Name: 通过子宫电位对脑神经祖细胞进行神经祖细胞的振动定位 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习利用子宫内电穿孔技术对雪貂胚胎神经祖细胞进行基因操作的方法。该技术可精准靶向神经干细胞，用于研究大脑新皮层的发育与折叠机制。

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我们衷心感谢马克斯·普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所的各个服务部门和设施提供的卓越支持，特别是生物医学服务部（BMS）全体团队在雪貂饲养管理方面的出色工作，以及光镜设施部J. Peychl及其团队的支持。我们特别感谢BMS的Katrin Reppe和Anna Pfeffer提供的杰出兽医支持，以及Huttner课题组的Lei Xing在雪貂手术中的协助。

所有实验操作均在获得萨克森州管理局（许可证编号 TVV 2/2015 和 TVV 21/2017）批准后，依照德国动物福利法规进行。
1. 体内电穿孔的准备工作
<ol>
	<li>准备DNA混合物。本实验方案中使用终浓度为1 µg/µL的pGFP。将DNA溶解于PBS中，并加入0.1%的快绿（Fast Green）以方便观察。配制完成后，通过反复吹打或轻弹管壁混匀DNA混合物。室温保存备用。 
	注意：对于共电穿孔实验，DNA混合物应包含终浓度为1 µg/µL的目标基因表达质粒和0.5 µg/µL的pGFP，均用PBS稀释。</li>
	<li>将所有所需工具和器械放置于手术台上，准备好手术操作区域。</li>
	<li>使用玻璃毛细管拉制仪拉制玻璃毛细管。按照先前所述方法41，用镊子剪去毛细管远端部分，以调节毛细管尖端的直径。</li>
</ol>
2. 雪貂手术前准备
<ol>
	<li>将妊娠期携带E33胚胎的雌性雪貂在手术前禁食至少3小时，以降低呕吐风险。</li>
	<li>手术前，通过高压灭菌对所有器械进行灭菌。在指定的专用房间内，于无菌条件下进行手术，以消除潜在的污染源。</li>
	<li>将怀孕的雌性雪貂放入含4%异氟烷的麻醉箱中。</li>
	<li>麻醉后，将雪貂置于带有加热垫的手术台上，并将含有2–3%异氟烷持续气流的麻醉面罩连接至鼻部。为确保适当的麻醉深度，需检查以下反射是否消失：
	<ol>
		<li>通过触碰眼周皮肤引出的眨眼反射</li>
		<li>通过捏压第二趾间的皮肤引出的屈肌反射nd 和 3rd，或 3rd 和 4th 双侧后肢脚趾</li>
		<li>若眨眼反射消失且屈肌反射明显减弱，可通过夹捏后肢各一个脚趾来检测疼痛反射。 
		注意：必要时需备好听诊器，以监测心率和心律。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皮下注射镇痛剂（安乃近，0.1 mL，50 mg/kg 体重）、抗生素（阿莫西林+克拉维酸，0.1 mL/kg 体重，20 mg/kg）和葡萄糖（5%葡萄糖溶液，10 mL）。</li>
	<li>在手术过程中，将一滴眼药膏溶液滴于眼睛上，以防止眼睛脱水。</li>
	<li>使用剃毛器剃除雪貂腹部的毛发。</li>
	<li>用清水和肥皂清洁皮肤，用70%乙醇擦拭腹部进行消毒，再用碘液消毒两次，然后晾干。</li>
</ol>
3. 雪貂胚胎体内电穿孔
<ol>
	<li>确保手术区域无菌：将无菌手术器械放置在无菌敷料上，并更换实验服和手套。</li>
	<li>在动物体表覆盖无菌手术单。</li>
	<li>使用手术刀沿腹白线切开腹部，切口长度约为 5 cm。</li>
	<li>使用剪刀剪开肌层。</li>
	<li>在切口周围放置纱布块，并用 PBS 润湿。纱布块将吸收手术过程中额外添加的 PBS。 
	注意：整个手术过程中需持续维持体温和 PBS 支持。</li>
