Name: 香烟烟雾对肺 癫痫细胞 伪多多多细胞的影响研究 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解香烟烟雾提取物对肺上皮细胞中铜绿假单胞菌定植影响的研究方法。该方案提供制备烟雾提取物、细菌感染和细菌负荷测定的详细步骤，可用于评估烟雾暴露后的细菌负载变化，为研究呼吸道健康与吸烟相关性提供可重复的技术基础。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由美国国立卫生研究院R01基金HL125435和HL142997（资助对象：CZ）支持。

1. 100% CSE 的制备
<ol>
	<li>用60 mL注射器吸取10 mL无血清细胞培养基（BEAS-2B细胞使用DMEM/F12培养基；HSAEC细胞使用气道上皮细胞基础培养基）。</li>
	<li>将适当修剪过的1 mL移液器吸头反向连接至注射器喷嘴，作为适配器以固定香烟（3R4F）。</li>
	<li>移除香烟的滤嘴，将香烟连接至吸头适配器并点燃燃烧。</li>
	<li>将40 mL含烟气的空气抽入10 mL无血清培养基中，通过剧烈震荡混合烟气与培养基（每次抽吸后震荡30秒）。</li>
	<li>在约7分钟内重复步骤1.4约11次，直至香烟完全燃尽。</li>
	<li>使用0.22 µm滤器过滤10 mL烟气处理过的培养基，以去除所有微生物和不溶性颗粒，转移至密闭无菌管中。CSE（香烟烟气提取物）应在后续实验前不超过30分钟内配制完成。</li>
</ol>
2. Pseudomonas 培养
<ol>
	<li>接种冻存的 P. aeruginosa （菌株 PAO1）或 P. fluorescens Migula （菌株 PAO143）接种于胰蛋白胨大豆肉汤中&#160;在37 °C下过夜培养的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）琼脂平板。 
	注意：为了获得足够的细菌用于培养，应尽可能多地将细菌涂布于TSB琼脂平板上。</li>
	<li>收集细菌涂片，加入含5%甘油作为碳源的20 mL TSB中孵育。</li>
	<li>在37 °C摇床培养箱中以200 rpm振荡细菌悬液1小时，直至OD600 value = 0.6。 
	注意：振荡速度不得超过 200 rpm。过高的振荡速度可能破坏细菌鞭毛的形态，并影响细菌对肺上皮细胞的侵袭能力。同样，振荡时间应限制在 1 h 内，以获得高侵袭性的细菌。测定 OD600 用于估算细菌数量的值。OD600&#160;= 1 对应于约 109&#160;菌落形成单位（CFU）/mL</li>
</ol>
3. 人肺上皮细胞培养及CSE处理
<ol>
	<li>按照先前描述的方法24，在HITES培养基（500 mL DMEM/F12，2.5 mg胰岛素，2.5 mg转铁蛋白，2.5 mg亚硒酸钠，2.5 mg转铁蛋白，10 μM氢化可的松，10 μM β-雌二醇，10 mM HEPES和2 mM L-谷氨酰胺）中培养人&#160;BEAS-2B细胞，并添加10%胎牛血清（FBS）。</li>
	<li>在气道上皮细胞培养基（500 mL气道细胞基础培养基，500 µg/mL HSA，0.6 µM亚油酸，0.6 µg/mL卵磷脂，6 mM L-谷氨酰胺，0.4% P提取物，1.0 µM肾上腺素，5 µg/mL转铁蛋白，10 nM T3，1 µg/mL氢化可的松，5 ng/mL重组人EGF和5 µg/mL重组人胰岛素）中培养人原代小气道上皮细胞（HSAEC）。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育。</li>
	<li>加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化5分钟，直至细胞完全从培养板底部脱落。</li>
	<li>加入10 mL完全HITES培养基以中和胰蛋白酶，并将细胞收集至15 mL离心管中。在4 °C、300 x g条件下离心5分钟。 
	注意：需在显微镜下密切监测胰蛋白酶消化时间，过度消化可能导致细胞死亡。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞重悬于2 mL含10% FBS的HITES培养基中。</li>
	<li>取上述细胞悬液10 µL滴加至培养板中，插入自动细胞计数仪，测定细胞浓度（单位：个/mL）。</li>
	<li>将BEAS-2B细胞以3 × 105 个/mL的浓度接种于6孔板中，每孔总体积为2 mL，培养基为含10% FBS的HITES培养基，过夜培养。</li>
	<li>当细胞融合度达到约80%，或细胞浓度为5 x 105 个/mL时，用4% CSE处理细胞3小时。CSE处理前，更换为含1% FBS的HITES培养基。</li>
</ol>
4. 细菌感染
<ol>
	<li>向CSE处理的细胞各孔中加入P. aeruginosa或P. fluorescens Migula&#160;（约1 × 107&#160;CFU/mL），在37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。</li>
	<li>吸除上清液，每孔加入2 mL新鲜HITES培养基，同时加入4% CSE和100 µg/mL庆大霉素。 
	注：使用庆大霉素是因为其无法穿透人肺上皮细胞膜，因此可杀死培养基中的所有细菌，但不能杀死已侵入肺上皮细胞内的细菌。</li>
	<li>在37 °C、5% CO2条件下经CSE/庆大霉素处理1小时后，吸除上清液，并用PBS洗涤细胞3次，用于后续细菌浓度测定。 
	注：为确认细菌是否被细胞内化，使用荧光显微镜观察感染GFP标记的P. fluorescens Migula&#160;的细胞。</li>
</ol>
5. 采用涂布平板法测定细菌浓度
<ol>
	<li>采用滴板法测定感染细胞中的细菌载量时，用 2 mL 冷 PBS 将经庆大霉素处理的细胞洗涤 2 次。</li>
	<li>向每个孔中加入 1 mL 细胞裂解缓冲液（含 0.5% Triton X-100 的 PBS）。</li>
	<li>将含有内化细菌的细胞裂解液进行梯度稀释（1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000），用于后续接种至 TSB 琼脂平板。</li>
	<li>经 16 小时培养后，通过计数细菌菌落获得 CFU 结果。</li>
</ol>
6. 细菌16S rRNA的RT-qPCR检测
<ol>
	<li>按照上述方法，用庆大霉素处理铜绿假单胞菌（Pseudomonas）感染的肺上皮细胞（约 1 × 106 个细胞/mL）。吸除培养基，并用 2 mL 冷 PBS 洗涤细胞 2 次。</li>
	<li>向 6 孔板的每孔中加入 0.35 mL 异硫氰酸胍裂解缓冲液。用细胞刮收集细胞，将裂解液用移液器转移至微量离心管中，并轻轻吹打混匀。</li>
	<li>向裂解液中加入等体积（0.35 mL）新配制的 70% 乙醇，充分混匀。将所有样品转移至置于 2 mL 收集管中的离心柱中，在 20–25 °C 下以 10,000 × g 离心 30 秒，随后弃去收集管中的废液。</li>
	<li>用 0.7 mL 洗涤缓冲液 1 洗涤离心柱，在 10,000 × g 下离心 30 秒。再用 0.5 mL 洗涤缓冲液洗涤膜结合的 RNA 2 次，每次均在 10,000 × g 下离心 2 分钟。</li>
	<li>将离心柱转移至新的 1.5 mL 收集管中，加入 30–50 µL 无 RNase 水，在 10,000 × g 下离心 1 分钟。收集穿流液并测定 RNA 浓度。</li>
	<li>根据制造商说明书进行逆转录反应。将 1 µg 总 RNA 与 10 µL 反应缓冲液、1 µL 逆转录酶及无 RNase 水混合，总体积为 20 µL。在 37 °C 反应 1 小时，随后在 95 °C 反应 5 分钟。</li>
