Name: 分离中枢神经系统组织和相关脑膜，用于免疫细胞的下游分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学习从中枢神经系统快速分离脑、脊髓和脑膜组织的方法，用于免疫细胞表型分析和功能研究。该技术适用于稳态和病理条件下的细胞定位检测，为神经免疫学研究提供高效实验方案。

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作者感谢达特茅斯比较医学与研究中心（CCMR）工作人员在本研究中对实验小鼠的精心照料。本研究由博恩斯坦研究基金资助。

所有动物实验均采用达特茅斯盖泽尔医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）审查并批准的方案。
1. 脑和脊髓样本的脱钙处理
<ol>
	<li>分离脑和脊髓样本
	<ol>
		<li>通过吸入 CO2 对小鼠实施安乐死。确保 CO2 气流速度每分钟置换笼内体积的 10%–30%。</li>
		<li>使用镊子提起剑突，并用剪刀在肋骨下方沿侧向剪开腹壁，向上提起以避免剪破下方的血管或器官。沿侧向剪开膈肌。</li>
		<li>沿肋骨两侧平行于肺部向上剪至锁骨处，剪开肋骨笼。用镊子提起胸骨，并用止血钳夹住胸骨。将止血钳越过头部，向上提起肋骨笼以暴露心脏。</li>
		<li>用镊子夹住心脏心尖附近，于右心房做切口以提供流出通道。将连接有 10 mL 注射器的 25 G 针头插入左心室，缓慢注入 10 mL 冰冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），进行经心脏灌注。 
		注意：灌注应持续 4–5 分钟，直至肝脏血液排净。通常 10 mL 的 1× PBS 已足够完成灌注，必要时可增加用量。肝脏变透明通常表明灌注充分。</li>
		<li>使用锋利的剪刀通过断头法切除头部（图 1；1）。沿中线剪开皮肤（图 1；2），将皮肤翻过眼睛以暴露颅骨。</li>
		<li>在鼻骨处剪开，使下颌骨与颅骨分离（图 1；3）。移除下颌骨、舌头和眼球。沿颅骨侧面剪开，使组织从外耳道处松解（图 1；4）。修剪并去除覆盖在颅骨上的所有多余皮肤、肌肉和组织。</li>
		<li>用锋利的剪刀沿脊柱平行剪开，将肋骨笼与脊柱分离（图 1；5 和 6）。在下腰部区域做一小切口以分离脊柱（图 1；7）。修剪并去除脊柱上残留的所有肌肉，以暴露椎骨（图 1；8）。 
		注意：去除脊柱和颅骨上的多余组织，是确保固定剂多聚甲醛（PFA）和乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙缓冲液充分渗透的必要步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>后固定、脱钙与冷冻保存
	<ol>
		<li>用镊子将带有完整颅骨的脑组织或脊柱放入含有 10 mL 4% 多聚甲醛（PFA）的 15 mL 圆底管中。将管子置于 4 ˚C 下至少 48 小时，以实现充分固定。 
		注意：为避免组织过度固定，固定时间不应超过 72 小时。骨组织在脱钙前需延长固定时间。充分的固定可保护组织免受脱钙过程的影响，并确保更好的组织形态。</li>
		<li>用镊子将脑或脊髓组织从 4% PFA 中取出，放入含 10 mL 1× PBS 的一次性 14 mL 管中，清洗 5 分钟。随后将脑或脊髓转移至含 10 mL 10% EDTA（pH = 7.2–7.4）的 50 mL 圆底管中。 
		注意：使用较大的管子并加入 10 mL EDTA 可增加 EDTA 与组织的接触面积，从而加快脱钙过程。</li>
		<li>每日检查骨组织是否变软且具有可塑性：用镊子将组织从 EDTA 溶液中取出，置于培养皿中，用 25 G 针头轻轻测试骨的软度。若针头可轻松刺入骨组织，则表明脱钙已完成。</li>
		<li>将组织从 EDTA 溶液中取出，转移至含 10 mL 1× PBS 的一次性 14 mL 管中，清洗 10 分钟。重复清洗一次。 
		注意：脱钙通常需要 2–3 天。若骨组织尚未充分脱钙，应每 2–3 天更换一次溶液。然而，骨组织脱钙完成后若长时间继续孵育于 EDTA 中，可能损害组织形态。</li>
		<li>通过将蔗糖加入 1× PBS 中，配制 10%、20% 和 30% 的蔗糖溶液。例如，配制 10% 蔗糖溶液时，加入 10 g 蔗糖，并用无菌 1× PBS 定容至 100 mL。溶液可于 4 ˚C 保存最多 1 个月。 
		注意：蔗糖溶液易滋生微生物，因此样本不应在这些溶液中长期保存。</li>
		<li>将组织从 1× PBS 中取出，放入含 10 mL 10% 蔗糖溶液的管中，于 4 ˚C 保存。静置 24 小时或直至组织沉至管底。</li>
		<li>重复此过程，先将组织转移至 20% 蔗糖溶液，最后转移至 30% 蔗糖溶液。待组织在 30% 蔗糖溶液中沉底（至少 24 小时）后，进行组织包埋。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织包埋与冷冻
	<ol>
		<li>用镊子将组织从 30% 蔗糖溶液中取出，置于培养皿上，倾斜培养皿以去除组织表面多余的蔗糖溶液。使用手术刀将组织切成所需片段。</li>
		<li>在冷冻模具底部涂一层薄薄的包埋剂（OCT 化合物），将组织块放入模具中。用 OCT 化合物完全覆盖组织，确保无气泡产生。</li>
		<li>通过将模具悬于液氮上方38，或置于 100% 异丙醇/干冰混合物39中，快速冷冻组织块，直至组织块变为不透明。用铝箔包裹冷冻模具，于 -80 ˚C 长期保存。切片前将组织块转移至 -20 ˚C。 
		注意：对脱钙后的脑组织进行切片和组织学操作时需格外小心，若操作粗暴，可能导致颅骨和脑膜层丢失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 用于流式细胞术染色的脑膜和中枢神经系统组织的制备
<ol>
	<li>取出颅骨盖和脑组织
	<ol>
		<li>使用锋利的剪刀，通过剪头术去除头部（图2A；1）使用剪刀在皮肤上做一条正中切口（图2A；2）将眼周皮肤翻起以暴露颅骨。</li>
