 nm 检测）。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品安装
	<ol>
		<li>在将小鼠移至显微镜前，通过轻轻按压小鼠头部后方检查颅骨的可视平面。如果平面不水平，请通过轻微向左或向右旋转小鼠固定装置来调整位置。&#160; 
		注意：此步骤至关重要，以确保获得足够的图像质量。</li>
		<li>在颅骨及皮肤瓣表面覆盖无菌的 2% 甲基纤维素水溶液（w/v），防止组织干燥。</li>
		<li>将小鼠放置在 XYZ 轴电动显微镜载物台上（图 1G）。使用落射荧光光源对小鼠进行定位，使其满足以下两个条件：1）朝向显微镜；2）冠状缝与矢状缝的交点位于载物台中心位置。</li>
		<li>在成像区域上放置玻璃盖玻片，并再次检查对齐情况（图 1H）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>延时成像
	<ol>
		<li>使用低倍物镜（25 倍水浸物镜，NA = 0.95）扫描颅骨区域。获取冠状缝与矢状缝交点的参考图像。</li>
		<li>利用 SHG 信号及细胞的荧光信号，定位每个损伤部位，并记录其 XYZ 坐标以及距冠状缝和矢状缝的距离（图 2B）。</li>
		<li>选择冠状缝或矢状缝上的某一位置进行长期成像。对该区域采集详细的 Z 轴层扫图像，作为成像过程中的参考。&#160; 
		注意：由于骨缝是已知的 P-SSC 微环境，细胞将从该区域迁移以响应颅骨损伤。</li>
		<li>使用延时成像软件设置，每 1 分钟采集一次图像，持续至少 1 小时。在每次图像采集间隔期间，将当前视野与初始视野进行比较。若两者不一致，则利用 Z 轴层扫图像确定视野需要调整的方向。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 术后动物护理
<ol>
	<li>成像后，用无菌 PBS 冲洗暴露的颅骨，以去除甲基纤维素。&#160;</li>
	<li>为关闭切口，轻轻将皮肤瓣覆盖于颅骨上。使用无菌棉签清除残留的眼科软膏，并使切口部位干燥。</li>
	<li>使用带 C-1 反向切割针的 5-0 单丝尼龙不可吸收缝线缝合手术部位。用无菌棉签将三联抗生素软膏涂抹于闭合的切口上。 
	注意：高质量的缝合技术和最小化出血有助于减少瘢痕形成。</li>
	<li>将小鼠置于清洁笼中，并放置在温暖的表面上，每 15 分钟检查一次，直至小鼠恢复胸卧位。</li>
	<li>术后 72 小时给予第二剂缓释布托啡诺。</li>
	<li>每日观察小鼠是否出现蜷缩行为、毛发竖立和/或活动能力丧失，直至拆线（约 1 周）。&#160;</li>
</ol>

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</ol>

L.C.O. 和 D.P. 披露了一项待审批的专利，名为“Periosteal Skeletal Stem Cells in Bone Repair”（BAYM.P0264US.P1）。其余作者声明不存在利益冲突。

在骨愈合过程中，骨膜细胞是损伤骨痂内新分化的软骨细胞和成骨细胞的主要来源3。类似于骨髓，成骨/软骨生成性干细胞（SSC）也在骨膜中被鉴定出来4,5,6。评估内源性骨膜干细胞（P-SSC）功能特征在技术上具有挑战性。通常，干细胞的迁移动态是在体外进行评估，这使得对其相应体内系统的解释变得困难。由于活体动物共聚焦显微成像技术的最新进展以及新型报告小鼠（Mx1/Tomato/αSMA-GFP）的构建，现已可实现对单个细胞在体内的动态追踪。因此，该方法能够实现实时记录CCL5诱导的P-SSCs在体内的迁移过程。
该方法存在若干可能影响成像一致性的技术挑战。其中主要的技术挑战之一是维持Z轴方向的成像平面。Z轴漂移（Z-drift）在固定样本和活体样本的长期成像过程中普遍存在，主要归因于成像环境中温度的变化。&#160; 尽管无法完全消除这一伪影，但对载物台、物...