	<li>将上述逆转录反应所得 cDNA 模板（各取 1 µL）、含 SYBR 染料的 Master Mix 5 µL、各 1 µL 的 200 nM 特异性引物以及水混合，总体积为 20 µL，用于后续 PCR 分析，具体操作遵循制造商推荐。 
	注：以下为靶向铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）16S rRNA 的引物序列：上游引物 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3′；下游引物 5′-TAAGATCTCAAGGATCCCAACGGC-3′。GAPDH 作为上样对照，引物序列为：上游引物 5′-GGCATGGACTGGTCATGA-3′；下游引物 5′-TTCACCATGGAGAAGGC-3′。</li>
	<li>采用相对 CT 法（comparative CT method）确定基因表达水平。</li>
</ol>
7. 荧光检测 假单胞菌 通过流式细胞术
<ol>
	<li>处理上述荧光 假单胞菌感染的肺上皮细胞（约 1 x 106 细胞/mL），并按先前所述加入庆大霉素。吸去培养基，用 2 mL 冷 PBS 洗涤细胞 2 次。</li>
	<li>使用流式细胞仪在509 nm波长下检测GFP，每次检测以100,000次计数为终止点。使用相关软件分析所获得的数据。</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
<li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Care+Journal%22%5BJournal%5D)">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li>
<li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li>
<li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation%2C+Allergy%2C+Asthma+and+Other+Lung+Diseases%3A+A+Mechanistic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelated+role+of+cigarette+smoking%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li>
<li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li>
<li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+tobacco+use%3A+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li>
<li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Review%22%5BJournal%5D)">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li>
<li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li>
<li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li>
<li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations%3A+defining+their+cause+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li>
<li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbations+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).</li>
<li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).</li>
<li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li>
<li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li>
<li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells%3A+fortifying+the+barrier+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li>
<li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p21%28CIP1%2FWAF1%29+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x%28L%29+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li>
<li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784(2013).</li>
<li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL%28R%29+VC10%28R%29+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li>
<li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li>
<li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF%28Fbxl17%29-recognized+acetyldegron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li>
<li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26(2009).</li>
<li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells%3A+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25%2FHDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li>
<li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Agitation%2C+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125(2018).</li>
<li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides%3A+activity+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li>
<li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li>
<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