		<li>将剪刀置于枕骨大孔处，沿大脑皮层向嗅球方向横向剪开颅骨，切口需保持在外耳道和下颌骨上方图2A；3）在对侧进行相同的切口，使切口于嗅球处相接，从而将颅骨帽与脑组织分离（图2A; 3).</li>
		<li>用镊子掀开颅骨盖，将其放入含有5 mL冷的添加25 mM HEPES的RPMI培养基的15 mL锥形管中。将管子置于冰上保存。</li>
		<li>使用弯头镊子，将镊子置于脑组织基底部下方，轻轻上提以分离脑组织与颅骨。将脑组织放入含有5 mL冷RPMI培养基（添加25 mM HEPES）的15 mL锥形管中。处理前将锥形管置于冰上保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>提取脊柱和脊髓组织
	<ol>
		<li>使用镊子和锐利的剪刀，沿脊柱平行方向剪开，将肋骨与脊柱分离（图2A；4 和 5）。在腰椎下部区域做一个小切口，以分离椎柱（图2A；6）修剪并去除脊柱上残留的肌肉，以暴露椎骨（图2A; 7).</li>
		<li>将超精细手术剪插入脊柱内，沿脊柱侧缘进行剪切图2C将对侧的侧缘完全切断，以将脊柱分为前部和后部两部分。 
		注意：脊髓将保持与脊柱相连。</li>
		<li>使用镊子缓慢而小心地将脊髓从椎骨上剥离，并将组织放入含有5 mL含25 mM HEPES的冷RPMI的15 mL圆锥形离心管中。将椎骨的前部和后部转移至另一含有5 mL含25 mM HEPES的冷RPMI的15 mL圆锥形离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去除脑膜以制备单细胞悬液
	<ol>
		<li>使用镊子从RPMI培养基中取出颅骨盖。使用尖头镊子（#7镊子； 材料表），在颅骨盖的外缘进行划痕图2B）并从颅骨盖边缘剥离脑膜，刮除硬脑膜和蛛网膜。将脑膜置于培养皿中。 
		注意：去除脑和脊髓的脑膜需要一定操作经验。如果操作者在提取脑膜时遇到困难，可使用解剖显微镜辅助去除。</li>
		<li>从管中取出脊柱。用尖头镊子在脊柱边缘划开，以分离硬脊膜，再用弯头镊子从椎骨边缘剥离并移除硬脊膜。将剥离的硬脊膜置于培养皿中。</li>
		<li>将尼龙网筛置于50 mL锥形管中。将脑膜组织移入网筛，加入3 mL添加了25 mM HEPES的RPMI培养基。使用5 mL注射器的推杆将组织和培养基研磨通过网筛。</li>
		<li>使用5 mL血清移液管，用额外的2至3 mL RPMI/HEPES培养基冲洗滤网，直至所有可见组织均通过滤网。 
		注意：为了获得足够的细胞数量用于流式细胞术分析，可能需要将多个动物的脑膜组织合并在一起。在本实验中（图3 和 图4），4至5只小鼠的脑和脊髓脑膜被合并在一起。如果样本需要合并，则需额外添加培养基，以便通过尼龙网筛研磨组织，防止组织过热。</li>
		<li>使用10 mL血清移液管，将细胞和培养基转移至新的15 mL离心管中。使用10 mL血清移液管，用5 mL培养基冲洗50 mL离心管，以收集残留的细胞。在450 x g 4 °C下离心5分钟以收集细胞。</li>
		<li>使用带有真空装置的巴斯德吸管，小心吸取上清液，避免触及细胞沉淀，然后将细胞重悬于适量缓冲液中。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥染料（1:10 稀释）和 RPMI 稀释少量细胞（例如 5–10 µL）以计数单细胞悬液。取 10 µL 稀释后的细胞悬液加入血细胞计数板。</li>
		<li>按照之前所述方法计数细胞40,41至少取两个16平方格进行平均，以确保准确性。 
		注意：在 图3例如，将来自脑膜的混合并离心后的细胞沉淀重悬于250 µL荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液（含1% FBS的1×PBS）中，用于后续表面染色。细胞按1:10比例稀释后进行计数（5 µL细胞悬液，5 µL台盼蓝，40 µL RPMI）。该稀释比例使每16个方格内细胞数维持在50–100个之间，确保细胞计数更加准确，避免细胞过于密集重叠或过于稀疏。每只小鼠脑和脊髓脑膜组织混合后所得有核细胞计数如下：假手术处理小鼠脑膜细胞数为100,000–150,000个，Theiler’s小鼠脑脊髓炎病毒诱导的脱髓鞘疾病（TMEV-IDD）小鼠脑膜细胞数为300,000–350,000个。细胞计数结果可能因样本采集与处理的精确程度以及是否存在脑膜炎症而有所差异。</li>
		<li>进行所需的单细胞技术，例如FACS表面图3)14,36,42,43,44细胞内染色实验方案33,45体外刺激，细胞培养实验33,46,47ELISPOT 检测28,34,35，以及批量或单细胞转录组学37,48. 
		注意：在处理步骤之间，所有离心管均需置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备脑和脊髓组织的单细胞悬液
	<ol>
		<li>将含有组织的培养基从离心管中倒入100 mm培养皿的上部，转移脑或脊髓组织。用镊子将组织移至培养皿底部。用无菌剃刀刀片将脑或脊髓组织切碎。用剃刀刀片轻轻刮取，将切碎的组织收集并移至培养皿底部。 
		注意：在以下酶消化方案中，最多可将两条脊髓合并处理。脑组织应单独处理。</li>
		<li>使用5 mL刻度移液管，向培养皿中加入3 mL添加了10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基。使用10 mL刻度移液管反复吹打，使组织在培养基中充分重悬，然后转移至15 mL锥形离心管中。 
		注意：如果下游应用为单细胞或批量RNA测序分析或细胞培养，应检测FCS批次，以确保细胞在分析前未被激活。或者，可使用含0.04% BSA的1×PBS替代含10% FCS的RPMI进行细胞处理。</li>
		<li>使用10 mL血清移液管，用额外2 mL培养基冲洗培养皿，以收集残留组织，并转移至锥形管中，使总体积达到5 mL。在处理步骤间将试管置于冰上保存。</li>
		<li>使用移液器将胶原酶I粉末用Hank's平衡盐溶液（HBSS）培养基重悬，以获得所需浓度（例如，100 mg/mL）。将I型胶原酶加入含有剪碎组织样本的锥形管中，以达到所需的终浓度（例如，1 mg/mL时加入50 µL）。 
