卡诺哈布迪蒂斯 伊利根斯新蛋白合成率评估
September 12th, 2020
在这里，我们介绍和描述一种非放射性和非侵入性的方法，以评估体内的去新蛋白合成，利用线虫 卡诺 哈布迪炎和荧光漂白后恢复（FRAP）。该方法可与遗传和/或药理学屏幕相结合，识别蛋白质合成的新调制器。
蛋白质合成的速度在疾病和衰老期间受到干扰。光漂白后荧光恢复（FRAP）允许测量体内蛋白质合成的速率。我们使用透明C.elegans蠕虫（表达GP）作为模型，监测光漂白后的新蛋白质合成。
我们提供实用的指南，通过使用转基因蠕虫测量荧光恢复，转基因蠕虫在不同的启动子下表达GP，无论是广泛表达的还是特定的细胞或组织中。同时，该方法提供实时蛋白质合成速度监测。使用解剖立体显微镜评估野生型和突变转基因线虫的发育阶段和生长。
挑选10个L4幼虫的野生型和突变转基因动物携带所需的荧光记者到线虫生长介质板与大肠杆菌种子。在20摄氏度的标准温度下孵育和生长线虫。四天后，该板块含有转基因蠕虫的混合种群。
在新鲜种子OP50 NGM板上选择并转移每种菌株的15个L4幼虫。进行FRAP测定，并在成年第一天监测蛋白质合成率。第二天，准备并使用含有环氧胺的NGM板作为正对。
通过暴露种子的NGM板15分钟与紫外线杀死细菌。在细菌种子板的顶部添加环氧胺，在总容量中每毫升最终浓度为 500 微克。让盘子干燥。
转移在车辆和含环氧胺板上表达GP的转基因线虫。在20摄氏度的标准温度下孵育动物两小时。挑选并转移一天的成年转基因动物到个别NGM板种子与20微升OP50下降在中心。
取下盖子，将每个板放在荧光显微镜的 20H 客观透镜下。在光漂白之前对参考图像进行聚焦和捕获。光漂白每个样品10分钟。
光漂白后捕获图像。将动物放在单独的NGM盘子里，让它们恢复。在荧光立体显微镜下，每一小时对每个荧光测量仪进行一次图像和记录，至少6小时。
准备2%的加糖垫，并在加糖垫的中心添加10微升的M9缓冲液。将表达泛神经元细胞质GP的5个转基因线虫转移到一滴M9缓冲液中。用睫毛传播液体。
由于 M9 吸收剂进入阿加，动物在两分钟内表现出的运动减少。使用睫毛选择改变线虫的位置。将样品放在荧光显微镜的 40H 客观透镜上，无需使用盖滑。
聚焦并捕获参考图像。光漂白目标感兴趣区域 90 秒。光漂白后捕获图像。
在光漂白线虫上添加 10 微升 M9 缓冲液。让动物们恢复五分钟。使用睫毛拾取器或移液器将线虫转移到单个 NGM 板，在中心放置 20 微升 OP50 滴。
在荧光立体显微镜下，每一小时拍摄一次每个样品的图像。使用 fe-2 启动子在细胞体组织中表达细胞质 GFP 的野生型和 fe-2 突变蠕虫在光漂白之前、光漂白后立即和恢复后 5 小时进行比较。野生类动物完全恢复，而fe-2突变体有迷你恢复能力。
因此，野生型蠕虫在光漂白后启动正常蛋白质合成，而缺乏mRNA翻译启动因子fe-2的蠕虫则无法这样做，这表明荧光恢复率说明了体内蛋白质合成的速率。Cycloheximide是mRNA转化的特定抑制剂，可用作蛋白质转化抑制的阳性控制。事实上，在启动子下表达细胞质GP的环氧异酰胺处理转基因动物在光漂白时不会恢复其荧光。
mRNA处理体影响蛋白质转化率。野生型和edc-3突变线虫表达GP泛神经元检查其恢复能力在目标光漂白在头部区域。与野生型蠕虫相比，edc-3缺陷动物的荧光恢复速度要慢得多。
蛋白质合成调制对机体平衡至关重要。在衰老期间，全球和特定的蛋白质合成受到干扰。蛋白质转化平衡直接控制衰老和衰老。
具体来说，翻译机械的核心部件以及P型车身相互作用组件加速了老化过程。翻译启动的扰动会加速老化。因此，通过 FRAP 测量全球蛋白质合成速率是衰老过程的直接读出。
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概述
本研究介绍了一种使用线虫秀丽隐杆线虫和光漂白后荧光恢复（FRAP）的非放射性、无创体内新蛋白质合成评估方法。该方法允许实时监测蛋白质合成速率，并可与遗传学和药理学筛选结合以识别新型蛋白质合成调节剂。
关键研究组成部分
研究领域
- 细胞生物学
- 发育生物学
- 分子生物学
背景
- 蛋白质合成速率在衰老和疾病过程中至关重要。
- 使用表达GFP的转基因秀丽隐杆线虫有助于监测蛋白质合成。
- 理解蛋白质合成调节对于生物体的稳态至关重要。
使用的方法
- 光漂白后荧光恢复（FRAP）
- 秀丽隐杆线虫作为模型生物
- 使用表达GFP的转基因线虫
主要结果
- 野生型线虫在光漂白后完全恢复荧光，而fe-2突变体显示恢复受损。
- 环己酰亚胺作为翻译抑制的阳性对照。
- 研究强调了mRNA处理体在蛋白质合成速率中的作用。
结论
- 研究结果表明，FRAP可以有效测量体内蛋白质合成速率。
- 这项研究对理解衰老过程和生物学研究中的蛋白质合成调节具有重要意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring de novo protein synthesis in vivo provides a direct readout of proteostasis dynamics, a key determinant of aging and disease progression. This method enables target validation and mechanistic de-risking by linking translational control to phenotypic outcomes in a genetically tractable system. It supports early discovery workflows by offering quantitative, real-time data for pathway interrogation and compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring protein synthesis rates as a functional readout of translational control.
- Operational Value: Enables biological de-risking through genetic and pharmacological perturbation of translation initiation factors.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying modulators that alter protein synthesis flux in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream assay standardization using transgenic reporters.