细菌侵入肺上皮细胞是细菌感染致病过程中的关键步骤。细菌侵入细胞的过程可分为以下三个步骤：首先，细菌利用其鞭毛接触并黏附于上皮细胞表面；其次，细菌通过内吞作用或直接穿透细胞膜进入细胞内；最后，若细菌成功逃逸细胞防御机制，则可在细胞内复制并定植25,26。尽管针对肺泡巨噬细胞中细菌感染的观察方法已发展多年，但对肺上皮细胞的相关研究仍较为有限27,28。本研究通过三种方法测定肺上皮细胞内的细菌载量：倾注平板法、针对Pseudomonas核糖体16S RNA的RT-qPCR检测，以及流式细胞术。这三种方法均具有相似的灵敏度且效果良好。选择何种方法测定肺上皮细胞中的细菌载量，取决于实验设备的可及性和时间因素。在这些实验中，保持细菌鞭毛的完整性和未受损状态对于成功感染肺上皮细胞至关重要29。较短时间且有限速度的振荡处理可能有助于进一步增强细菌的侵袭能力...

吸烟对全球数百万人的公共健康造成影响。据报道，许多有害疾病，包括肺癌和慢性阻塞性肺疾病（COPD），均与吸烟有关1,2。吸烟会增加呼吸系统对急性微生物感染的易感性3,4,5。此外，越来越多的证据表明，吸烟会加剧多种慢性疾病的发病过程6,7,8。例如，吸烟可能增加导致COPD急性加重的病毒或细菌感染风险9。在导致COPD急性加重的细菌病原体中，一种机会性革兰氏阴性杆菌病原体Pseudomonas aeruginosa所引起的感染与不良预后和更高的死亡率相关10,11。COPD急性加重通过加速病理进展而使病情恶化。目前除对症治疗外，尚无有效疗法可对抗COPD急性加重12。COPD急性加重会增加患者死亡率，降低生活质量，并加重社会经济负担13。
呼吸道是一个开放系统，持续暴露于外界存在的各种微生物病原体。机会性细菌病原体通常在上呼吸道被检测到，但有时也会出现在下呼吸道14,15。在动物模型中，感染后1小时即可在肺泡囊中检测到P. aeruginosa16。作为主要的防御机制，巨噬细胞或中性粒细胞等免疫细胞可清除呼吸道中的细菌。肺上皮细胞作为第一道生理屏障，在宿主抵御微生物感染过程中发挥独特作用。肺上皮细胞可在不依赖免疫细胞的情况下调节微生物的侵入、定植或复制17。上皮细胞中存在的一些分子（包括PPARg）具有抗菌功能，从而调控细菌在肺上皮细胞中的定植与复制18。吸烟可能改变这些分子并损害肺上皮细胞的正常防御功能19,20。近期研究报道，可使用机器人吸烟装置将香烟烟雾直接暴露于肺上皮细胞21,22。然而，烟雾暴露也可通过其他方式进行，包括应用香烟烟雾提取物（CSE）。制备CSE是一种可重复的方法，也可应用于其他细胞类型，例如间接暴露于香烟烟雾的血管内皮细胞。
本报告描述了一种制备香烟烟雾提取物以改变肺上皮细胞中细菌载量的实验方案。香烟烟雾提取物（CSE）可增加P. aeruginosa的细菌载量，这可能有助于解释慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性加重期间常见的细菌感染复发现象。CSE的制备采用常规方法。处于对数生长期的肺上皮细胞用4% CSE处理3小时。 alternatively，单层培养的肺上皮细胞也可在气液界面直接暴露于香烟烟雾中。经CSE处理的细胞随后以感染复数（MOI）为10的条件接种Pseudomonas。细菌在特定振荡速度下增殖，以确保其鞭毛形态完整，从而保持完全的侵袭能力。使用庆大霉素杀灭培养基中残留的细菌，从而减少后续测定细菌载量时可能发生的污染。该方案还使用了&#160;荧光蛋白标记的Pseudomonas，该标记菌株已被&#160;作为&#160;研究不同模型中Pseudomonas感染的一种有力工具。代表性菌株为P. fluorescens Migula23。CSE处理后的感染程度或细菌载量通过三种方法测定：平板菌落计数法、采用Pseudomonas特异性16S rRNA引物的定量PCR，或对感染荧光标记Pseudomonas的细胞进行流式细胞术分析。该方案是一种简单且可重复的研究香烟烟雾对肺上皮细胞中细菌感染影响的方法。