		注意：较高的胶原酶浓度可提高细胞得率，但可能导致细胞表面标志物被切割。因此，应进行胶原酶I批号的滴定实验，以确定获得最多活细胞且所有目标细胞表面标志物保持完整的最佳浓度。例如，在单个脑组织或脊髓样本上测试了胶原酶I在终浓度为0.5 mg/mL、1 mg/mL和2 mg/mL时的效果。通过台盼蓝排斥法检测细胞活力，并采用流式细胞术评估细胞表面标志物CD45、CD19和CD4的表达情况。结果显示，1 mg/mL的胶原酶I浓度可获得最高的活细胞数，同时保留所有关注的细胞表面标志物。因此，在后续针对这些细胞类型的研究中均采用该浓度。</li>
		<li>轻轻用0.15 M氯化钠溶解DNase I粉末，配制成所需储存浓度。将重悬的DNase I加入含有剪碎组织样本的锥形管中，使其终浓度为20 U/mL。 
		注意：DNase I 不同批次的每毫升活性单位存在差异。根据原液每毫升的活性单位，需调整加入组织样本中的浓度。每个样本的最终目标浓度为 20 U/mL。</li>
		<li>将试管放入37 °C水浴中的试管架，孵育40分钟。每15分钟颠倒混匀一次，使组织与酶充分混合。孵育结束后，向每支试管中加入500 µL 0.1 M EDTA（pH = 7.2），使EDTA终浓度为0.01 M，再继续孵育5分钟以灭活胶原酶。</li>
		<li>使用10 mL血清移液管，向每根试管中加入9 mL添加了10% FCS的RPMI，使每根试管的总体积达到约14.5 mL。在450 x g 在 4 ˚C 下离心 5 分钟。使用带负压的巴斯德吸管小心吸去上清液，避免接触细胞沉淀。</li>
		<li>使用5 mL血清移液管，向含有细胞沉淀的离心管中加入3 mL 100%原液等渗密度梯度溶液。使用10 mL血清移液管，加入额外的RPMI 10% FCS培养基，使终体积达到10 mL，并重悬细胞沉淀，形成30%原液等渗密度梯度溶液层。 
		注意：提前配制100%储存用等渗密度梯度介质，分装后于4 °C保存，可稳定存放长达3个月。配制100%储存用等渗密度梯度溶液时，需将密度梯度介质（材料表) 用密度梯度介质稀释缓冲液。配制密度梯度介质稀释缓冲液（80.0 g/L NaCl，3.0 g/L KCl；0.73 g/L Na2HP04，0.20 g/L KH2HP04；20.0 g/L 葡萄糖），使用真空过滤系统过滤除菌。通过将1份密度梯度稀释缓冲液与9份密度梯度介质混合，配制100%储存液密度梯度溶液，充分混匀。</li>
		<li>在加入70%储备等渗密度梯度溶液作为下层液之前，先将每支试管充分颠倒混匀。取一支含有1 mL 70%储备等渗密度梯度溶液的1 mL血清学移液管，插入试管底部。缓慢将1 mL溶液作为下层液加入，注意避免产生气泡。然后缓慢将血清学移液管从试管中取出，注意不要破坏形成的梯度。 
		注意：配制70%下层液时，应使用RPMI培养基将100%等渗密度梯度溶液稀释至70%（即取7 mL 100%等渗密度梯度溶液与3 mL RPMI培养基充分混合）。此外，制备干净且未受扰动的70%下层液对于去除髓鞘碎片以及在离心后从梯度界面获得纯净的单细胞悬液至关重要。</li>
		<li>800 x g 离心 g 在4 °C下以无刹车条件离心30分钟。吸除上清液，包括髓鞘碎片层，直至管中剩余2–3 mL，注意不要扰动细胞层。使用1 mL移液器收集位于30/70%密度梯度之间的细胞层，并转移至新的15 mL锥形管中。</li>
		<li>使用10 mL血清移液管加入含10%胎牛血清的RPMI培养基，使终体积达到15 mL。450 × g离心 g 4 °C下离心5分钟。 
		注意：如有需要，可将两个试管中的细胞层合并。切勿合并超过两个试管，否则由于高密度梯度介质浓度过高，细胞无法形成沉淀。</li>
		<li>小心吸去上清液，避免扰动细胞沉淀。用适当体积的缓冲液重悬细胞，以便使用血细胞计数板进行细胞计数（例如，将一条脊髓组织重悬于 250 µL FACS 缓冲液中，用于后续表面染色）图3).</li>
		<li>使用1 mL移液器，将细胞悬液转移至带滤膜的上部滤管顶部（材料表）并静置，使细胞沉降至管底，以去除任何残留的髓鞘碎片。</li>
		<li>使用台盼蓝排斥染料对细胞进行稀释，并在血细胞计数板上计数，为确保准确性，至少取两个16方格区域的平均值40,41.</li>
		<li>采用所需的单细胞分析技术进行后续操作。 
		注意：使用不同类型的胶原酶（如胶原酶D、I型、II型、IV型）、免疫细胞、小胶质细胞（图3）、星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞49和神经元50 均可高效分离。使用滴定后的胶原酶I酶消化获得的有核细胞计数结果如下：假手术处理全脑 = 500,000–600,000 个细胞；TMEV-IDD 全脑 = 800,000–1,000,000 个细胞；假手术处理全脊髓 = 150,000–200,000 个细胞；TMEV-IDD 全脊髓 = 300,000–400,000 个细胞。细胞计数结果可能因取材与处理操作的精确性以及中枢神经系统是否存在炎症而有所差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在稳态和疾病状态下评估中枢神经系统（CNS）区室中细胞组成的多种方法，对于理解CNS的生理与病理状态至关重要。然而，尽管脑膜在CNS中发挥着重要的屏障作用，并容纳了多种多样的免疫细胞，但由于许多传统的脑和脊髓组织提取方法无法保留这些膜结构，脑膜常常被排除在分析之外。这种遗漏严重限制了我们对脑膜细胞组成及其在稳态与炎症条件下功能的认知进展。近期研究表明，存在于脑膜区室中的常驻免疫细胞以及外周来源的免疫细胞，在维持CNS稳态以及驱动CNS疾病发病机制中均发挥着关键作用。这些研究强调了不仅需要分析实质区室，还必须同时分析周围脑膜层的重要性。本文所述的实验方案可实现脑和脊髓的快速分离，同时完整保留脑膜，从而最终能够利用组织学和单细胞分析技术对CNS区室进行全面的下游分析。代表性结果聚焦于评估CNS区室中的免疫细胞；然而，该方案也可根据需要调整，用于分析小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、周细胞、内皮细胞或其他CNS常驻细胞。
所述方法中的关键步骤是组织的精细提取，这对于从脑、脊髓和脑膜中分离出纯净的单细胞悬液，以及获取带有完整颅骨或脊柱的中枢神经系统组织至关重要，后者可实现高质量的组织形态学...