骨折修复是一个动态的多细胞过程，与胚胎期骨骼发育和骨骼重塑过程截然不同。在此过程中，受损组织产生的损伤信号会迅速诱导骨骼干细胞/祖细胞的募集、增殖及后续分化，这些过程对骨折整体的稳定与固定至关重要1。尤其在骨折愈合的早期阶段，需要形成软性骨痂，这一过程主要归因于骨膜中的常驻细胞2。当骨骼受到损伤时，一部分骨膜细胞会迅速响应，并分化为骨痂内的软骨中间产物和成骨细胞3，这表明骨膜中存在一类独特的骨骼干细胞/祖细胞群体。因此，鉴定并功能表征骨膜驻留的骨骼干细胞（SSCs）为退行性骨病及骨缺损的治疗提供了极具前景的策略4。&#160;
人们认为骨骼干细胞（SSCs）存在于多个组织部位，包括骨髓。类似于骨髓，成骨/软骨生成性SSCs也在骨膜中被发现4,5,6。&#160;这些骨膜来源的SSCs（P-SSCs）在胎儿骨骼发育过程中可被早期间充质谱系标记物标记（例如，Prx1-Cre5、Ctsk-Cre7 和 Axin2-CreER8）4,7,8,9,10。这些单基因谱系示踪模型的一个显著局限性在于，被标记的细胞群体内部存在高度异质性。此外，它们无法在体内区分被标记的SSCs与其分化后代细胞。为克服这一局限性，我们近期开发了一种双报告小鼠模型（Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+），以明确区分P-SSCs与骨髓SSCs（BM-SSCs）11。利用该模型发现，P-SSCs具有Mx1+αSMA+双标记特征，而更趋分化的Mx1+细胞则定位于骨髓、骨内膜和骨膜表面以及皮质骨和松质骨中11,12。&#160;
已知多种细胞因子和生长因子可调控骨重建与修复，并已在骨组织物理屏障受损所构建的临界节段缺损模型中用于促进骨骼修复的测试1,13。然而，由于此类损伤模型具有复杂的细胞组成，这些分子对愈合过程中内源性P-SSC迁移与活化的直接作用尚不明确。干细胞的功能特征及其迁移动态通常在体外通过Transwell或划痕实验进行评估，并结合已知可诱导其他细胞群体迁移的细胞因子或生长因子共同分析。因此，将这些体外实验结果外推至相应的体内系统时存在较大挑战。目前，对骨骼干细胞/祖细胞迁移的体内评估通常无法实现实时观察，而是在骨折后特定时间点进行静态测量5,7,14,15,16。
该方法的一个局限性在于，无法在单细胞水平上评估细胞迁移；而是通过细胞群体的变化来测量。由于活体动物体内显微成像技术的最新进展以及更多报告基因小鼠的建立，现在已可在体内追踪单个细胞。利用活体动物体内显微成像技术，我们在Mx1/Tomato/αSMA-GFP小鼠中观察到，颅骨缝 niche 中的P-SSCs在损伤后24–48小时内向骨损伤部位发生明显迁移。&#160;
最近发现，CCL5/CCR5 是一种调控机制，可影响损伤早期反应中 P-SSC 的募集与活化。有趣的是，在实时观察中，并未检测到损伤后出现显著的 P-SSC 迁移。然而，使用 CCL5 处理损伤后，可诱导 P-SSC 发生强烈且具有方向特异性的迁移，该过程可在实时条件下被捕捉。因此，本实验方案的目的是提供一种详细的方法，用于记录 P-SSC 在 CCL5 处理后体内实时迁移的过程。