<table><tbody><tr><td>50 mL 注射器</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>气道上皮细胞基础培养基</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>细菌摇床</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>支气管上皮细胞生长试剂盒</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高容量 RNA 反转录为 DNA 试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES 培养基</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2004</td><td></td></tr><tr><td>人 BEAS-2B 细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>人原代小气道上皮细胞</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>LSRII 流式细胞仪</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikkon 共聚焦显微镜</td><td>Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OD 读数仪</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>ATCC</td><td>ATCC 47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>Pseudomonas fluorescens Migula</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>科研级香烟 (3R4F)</td><td>肯塔基大学</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>透明 PET Transwell 小室</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆肉汤</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

研究香烟烟雾对肺上皮细胞中pseudomonas感染的影响

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

吸烟是肺气肿和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要病因。吸烟还会增加呼吸系统对细菌感染的易感性。然而，吸烟对人肺上皮细胞中细菌感染的影响尚未得到充分研究。本文描述了一种制备香烟烟雾提取物（CSE）、处理人肺上皮细胞并进行细菌感染及感染检测的详细实验方案。CSE采用常规方法制备。肺上皮细胞用4% CSE处理3小时。随后，用感染复数（MOI）为10的Pseudomonas感染经CSE处理的细胞。通过三种不同方法测定细胞内的细菌载量。结果表明，CSE可增加肺上皮细胞中Pseudomonas的细菌载量。因此，该方案为研究香烟烟雾对肺上皮细胞细菌感染的影响提供了一种简单且可重复的方法。

使用示意图来说明该实验方案 图1肺上皮BEAS-2B细胞经CSE处理后进行挑战 假单胞菌. 假单胞菌 培养基中的细菌被添加的庆大霉素杀死，随后细胞进行滴板法检测和RT-qPCR检测 假单胞菌 核糖体16S RNA，以及流式细胞术。与对照组相比，CSE处理在滴板法中显著增加了细菌感染图2）。相应地，CSE 影响了人小气道上皮细胞（HSAEC）中的细菌载量（图3）。细胞在4% CSE处理3小时后活力未发生显著变化，在1小时时 假单胞菌 感染，或经 1 h 的庆大霉素处理（图4 图5 图6）。以16S rRNA为靶标的RT-qPCR方法（图7）以及流式细胞术（...