中枢神经系统（CNS）是一个具有免疫特殊性的部位。传统上认为，CNS 实质（不包括脑脊液空间、脑膜和脉管系统）属于免疫豁免部位1,2,3,4,5，在稳态条件下其免疫细胞相对匮乏2,6,7。相比之下，由硬脑膜、蛛网膜和软脑膜组成的脑膜是 CNS 区室的关键组成部分，在疾病发生过程中的稳态免疫监视和炎症反应中发挥重要作用3,6,7,8。在稳态条件下，脑膜中存在大量免疫哨兵细胞，包括固有淋巴样细胞（ILC）、巨噬细胞、树突状细胞（DC）、肥大细胞、T 细胞，以及少量的 B 细胞9,10,11。
脑膜是高度血管化的结构，含有淋巴管，为中枢神经系统（CNS）与其周围组织之间提供了淋巴连接8,12,13,14。在由中枢神经系统损伤、感染、自身免疫或甚至神经退行性病变所引发的炎症状态下，外周来源的免疫细胞会浸润实质组织，并改变脑膜内的免疫环境。在细胞浸润之后，脑膜可能成为外周来源免疫细胞的功能性生态位，促进免疫细胞的聚集、局部免疫细胞的活化以及在中枢神经系统区域的长期存活。明显的脑膜炎症可见于多种影响中枢神经系统的疾病中，包括多发性硬化症（MS）15,16,17,18,19、脑卒中20,21、无菌性损伤22,23（例如脊髓损伤和创伤性脑损伤）、偏头痛24以及微生物感染25,26,27,28,29。因此，对脑膜区室中常驻细胞及外周来源免疫细胞的特征进行表征，对于理解这些细胞在稳态条件和疾病发生过程中的作用至关重要。
从颅骨和椎体中提取脑、脊髓及脑膜在技术上具有挑战性且耗时较长。目前尚无能够快速完整保留三层脑膜的情况下提取脑组织的技术。虽然椎板切除术可以获得良好的脊髓组织形态并保留脑膜层，但该方法极为耗时且操作复杂30,31。相比之下，更传统的提取方法，如直接从颅腔中取出脑组织或采用液压法挤出脊髓，虽可实现中枢神经系统（CNS）组织的快速提取，但这些方法均会导致蛛网膜和硬脑膜的丢失30,31。在常规脑和脊髓组织分离过程中遗漏硬脑膜和蛛网膜，将导致对中枢神经系统腔室内细胞的分析不完整。因此，开发专注于快速提取并完整保留脑膜的中枢神经系统组织的新技术，对于全面分析中枢神经系统腔室至关重要。
本论文介绍了两种快速提取小鼠脑、脊髓和脑膜的方法，有助于对中枢神经系统实质和脑膜中的常驻细胞及外周来源的免疫细胞进行后续分析。这些优化的实验方案主要聚焦于：1）制备用于下游分析的单细胞悬液；2）组织样本的组织学处理前准备。从脑、脊髓组织以及硬脑膜和蛛网膜脑膜32中获得单细胞悬液，可实现对实质和脑膜区室中细胞的同步分析。单细胞悬液可用于多种应用，包括细胞培养实验以进行体外刺激33、酶联免疫斑点（ELISpot）28,34,35、流式细胞术36,33，以及单细胞37或群体转录组学分析。此外，针对保留颅骨或椎体的完整脑和脊髓组织所优化的脱钙方案，可温和地去除周围骨组织，同时保持脑膜完整并保存组织形态结构。该方法可用于在实质和脑膜区域中，通过免疫组织化学（IHC）或原位杂交（ISH）技术选择性地鉴定蛋白质或RNA的表达。对中枢神经系统内常驻细胞及外周来源免疫细胞的表型、活化状态及其定位特征进行表征，可能为理解中枢神经系统各细胞类型在稳态维持和疾病发生机制中的作用提供关键信息。