<table><tbody><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; 光学支架</td><td>ThorLabs</td><td>TR2</td><td>用于成像固定装置</td></tr><tr><td>1 mL 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>27G 针头</td><td>BD PercisionGlide</td><td>305111</td><td></td></tr><tr><td>29G 胰岛素注射器</td><td>McKesson</td><td>102-SN05C905P</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>用于小鼠固定</td></tr><tr><td>可调角度板</td><td>Renishaw</td><td>R-PCA-5023-50-20</td><td>用于成像固定装置</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>Coviden</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘外科洗手液</td><td>Henry Schen</td><td>67618-151-16</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine SR-LAB</td><td>ZooPharm</td><td></td><td>1 mg/mL 缓释剂型</td></tr><tr><td>Combo III</td><td>由兽医工作人员提供</td><td>N/A</td><td>37.6 mg/mL 氯胺酮；1.9 mg/mL 赛拉嗪；0.37 mg/mL 乙酰丙嗪</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-545-87</td><td>24 × 40 优质超薄盖玻片</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>KetaVed</td><td>50989-161-06</td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8MP 配 DM6000CFS</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>R &amp; D Systems</td><td>344500101</td><td></td></tr><tr><td>医用胶带</td><td>McKesson</td><td>100199</td><td>3&quot; × 10 码（7.6 cm × 9.1 m）</td></tr><tr><td>甲基纤维素</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19560</td><td></td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>FST</td><td>1456-12</td><td></td></tr><tr><td>电动载物台</td><td>Anaheim Automation</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>不可吸收缝线</td><td>McKesson</td><td>S913BX</td><td>单丝尼龙 5-0 不可吸收缝线，配 C-1 反向切割针</td></tr><tr><td>眼科软膏</td><td>Rugby</td><td>0536-1086-91</td><td></td></tr><tr><td>RANTES</td><td>Biolegend</td><td>594202</td><td>10 &amp;micro;g/50 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>适用于 &amp;frac12;&amp;rdquo; 支架的直角夹具，3/16&amp;rdquo; 六角接口</td><td>ThorLabs</td><td>RA90</td><td>用于成像固定装置</td></tr><tr><td>弹簧加载式 3/16&amp;rdquo; 六角锁紧 &amp;frac14;&amp;rdquo; 旋钮螺钉</td><td>ThorLabs</td><td>TS25H</td><td>用于成像固定装置</td></tr><tr><td>无菌棉签</td><td>Henry Schen</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>无菌 DPBS (1×)</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>无菌手术单</td><td>McKessen</td><td>25-517</td><td></td></tr><tr><td>外科手套</td><td>McKessen</td><td>3158VA</td><td></td></tr><tr><td>三重抗生素软膏</td><td>Taro Pharmaceuticals U.s.a., Inc.</td><td>51672-2120-2</td><td></td></tr><tr><td>真空采血管采集套件</td><td>BD</td><td>REF 367298</td><td>25G 蝶形针输液套件，配 12&quot; 管路</td></tr></tbody></table>

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在ccl5诱导下的迁移

Real-Time Imaging of CCL5-Induced Migration of Periosteal Skeletal Stem Cells in Mice

骨膜骨骼干细胞（P-SSCs）对终身骨骼维持和修复至关重要，因此是开发促进骨折愈合疗法的理想靶点。&#160;骨膜细胞会迅速迁移至损伤部位，为骨折愈合提供新的软骨细胞和成骨细胞。传统上，细胞因子诱导细胞迁移能力的有效性仅通过体外实验（如Transwell或划痕实验）进行评估。随着多光子激发活体显微技术的进步，近期研究发现：1）P-SSCs表达迁移相关基因CCR5；2）使用CCR5配体CCL5处理可改善骨折愈合，并促进P-SSCs向CCL5的迁移。这些结果已实现实时捕获。本文描述了一种可视化P-SSC从颅骨缝骨骼干细胞（SSC）生态位在CCL5处理后向损伤部位迁移的实验方案。该方案详细介绍了小鼠固定装置与成像支架的构建、小鼠颅骨的手术准备、颅骨缺损的诱导以及延时成像的采集过程。

已有研究提出，骨骼祖细胞可能具有迁移或循环潜能20。近期构建了Mx1-Cre+Rosa26-Tomato+αSMA-GFP+（Mx1/Tomato/αSMA-GFP）报告基因小鼠模型，其中P-SSCs通过Mx1+αSMA+双标记进行标识（图2A,B）。在损伤后24–48小时内，Mx1+αSMA+ P-SSCs大量从骨缝间充质迁移而出11。此外，还检测了颅骨缺损后24小时体内P-SSCs实时迁移的可能性。成像后1小时内几乎未观察到Mx1+αSMA+</sup...