本文介绍了一种研究香烟烟雾提取物如何影响肺上皮细胞中细菌定植的实验方案。

研究香烟烟雾对肺上皮细胞中Pseudomonas感染的影响

吸烟是肺气肿和慢性阻塞性肺疾病（COPD）的主要病因。吸烟还会促进……

本方案采用三种方法来确定香烟烟雾是否影响肺上皮细胞中假单胞菌的细菌载量。该方法可扩展至内皮细胞或其他细胞类型。本视频详细描述了香烟烟雾提取物的制备、细菌感染以及细菌载量测定的过程。此操作步骤对于新用户而言非常易于遵循。用60毫升注射器吸取10毫升无血清细胞培养基。将修剪过的1毫升移液器吸头窄端连接至注射器喷嘴，作为固定香烟的适配器。取下香烟的过滤嘴，将香烟连接到适配器上。在进行检测前不超过30分钟点燃香烟，并将40毫升含烟雾的空气抽入注射器中。通过剧烈振荡注射器，使烟雾与培养基充分混合。重复抽吸过程，直至香烟完全燃尽，大约需要在七分钟内抽吸11次。为去除培养基中的微生物和不溶性颗粒，需通过0.22微米滤膜过滤培养基。然后将培养基转移至封闭的无菌试管中。用选定的假单胞菌菌株接种胰蛋白胨大豆肉汤或TSB增菌平板。在37摄氏度下将平板培养过夜。准备一支含有20毫升TSB并以5%甘油作为碳源的试管。从钻板上采集涂片并接种至TSB中。将假单胞菌悬液在37°C、200 RPM条件下于摇床中孵育约一小时，直至其在600纳米处的光密度达到0.6。按照文中所述方法培养肺上皮细胞后，向细胞中加入1毫升0.25%胰蛋白酶。大约五分钟后，当细胞完全从培养板底部脱落时，加入 10 毫升完全 Heights 培养基以中和胰蛋白酶。将细胞转移至 15 毫升离心管中。随后，在 4°C 条件下以 300 × g 离心五分钟，弃去上清液。然后，将细胞重悬于含有10% FBS的Heights培养基中，体积为毫升级。取10微升上皮细胞悬液，用移液器接种至新培养板中。使用自动细胞计数仪测定细胞浓度。将肺上皮细胞以每毫升3×10⁵个细胞的浓度接种，每孔加入总体积为2毫升的培养基。将培养板置于培养箱中过夜。当细胞融合度达到约80%时，弃去原培养基，更换为含1% FBS的Heights培养基。然后，向孔中加入 4% CSE，并将培养板孵育三小时。向经 CSE 处理的肺上皮细胞各孔中加入假单胞菌。随后，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育培养板一小时。接着，用含有4% CSE和100微克/毫升庆大霉素的2毫升新鲜Heights培养基替换六孔板中的原有培养基。将六孔板在37°C、5% CO₂条件下孵育1小时后，吸去各孔中的培养基。用2毫升冷PBS对经庆大霉素处理的细胞洗涤两次。随后可通过平板落点法、定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）或流式细胞术检测肺上皮细胞中的细菌载量。向每孔肺上皮细胞中加入一毫升细胞裂解缓冲液。对细胞裂解液进行系列稀释，稀释比例范围从1:10至1:10,000。然后接种TSB琼脂平板。孵育16小时后，通过计数细菌菌落数量，确定肺上皮细胞中存在多少菌落形成单位。向每孔肺上皮细胞中加入0.35毫升胍基盐酸硫氰酸裂解缓冲液。使用细胞刮收集细胞。用移液器将裂解液转移至微量离心管中，并轻轻吹打混匀。向裂解液中加入 0.35 毫升新配制的 70% 乙醇，并充分混匀。将所有样品转移至置于2毫升收集管中的离心柱中。在20至25摄氏度下，以10,000 × g离心收集管30秒。弃去收集管中的缓冲液，并用0.7毫升洗涤缓冲液清洗离心柱。将离心柱在10,000 × g条件下离心30秒。用0.5毫升缓冲液洗涤离心柱两次。再次在10,000 × g条件下离心2分钟。将柱子放入一个新的1.5毫升收集管中，加入30至50微升无RNase的水。在10,000 × g离心1分钟后，收集流出液并测定RNA浓度。为进行20微升逆转录反应做准备，取1微克总RNA，加入10微升反应缓冲液、1微升逆转录酶和无RNase的水。按照制造商的说明书，在 37 摄氏度下进行逆转录反应 1 小时，然后在 95 摄氏度下反应 5 分钟。随后，将每份 cDNA 样品各取 1 µL 与含有 cyber 染料的 5 µL 主混合液以及每种 200 纳摩尔特异性引物各 1 µL 混合。加水至总体积为 20 µL。按照制造商的说明进行PCR分析，然后使用比较CT法测定表达水平。在BEAS-2B细胞中，当细胞用4% CSE处理3小时后，细胞活力未发生显著变化。一小时的假单胞菌感染也未对细胞活力产生显著影响。最后，使用庆大霉素清除培养基中的假单胞菌，对细胞活力未产生具有统计学意义的影响。通过平板菌落计数法测定，CSE处理显著增加了BEAS-2B细胞中的细菌感染水平。香烟烟雾提取物（CSE）对人小气道上皮细胞（HSAEC）的处理也表现出相同的结果。通过使用RT-PCR定量检测16S rRNA的含量，评估了经CSE处理的BEAS-2B细胞的细菌感染情况，结果显示铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）增加。经CSE处理并感染荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens Migula）的BEAS-2B细胞在509纳米波长下通过流式细胞术进行分析。结果还表明，CSE 处理会增加细菌感染。荧光显微镜结果显示，在荧光假单胞菌 Migula 感染实验中，GFP 标记的细菌与 BEAS-2B 细胞共定位。可通过机器人吸烟的方式使细胞暴露于香烟烟雾中，这种方法可能模拟人类行为，从而能够直接研究香烟烟雾对肺上皮细胞的影响。该技术可用于在肺部感染的背景下，探究香烟烟雾对其他细胞类型的影响。所述方法可为开发针对吸烟所致肺损伤及慢性阻塞性肺疾病（COPD）的有效疗法提供基础。