<table><tbody><tr><td>铝箔</td><td>任意</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37002D</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-12R 离心机</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 I</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>锥形管，15 mL</td><td>VWR</td><td>525-1069</td><td></td></tr><tr><td>锥形管，50 mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Hauser Scientific</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>冷冻模具</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>弯头镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-14</td><td></td></tr><tr><td>一次性聚苯乙烯管，14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0595256</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核糖核酸酶 I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>干冰</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #7 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Amresco</td><td>0105-500g</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，100%</td><td>任意</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>带滤膜顶端的管，5 mL</td><td>VWR</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>可固定的活力染料 780</td><td>Becton Dickinson</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（488 标记）</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-546-146</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG（594 标记）</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-586-146</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG 488</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 594</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-585-167</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗大鼠 650</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td></td></tr><tr><td>Hank's 平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Andwin Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td></td></tr><tr><td>HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（无水）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>Airgas</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 FC 封闭剂（CD16/32）</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HP0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;（无水）</td><td>Fisher Chemical</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>针头，25 号</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>正常小鼠血清</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31881</td><td></td></tr><tr><td>尼龙网筛</td><td>VWR</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，20%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td>用 1× PBS 稀释至 4%</td></tr><tr><td>巴斯德吸管，9 英寸，未堵塞</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBS（1×）</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PE 标记大鼠抗小鼠 CD4</td><td>Becton Dickinson</td><td>553730</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 标记大鼠抗小鼠 CD19</td><td>Becton Dickinson</td><td>562329</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 密度梯度介质</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 标记大鼠抗小鼠 CD45</td><td>Becton Dickinson</td><td>550994</td><td></td></tr><tr><td>培养皿，100 mm</td><td>VWR</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>pH 计</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-636-AB150</td><td></td></tr><tr><td>移液器辅助器</td><td>Drummond Scientific Corporation</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>移液器，200 &amp;micro;l</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，200 &amp;micro;l</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1816</td><td></td></tr><tr><td>移液器，1 mL</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 Prolong Diamond 封片剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>纯化大鼠抗小鼠 CD16/CD32</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠 CD3（SP7 克隆）</td><td>Abcam</td><td>ab16669</td><td></td></tr><tr><td>兔抗小鼠层粘连蛋白</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 ERT-R7</td><td>Abcam</td><td>ab51824</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，1 mL</td><td>VWR</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，10 mL</td><td>VWR</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>血清移液管，5 mL</td><td>VWR</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher Chemical</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-16</td><td></td></tr><tr><td>手术剪刀，超精细</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>注射器，10 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>注射器，5 mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>真空过滤系统</td><td>Millipore</td><td>20207749</td><td></td></tr><tr><td>真空瓶</td><td>Thomas Scientific</td><td>5340-2L</td><td></td></tr><tr><td>真空在线过滤器</td><td>Pall Corporation</td><td>4402</td><td></td></tr><tr><td>真空管线</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06414-20</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Versa bath</td><td></td></tr></tbody></table>