本方案描述了利用活体动物活细胞显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移的方法。

实时成像小鼠骨膜骨骼干细胞在CCL5诱导下的迁移

骨膜源性骨骼干细胞（P-SSCs）对终身骨骼维持与修复至关重要，使其成为开发...的理想研究对象

该标准化方案可用于评估内源性细胞迁移，并可应用于多种细胞类型以及骨骼表型。此技术的优势在于，它能够对单个细胞在损伤和/或细胞因子处理后的体内迁移行为进行追踪，而非仅针对细胞群体。在开始操作前，需确认麻醉小鼠对足趾夹捏无反应，并在其眼睛上涂抹眼膏。接下来，在右耳内侧正前方处开始，向左耳方向做一条长度小于一厘米的横向切口，并从该切口处沿右眼外侧约两到三毫米处向鼻部方向做第二条切口。使用镊子将皮肤与骨膜分离，并用剪刀轻柔地剪开结缔组织，使皮肤与颅骨骨膜完全分离。使用无菌棉签，将眼用软膏涂抹于皮瓣表面，并将皮瓣轻轻折叠覆盖在左眼上。应充分暴露矢状缝与冠状缝的交界处。用无菌 PBS 冲洗暴露的表面，清除血液和残留毛发。将斜面针尖置于冠状缝前方一至两个针宽、矢状缝右侧一至两个针宽的位置。施加极轻微的向下压力，小心地将注射器顺时针旋转一次，再逆时针旋转数次。然后使用27号针头将微骨折孔扩大至约40微米。如果仍有骨碎片残留，用PBS冲洗微骨折孔。如果骨碎片仍然存在，使用29号针头轻轻将碎片取出。进行CCL5处理时，使用100纳克/毫升的CCL5储备液与基底膜基质混合，配制终浓度为10纳克/毫升的工作浓度趋化因子溶液。处理损伤部位时，用220微升移液器吸取5微升该溶液，并将其中2微升趋化因子滴加至缝合处。随后让基质凝固，并将皮瓣轻轻覆盖于颅骨上，以确保在长达1小时的趋化因子处理过程中组织不会脱水。为了实时进行颅骨骨膜干细胞迁移的活体成像，在将小鼠移至显微镜前，轻轻按压小鼠头部后方，以检查颅骨的可视平面。如果平面不水平，可轻轻将小鼠固定装置向左或向右旋转，以调整位置。接着，用无菌的2%甲基纤维素水溶液覆盖整个颅骨皮瓣，并将小鼠放置在XYZ轴电动显微镜载物台上。使用落射荧光光源，调整小鼠位置，使其面向显微镜，并以冠状缝与矢状缝的交点作为载物台的中心参考点。然后在成像区域加盖盖玻片，并再次检查对齐情况。若需对细胞迁移进出骨缝的过程进行延时成像，应选择低倍水浸物镜扫描颅骨。 获取矢状缝与冠状缝交点的参考图像，并利用细胞的二次谐波（SHG）和荧光信号定位每个损伤部位，记录其XYZ坐标以及与矢状缝和冠状缝的距离。在冠状缝或矢状缝上选择一个位置用于长期成像，并对该区域获取详细的Z轴层扫（ZStack）图像，作为成像过程中的参考。使用延时成像软件设置，每隔一分钟采集一次图像，持续至少一小时，并在两次图像采集间隔期间，将当前视野与初始视野进行比较。如果视野不同，则使用ZStack图像确定视野需要调整的方向。近期，研究人员构建了Mx1番茄α-SMA GFP报告小鼠，其中骨膜骨骼干细胞通过Mx1阳性与α-SMA阳性双重标记进行标识。在缝线放置后24小时，进行为期一小时的成像观察，发现极少或几乎没有Mx1阳性且α-SMA阳性的骨膜骨骼干细胞发生迁移。CCL5趋化因子在颅骨损伤后24小时对缺损部位进行处理，可诱导细胞从冠状缝处向远离方向迁移，并朝向损伤部位移动。在此代表性分析中，在成像开始后一小时内，一个Mx1阳性且α-SMA阳性的骨膜骨骼干细胞向损伤部位迁移了约50微米。该实验方案中最关键的一点是，必须将CCL5处理局限于损伤部位，以刺激细胞特异性的定向迁移。此操作完成后，可继续进行为期一周的局部治疗。可采用微型CT评估颅骨损伤的愈合情况及矿物质沉积。

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