studying-effects-cigarette-smoke-on-pseudomonas-infection-lung

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

香烟烟雾对肺 癫痫细胞 伪多多多细胞的影响研究

肺上皮细胞可从小鼠呼吸道分离，并在气液界面培养，作为分化型呼吸道上皮的模型。本文描述了一种分离、培养这些细胞并将其暴露于主流香烟烟雾的实验方案，以研究细胞对这种环境毒素的分子响应。...

小鼠呼吸道上皮细胞的分离及在气液界面暴露于实验性香烟烟雾

来源：Li, T., et al. 研究香烟烟雾对肺上皮细胞中 Pseudomonas 感染的影响。 J. Vis. Exp.

分析香烟烟雾对肺上皮细胞抗菌防御功能的影响

我们描述了利用琼脂珠方法在小鼠模型中建立持续性长期慢性Pseudomonas...

长期慢性 铜绿假单胞菌 小鼠呼吸道感染

本实验方案旨在提供一种自动化方法，用于量化慢性阻塞性肺疾病（COPD）小鼠模型中的慢性肺部病理变化。该方案包括将小鼠暴露于香烟烟雾（CS）中、测定肺功能、灌注膨胀肺组织，以及采用形态计量学方法测量小鼠肺气肿和小气道重塑情况。...

香烟烟雾暴露小鼠肺气肿及小气道重塑的自动化测量

本实验方案的目的是在气液界面条件下，将人源类器官三维支气管和鼻组织模型暴露于香烟主流烟雾（CS）中。随后通过细胞色素P450活性检测、纤毛搏动测量以及系统生物学方法，评估烟雾对组织的影响。...

反复暴露于全烟雾对支气管和鼻部类器官三维组织培养模型的影响评估

通过优化的人类外周血单个核细胞（PBMC）ex vivo...

评估可燃性烟草产品制剂细胞毒性和免疫抑制作用的方法

尽管 体外 宿主-病原体相互作用的研究有助于表征特定的免疫应答， 体内 需要使用模型来观察复杂反应的影响。 白色念珠菌 暴露后...

研究微生物群落 体内宿主介导的相互作用模型 白色念珠菌 和 铜绿假单胞菌 在气道中

本文介绍了一种用于肺组织固定的实用方案，可为源自肺气肿小鼠模型的肺组织样本提供稳定的条件，以便进行组织学评估。该方法的主要优势在于，能够在相同恒定压力下固定多个肺组织，且不会导致肺组织塌陷或萎陷。...

恒定压力下肺固定用于评估小鼠肺气肿

本方案展示了利用自行构建的全身吸入（WBI）暴露系统（WBIS）研究香烟烟雾（CS）病理生理效应的方法。该系统可在可控且可重复的条件下使动物暴露于香烟烟雾中，用于研究香烟烟雾对肺气肿和造血功能的影响。...

使用全身体吸入系统使小鼠暴露于香烟烟雾

本文介绍一种可重复、经济且稳健的方法，用于分离和扩增原代支气管上皮细胞，以实现长期生物样本库保存，并通过气液界面培养生成分化成熟的上皮细胞。...

从切除的肺组织中分离支气管上皮细胞用于生物样本库建设及建立高度分化的气液界面培养模型

用于研究香烟烟雾提取物刺激下小鼠气道上皮细胞分化及多组学变化的体外模型

了解香烟烟雾提取物对肺上皮细胞中铜绿假单胞菌定植影响的研究方法。该方案提供制备烟雾提取物、细菌感染和细菌负荷测定的详细步骤，可用于评估烟雾暴露后的细菌负载变化，为研究呼吸道健康与吸烟相关性提供可重复的技术基础。

研究香烟烟雾对肺上皮细胞中Pseudomonas感染的影响

探索更多视频