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

中枢神经系统（CNS）由脑和脊髓组成，其外层被脑膜包裹。脑膜是一层膜状结构，作为外周与中枢神经系统之间的屏障。中枢神经系统是一个具有免疫特殊性的部位，在稳态条件下，免疫豁免特性在CNS实质中尤为明显。相比之下，脑膜中则含有多种常驻细胞，包括固有免疫细胞和适应性免疫细胞。在由中枢神经系统损伤、自身免疫、感染甚至神经退行性病变所引发的炎症状态下，外周来源的免疫细胞可能进入实质，并定植于脑膜中。这些细胞被认为在中枢神经系统疾病的发生过程中发挥着有益和有害的双重作用。尽管已有上述认识，但在分析中枢神经系统区室时，脑膜常常被忽视，因为传统的中枢神经系统组织提取方法通常忽略了脑膜层。本实验方案提供了两种不同的方法，用于快速分离小鼠中枢神经系统组织（即脑、脊髓和脑膜），适用于后续的单细胞技术、免疫组织化学以及原位杂交等分析方法。所述方法可实现对中枢神经系统组织的全面分析，适用于评估在稳态条件及疾病发生过程中占据中枢神经系统区室的细胞的表型、功能和定位。

本项代表性实验旨在定量分析B细胞和T细胞，并描述在稳态条件下以及小鼠进行性多发性硬化模型（即TMEV-IDD）中，脑膜和实质中枢神经系统区室中B细胞和T细胞的定位情况。TMEV-IDD模型通过向5周龄雌性SJL小鼠颅内接种5 × 106斑块形成单位（PFU）的TMEV BeAn病毒建立，具体方法如前所述29。
本研究在感染后第120天评估了慢性TMEV-IDD期间脑膜、脑和脊髓中的B细胞和T细胞。以年龄匹配的假手术处理小鼠作为对照。研究包括两个实验：第一个实验旨在获取单细胞悬液，用于流式细胞术分析，这是一种通过检测细胞表面和/或细胞内抗原来分析和定量细胞组成的成熟技术（假手术组n = 4；TMEV-IDD组n = 5）；第二个实验则利用脱钙处理的脑和脊髓组织进行免疫组织化学染色，以描述B细胞和T细胞在中枢神经系统（CNS）中的定位情况（假手术组n = 3；TMEV-IDD组n = 8）。
在分离脑、脊髓以及TMEV-IDD小鼠和假手术处理小鼠的汇集脑膜（脑和...

