分离中枢神经系统组织及其相关脑膜用于免疫细胞的下游分析

快速分离包括脑膜在内的中枢神经系统组织，可对稳态和致病条件下免疫细胞的表型、功能及定位进行全面分析。文中展示的两种方法可快速提取带有脑膜的中枢神经系统组织，非常适合后续采用单细胞技术和组织学方法进行分析。尽管代表性结果侧重于免疫细胞的分析，但这两种方法也可用于分析中枢神经系统固有细胞，包括小胶质细胞、星形胶质细胞、周细胞、内皮细胞、基质细胞和神经元。

首先从安乐死的小鼠中分离脑组织和脊髓样本。去除头部后，在皮肤正中做一剪口，并将皮肤翻过眼睛以暴露颅骨。在鼻骨处剪断，使下颌骨与颅骨分离。

然后去除下颌骨、舌头和眼睛。沿颅骨侧部切开，分离外耳道周围的组织并进行修剪。为采集脊髓样本，使用锋利的剪刀沿脊柱平行方向剪开，将肋骨与脊柱分离。

在腰椎下部区域做一个小切口以分离脊柱，然后修剪并去除脊柱上残留的肌肉，暴露椎骨。进行脱钙时，每天检查骨骼，判断其是否变得柔软且有可塑性。用镊子将组织从EDTA溶液中取出，置于培养皿上，用25号针头轻轻测试骨质的软度。

如果针头能够轻松刺入骨骼，则表明脱钙过程已完成。为了取出脑部的颅骨盖，需在皮肤正中线做一切口，并将皮肤翻过眼睛。将剪刀插入枕骨大孔，然后沿大脑皮层向两侧剪开颅骨，直至嗅球，注意切口位置应始终位于外耳道和下颌骨上方。

在对侧进行相同的切割，切口在嗅球处相接，以将颅骨帽从脑组织上分离。用镊子将颅骨帽剥离，并放入含有5毫升冷RPMI培养基（添加25毫摩尔HEPES）的15毫升锥形管中。将弯镊置于脑底部下方，向上提起，使脑组织脱离颅骨帽。

沿脊柱平行切割，将肋骨笼与脊柱分离，从而取出椎骨列和脊髓组织。然后在下腰部区域做一小切口，以分离椎骨列。修剪并去除脊柱上残留的任何肌肉，以暴露椎骨。

接下来，将超细外科剪插入脊柱内，沿脊柱侧缘剪开。完全剪断对侧侧缘，将脊柱分为前部和后部。用镊子从脊柱上缓慢而小心地剥离脊髓，并将其放入含有5毫升冷RPMI（含25毫摩尔HEPES）的15毫升锥形管中。

然后将脊柱的前部和后部转移至另一管中。为去除颅盖上的脑膜，将颅盖从RPMI培养基中取出，用尖头镊子在颅盖外缘划痕。从颅盖边缘剥离脑膜，刮除硬脑膜和蛛网膜，并将脑膜置于培养皿中。

为了去除脊柱上的脑膜，将脊柱从培养基中取出，用尖头镊子在脊柱边缘划开，以分离脑膜。使用弯头镊子从椎骨边缘剥离脑膜，并将脑膜置于培养皿中。在50毫升锥形管中放置一个尼龙网筛。

为制备单细胞悬液，将脑膜组织转移至滤网中，加入3毫升含HEPES的RPMI培养基，然后使用5毫升注射器的推杆将组织和培养基研磨通过滤网。将脑或脊髓组织连同培养基倒入100毫米的培养皿中，用镊子将组织移至底部。用无菌剃刀片切碎脑组织，并将组织碎片聚集于培养皿底部。

向培养皿中加入3毫升添加了10%FCS的RPMI培养基，然后使用10毫升血清移液管将组织在培养基中重悬，并转移至15毫升锥形管中。向组织中加入I型胶原酶和DNase 1，并将管子置于37°C水浴中孵育40分钟。每15分钟颠倒混匀一次，以确保组织与酶充分混合。

孵育后，向每管中加入EDTA，使其终浓度为0.01摩尔，并将各管再孵育5分钟，以灭活胶原酶。向每管中加入9毫升添加了10%胎牛血清（FCS）的RPMI培养基，然后在4摄氏度下以450 ×g离心5分钟。使用连接真空泵的巴斯德吸管吸除上清液，注意不要触碰细胞沉淀。

向细胞沉淀中加入3毫升100%原液等渗密度梯度溶液，然后加入额外的RPMI 10%FCS培养基，使最终体积达到10毫升，并重悬细胞沉淀。颠倒并充分混匀试管，然后将一支含有1毫升70%原液等渗密度梯度溶液的血清学移液管插入试管底部。缓慢地将溶液铺于底部，注意避免产生气泡。

从试管中取出移液管，注意不要扰动密度梯度。在4°C条件下以800 G离心30分钟，然后吸除上清液（包括髓鞘碎片层），直至试管中剩余2至3毫升液体。使用1毫升移液器收集30%与70%密度梯度之间的细胞层，并将其转移至新的15毫升试管中。

加入 RPMI 10%FCS 培养基，使最终体积达到 15 毫升，然后在 4 摄氏度下以 450 ×g 离心 5 分钟。该方案用于评估进展期多发性硬化症期间脑膜、脑和脊髓中的 B 细胞和 T 细胞。通过设门区分来自外周的 CD45 高表达浸润性免疫细胞与 CD45 低表达的小胶质细胞以及 CD45 阴性的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。

假手术小鼠的脊髓和脑组织中仅存在少量CD45高表达细胞。在脑膜中采用相同的CD45高表达门控阈值，以鉴定CD45高表达免疫细胞并排除非免疫细胞。在所有TMEV-IDD中枢神经系统组织中，与假手术小鼠相比，CD45高表达免疫细胞的比例均有所增加。

在慢性TMEV-IDD期间，脑和脊髓中CD45高表达免疫细胞内B细胞的比例高于脑膜区。对脱钙的脑组织和脊髓进行成像，以确定B细胞和T细胞在中枢神经系统内的定位。常规从颅骨中取出脑组织可保留完整的软脑膜层，但其余脑膜层则被去除。

在脱钙的大脑和脊髓中，所有脑膜层均保持完整。经IgG和CD3表达分别鉴定出发生同种型转换的B细胞和T细胞。IgG与ER-TR7共染色显示，B细胞存在于中枢神经系统实质和脑膜中，而在ER-TR7阳性脑膜内的细胞聚集体中含有多个IgG阳性B细胞和CD3阳性T细胞。

这些方案中的关键步骤是仔细分离中枢神经系统（CNS）组织，这对于提高单细胞悬液的纯度以及获得形态学质量高的组织学样本至关重要。所描述的技术可实现对占据 CNS 区室的细胞进行全面分析，适用于在稳态条件下及疾病发生过程中对细胞表型、功能和定位的研究。