- Operational Value: Delivers quantitative, time-resolved outputs suitable for high-content imaging platforms.
- Scalability Value: Facilitates reproducible compound evaluation across genetic backgrounds and treatment conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease relevance by connecting protein synthesis modulation to aging phenotypes in a whole-organism context.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery through preclinical validation via live imaging of functional recovery.
- Risk-Adjusted Decisions: Informs advancement criteria by correlating synthesis rates with proteostatic resilience.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, enabling real-time assessment of pathway activity and compound effects on protein synthesis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying protein synthesis as a dynamic biomarker of pathway engagement.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized FRAP protocols and reproducible fluorescence recovery metrics.
- Analytics: Provides quantitative measurements of recovery kinetics that allow comparison across genetic and pharmacological conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by linking synthesis rates to aging-related phenotypes in a disease-relevant system.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for longitudinal monitoring of target engagement and pathway modulation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in translational control pathways.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through defined bleaching and recovery imaging parameters.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of synthesis-altering compounds with reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by quantifying target modulation efficacy in a physiological context.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transgenic nematode handling, fluorescence microscopy, and FRAP assay execution.
- Depends on epifluorescent or confocal microscopy systems with photobleaching capability and environmental control.
- Necessitates standardization across labs for worm staging, bleaching duration, and imaging intervals.
- Involves adaptation considerations when extending to tissue-specific promoters or alternative fluorescent reporters.
- Limited by the need for live animal imaging and potential phototoxicity during prolonged bleaching or recovery phases.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:42
Maintenance, Synchronization and Preparation of Transgenic Nematodes for Monitoring de novo Protein Synthesis
2:11
FRAP Assay using Transgenic Animals Expressing Somatic Tissue Reporters plfe-2GFP and psod-3GFP
3:01
Mounting the Samples and Perform FRAP Assay using Transgenic Nematodes Expressing Pan-Neuronally Cytoplasmic GFP, punc-119GFP
4:19
Representative Results: In Vivo Assessment of de novo Protein Synthesis in C. elegans
5:46
Conclusion