本文介绍了两种优化的实验方案，用于分析中枢神经系统（包括脑、脊髓和脑膜）中的常驻免疫细胞及外周来源的免疫细胞。这些方案有助于确定在稳态和炎症条件下定位于这些解剖区域的细胞的功能与组成。

中枢神经系统（CNS）由脑和脊髓组成，外包脑膜，脑膜是作为屏障的膜状结构层……

快速分离包括脑膜在内的中枢神经系统组织，可对稳态和致病条件下免疫细胞的表型、功能及定位进行全面分析。文中展示的两种方法可快速提取带有脑膜的中枢神经系统组织，非常适合后续采用单细胞技术和组织学方法进行分析。尽管代表性结果侧重于免疫细胞的分析，但这两种方法也可用于分析中枢神经系统固有细胞，包括小胶质细胞、星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞、基质细胞和神经元。首先从安乐死的小鼠中分离脑组织和脊髓样本。去除头部后，在皮肤正中做一剪口，并将皮肤翻过眼睛以暴露颅骨。在鼻骨处剪断，使下颌骨与颅骨分离。然后去除下颌骨、舌头和眼睛。沿颅骨侧部切开，分离外耳道周围的组织并进行修剪。为采集脊髓样本，使用锋利的剪刀沿脊柱平行方向剪开，将肋骨与脊柱分离。在腰椎下部区域做一个小切口以分离脊柱，然后修剪并去除脊柱上残留的肌肉，暴露椎骨。进行脱钙时，每天检查骨骼，判断其是否变得柔软且有可塑性。用镊子将组织从EDTA溶液中取出，置于培养皿上，用25号针头轻轻测试骨质的软度。如果针头能够轻松刺入骨骼，则表明脱钙过程已完成。为了取出脑部的颅骨盖，需在皮肤正中线做一切口，并将皮肤翻过眼睛。将剪刀插入枕骨大孔，然后沿大脑皮层向两侧剪开颅骨，直至嗅球，注意切口位置应始终位于外耳道和下颌骨上方。在对侧进行相同的切割，切口在嗅球处相接，以将颅骨帽从脑组织上分离。用镊子将颅骨帽剥离，并放入含有5毫升冷RPMI培养基（添加25毫摩尔HEPES）的15毫升锥形管中。将弯镊置于脑底部下方，向上提起，使脑组织脱离颅骨帽。沿脊柱平行切割，将肋骨笼与脊柱分离，从而取出椎骨列和脊髓组织。然后在下腰部区域做一小切口，以分离椎骨列。修剪并去除脊柱上残留的任何肌肉，以暴露椎骨。接下来，将超细外科剪插入脊柱内，沿脊柱侧缘剪开。完全剪断对侧侧缘，将脊柱分为前部和后部。用镊子从脊柱上缓慢而小心地剥离脊髓，并将其放入含有5毫升冷RPMI（含25毫摩尔HEPES）的15毫升锥形管中。然后将脊柱的前部和后部转移至另一管中。为去除颅盖上的脑膜，将颅盖从RPMI培养基中取出，用尖头镊子在颅盖外缘划痕。从颅盖边缘剥离脑膜，刮除硬脑膜和蛛网膜，并将脑膜置于培养皿中。为了去除脊柱上的脑膜，将脊柱从培养基中取出，用尖头镊子在脊柱边缘划开，以分离脑膜。使用弯头镊子从椎骨边缘剥离脑膜，并将脑膜置于培养皿中。在50毫升锥形管中放置一个尼龙网筛。为制备单细胞悬液，将脑膜组织转移至滤网中，加入3毫升含HEPES的RPMI培养基，然后使用5毫升注射器的推杆将组织和培养基研磨通过滤网。将脑或脊髓组织连同培养基倒入100毫米的培养皿中，用镊子将组织移至底部。用无菌剃刀片切碎脑组织，并将组织碎片聚集于培养皿底部。向培养皿中加入3毫升添加了10%FCS的RPMI培养基，然后使用10毫升血清移液管将组织在培养基中重悬，并转移至15毫升锥形管中。向组织中加入I型胶原酶和DNase 1，并将管子置于37°C水浴中孵育40分钟。每15分钟颠倒混匀一次，以确保组织与酶充分混合。孵育后，向每管中加入EDTA，使其终浓度为0.01摩尔，并将各管再孵育5分钟，以灭活胶原酶。向每管中加入9毫升添加了10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基，然后在4摄氏度下以450 ×g离心5分钟。使用连接真空泵的巴斯德吸管吸除上清液，注意不要触碰细胞沉淀。向细胞沉淀中加入3毫升100%原液等渗密度梯度溶液，然后加入额外的RPMI 10%FCS培养基，使最终体积达到10毫升，并重悬细胞沉淀。颠倒并充分混匀试管，然后将一支含有1毫升70%原液等渗密度梯度溶液的血清学移液管插入试管底部。缓慢地将溶液铺于底部，注意避免产生气泡。从试管中取出移液管，注意不要扰动密度梯度。在4°C条件下以800 G离心30分钟，然后吸除上清液（包括髓鞘碎片层），直至试管中剩余2至3毫升液体。使用1毫升移液器收集30%与70%密度梯度之间的细胞层，并将其转移至新的15毫升试管中。加入 RPMI 10%FCS 培养基，使最终体积达到 15 毫升，然后在 4 摄氏度下以 450 ×g 离心 5 分钟。该方案用于评估进展期多发性硬化症期间脑膜、脑和脊髓中的 B 细胞和 T 细胞。通过设门区分来自外周的 CD45 高表达浸润性免疫细胞与 CD45 低表达的小胶质细胞以及 CD45 阴性的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。假手术小鼠的脊髓和脑组织中仅存在少量CD45高表达细胞。在脑膜中采用相同的CD45高表达门控阈值，以鉴定CD45高表达免疫细胞并排除非免疫细胞。在所有TMEV-IDD中枢神经系统组织中，与假手术小鼠相比，CD45高表达免疫细胞的比例均有所增加。在慢性TMEV-IDD期间，脑和脊髓中CD45高表达免疫细胞内B细胞的比例高于脑膜区。对脱钙的脑组织和脊髓进行成像，以确定B细胞和T细胞在中枢神经系统内的定位。常规从颅骨中取出脑组织可保留完整的软脑膜层，但其余脑膜层则被去除。在脱钙的大脑和脊髓中，所有脑膜层均保持完整。经IgG和CD3表达分别鉴定出发生同种型转换的B细胞和T细胞。IgG与ER-TR7共染色显示，B细胞存在于中枢神经系统实质和脑膜中，而在ER-TR7阳性脑膜内的细胞聚集体中含有多个IgG阳性B细胞和CD3阳性T细胞。这些方案中的关键步骤是仔细分离中枢神经系统（CNS）组织，这对于提高单细胞悬液的纯度以及获得形态学质量高的组织学样本至关重要。所描述的技术可实现对占据 CNS 区室的细胞进行全面分析，适用于在稳态条件下及疾病发生过程中对细胞表型、功能和定位的研究。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

