CCL5诱导小鼠骨膜骨骼干细胞迁移的实时成像

该协议描述了使用活体动物活体显微镜实时检测CCL5介导的骨膜骨骼干细胞迁移。

标准化方案可用于评估内源性细胞迁移，并可应用于多种细胞类型以及骨骼表型。该技术的优点是，它允许跟踪单个细胞的体内细胞迁移，而不是响应损伤和/或细胞因子治疗的细胞群。在开始手术之前，确认麻醉小鼠对脚趾捏没有反应，并在动物的眼睛上涂抹软膏。

接下来，从右耳内侧朝左耳做一个小于 1 厘米的横向切口，然后从最初的切口做第二个切口，大约两到三毫米，越过右眼朝向鼻子。用镊子将皮肤与骨膜分开，用剪刀轻轻切开结缔组织，将皮肤与颅骨骨膜分开。使用无菌棉签，将眼药膏涂抹在皮瓣顶部，然后将皮瓣轻轻折叠在左眼上。

矢状缝和冠状缝的交界处应明显暴露。用无菌 PBS 冲洗开放表面以清洁任何血液和残留毛发的区域，并将斜面尖端从冠状缝线向鼻子放置 1 到 2 针宽，将矢状缝线右侧放置 1 到 2 针宽。使用非常小的向下压力，小心地顺时针旋转注射器 1 次和逆时针旋转 1 次。

然后使用 27 号针头将微骨折扩大到大约 40 微米。如果仍有骨碎片，请用 PBS 冲洗微骨折。如果仍有骨头碎片，请使用 29 号针头轻轻舀出骨头碎片。

对于 CCL5 处理，使用 100 ng/ml 的 CCL5 储备液和基底膜基质获得 10 ng/ml 的工作趋化剂溶液。为了治疗损伤，将 220 微升的移液管加入 5 微升的溶液，并在缝合线上涂抹 2 微升趋化因子。然后让基质凝固并用皮瓣轻轻覆盖颅骨，以确保组织在一小时的趋化因子治疗期间不会脱水。

为了实时对骨膜干细胞迁移进行活体成像，在将鼠标移至显微镜之前，轻轻按压小鼠的后脑勺以检查颅骨的视觉平面。如果平面不水平，请轻轻向左或向右旋转鼠标约束以调整位置。接下来，用无菌的 2% 甲基纤维素水溶液覆盖皮瓣中的整个颅骨，并将鼠标放在 XYZ 轴电动显微镜载物台上。

使用落射荧光灯，对齐鼠标，使其面向显微镜，并且冠状缝和矢状缝合的交点是载物台的中心参考点。然后将玻璃盖放在成像区域并仔细检查对齐情况。对于进出缝线迁移的延时成像，请选择低倍率水浸镜头来扫描颅骨。

获取矢状线和冠状缝线交集的参考图像，并使用来自细胞的 SHG 和荧光信号，定位每个损伤部位并记录 XYZ 坐标以及与矢状线和冠状缝线的距离。在冠状缝或矢状缝上选择一个位置进行长期成像，并在成像过程中从参考中获得该区域的详细 ZStack 图像。使用延时摄影软件设置每 1 分钟录制一张图像，持续至少 1 小时，将当前视野与快照之间时间内的初始视野进行比较。

如果视野不同，请使用 ZStack 图像来确定需要调整视野的方向。最近，产生了 Mx1 番茄 alpha-SMA GFP 报告小鼠，其中骨膜骨骼干细胞由 Mx1 阳性 α-SMA 阳性双标记标记。缝合放置后 24 小时，在 1 小时的成像期间内，几乎没有观察到 Mx1 阳性 α-SMA 阳性骨膜干细胞迁移。

受伤后 24 小时颅骨缺损的 CCL5 趋化因子治疗会诱导从冠状缝线向损伤部位方向明显的迁移。在这项具有代表性的分析中，在成像后 1 小时内，一个 Mx1 阳性 α-SMA 阳性骨膜骨骼干细胞向损伤处迁移了约 50 微米。该方案要记住的最重要方面是将 CCL5 治疗限制在损伤部位，以刺激细胞特异性迁移。

一旦该程序完成，局部治疗可以持续一周。显微 CT 可用于评估颅骨损伤愈合和矿物质沉积。