分离中枢神经系统组织和相关脑膜，用于免疫细胞的下游分析

在本视频中，我们演示了如何从患有实验性自身免疫性脑脊髓炎的大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞。...

从患EAE大鼠中枢神经系统中分离单个核细胞

本文介绍了一种快速分离脑和脊髓组织中单个核细胞的高效方案，所获细胞可有效用于流式细胞术分析。...

使用Percoll梯度分离脑和脊髓单个核细胞

该视频展示了从小鼠脑组织制备免疫细胞单细胞悬液的过程。首先通过酶消化法将细胞从脑组织中释放出来，随后利用密度梯度离心法根据细胞密度分离免疫细胞，从而获得单细胞悬液。...

制备小鼠脑组织中免疫细胞的单细胞悬液

深入了解小胶质细胞功能的努力因缺乏能够模拟成熟小胶质细胞特性的培养模型而受到阻碍 体内...

分离与培养啮齿类动物小胶质细胞以在无血清培养基中促进动态分支状形态

本实验方案的目的是从无脑回和有脑回的脊椎动物中枢神经系统的多个区域中分离微血管。...

跨五个脊椎动物类群的中枢神经系统微血管可靠分离

我们提供了一种从成年小鼠大脑半球不同解剖区域分离小胶质细胞的方案，随后进行半自动化的文库制备，以实现全长转录组的深度单细胞RNA测序。该方法将有助于阐明小胶质细胞在健康与疾病状态下的功能异质性。...

从单个成年小鼠脑半球分离区域特异性小胶质细胞用于深度单细胞RNA测序

本文介绍了一种从小鼠中枢神经系统体外分离多种胶质细胞群体的实验方案。该方法可分离出不同区域的小胶质细胞、少突胶质细胞前体细胞以及星形胶质细胞，以便在多种培养体系中分别研究各类细胞的表型特征。...

从小鼠中枢神经系统多个区域分离和提取胶质细胞

本研究对分离灌注的小鼠脑脉络丛采用流式细胞术及两种不同的设门策略；该方案可鉴定出定位于此脑结构中的主要免疫细胞亚群。...

显微解剖小鼠脉络丛中免疫细胞的分离与鉴定

迄今为止，尚无能够从同一只小鼠中同时分离出所有主要中枢神经系统常驻细胞类型的实验方案。本方案适用于正常小鼠及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠，可用于研究神经炎症期间复杂的细胞网络，同时减少所需实验小鼠的数量。...

从成年自身免疫性脑脊髓炎小鼠中同时分离主要的中枢神经系统常驻细胞类型

为了研究脑部疾病中的免疫反应，一种常用的方法是分析免疫细胞的变化。本文提供了两种简单且有效的方案，用于从小鼠脑组织和颅骨骨髓中分离免疫细胞。...

从小鼠脑和颅骨中分离免疫细胞

学习从中枢神经系统快速分离脑、脊髓和脑膜组织的方法，用于免疫细胞表型分析和功能研究。该技术适用于稳态和病理条件下的细胞定位检测，为神经免疫学研究提供高效实验方案。

分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

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