	<li>暴露雪貂子宫，并将其置于纱布块上。</li>
	<li>使用带有长加样尖端的移液器将注射溶液装入玻璃毛细管中。根据胚胎数量和不同实验条件的数量，确保加样体积约为 5–20 µL。每个胚胎的平均注射体积为 3–5 µL。将装有溶液的玻璃毛细管固定于持针器上，并将持针器另一端连接至导管和吹吸嘴。</li>
	<li>检查第一个胚胎并找到头部。</li>
	<li>将光纤光源置于胚胎头部旁，以增强视野可见度。 
	注意：雪貂子宫壁颜色很深，除非直接照射光线，否则难以透视观察。</li>
	<li>对其中一个大脑半球的脑室进行单次脑室内注射，保留另一侧大脑半球完整，作为内部对照。脑室本身肉眼不易分辨，因此需根据可见的色素化虹膜位置来估计其所在区域。通过手持连接玻璃毛细管的持针器，用毛细管尖端穿透皮肤、颅骨和脑组织完成脑室内注射。 
	注意：操作时务必避免损伤胎盘，雪貂胎盘颜色较深，与小鼠胎盘不同。
	<ol>
		<li>当玻璃毛细管尖端进入脑室后，通过连接持针器的吹吸嘴以口控移液方式注入约 3–5 µL 注射液。由于注射液中含有 0.1% 快绿（Fast Green），被注射的脑室将变为深绿色，呈现为肾形结构，清晰可见。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将电穿孔镊状电极置于胚胎头部上方的子宫壁处，使正极位于目标区域上方，负极位于注射区域下方。</li>
	<li>在电穿孔仪上设置以下参数：脉冲时长 = 50 ms；脉冲电压 = 100 V；脉冲间隔 = 1 s；脉冲次数 = 5。然后按下电穿孔仪上的 &#34;脉冲&#34; 按钮。</li>
	<li>迅速在电穿孔后的胚胎上滴加数滴温热的 1× PBS。</li>
	<li>对所有胚胎重复上述操作。持续用温热 PBS 保持子宫湿润。 
	注意：若靠近阴道方向的前几个胚胎不易接近，则建议不对其进行电穿孔。</li>
	<li>完成所有胚胎电穿孔后，将子宫放回腹腔内。</li>
	<li>使用 4-0 缝线将肌层与腹膜一起缝合。</li>
	<li>使用相同规格的缝线缝合皮肤，并用铝喷雾剂喷洒伤口。</li>
	<li>将动物放入笼中，并使用热源保持体温。密切监测动物状态，直至其苏醒。</li>
</ol>
4. 靶向动物的术后护理与饲养
<ol>
	<li>手术后3天内，确保动物接受以下术后护理：每日1次，按20 mg/kg剂量给予阿莫西林（抗生素）；每日3次，按25 mg/kg剂量给予安乃近（镇痛药）。</li>
	<li>确保雪貂单独饲养。</li>
	<li>确保雪貂每天至少接受一次兽医检查。</li>
	<li>在分娩期间，尽量减少对雪貂的干扰。</li>
	<li>幼崽断奶或被安乐死后，对母雪貂进行子宫切除术准备。</li>
</ol>
5. 雪貂的子宫切除术
注意：进行子宫切除术是为了减少实验动物的牺牲数量，从而使绝育后的动物能够被捐赠用于宠物领养。子宫切除术的术前程序与步骤2相同。
<ol>
	<li>按照步骤 3.1 和 3.2 所述方法剃除雪貂腹部的毛发并进行消毒。</li>
	<li>沿腹白线外科切开腹部，切开肌层。提起肌层，并用手指保护肠道，同时完全打开肌层。</li>
	<li>在切口周围放置纱布块，并用无菌 PBS 润湿。暴露雪貂的子宫和卵巢，并将其置于纱布块上。</li>
	<li>从一侧开始进行子宫切除术：在卵巢系膜头侧结扎卵巢动脉和卵巢静脉。在结扎线两侧各夹一个止血钳，然后在止血钳头侧再进行一次结扎。在结扎线末端夹上第三个止血钳以固定结扎线。另一侧重复相同操作。</li>
	<li>在止血钳之间剪断组织，将两侧的子宫角从肠系膜上分离下来。</li>
	<li>在子宫两侧的子宫开口尾侧结扎子宫动脉。随后结扎阴道并固定结扎线，在结扎线末端夹上止血钳固定。在结扎线头侧放置两个止血钳，于钳间剪断组织，将子宫与阴道分离。取出子宫和卵巢并妥善处理。刮除残留的子宫残端黏膜。</li>
	<li>取下所有剩余的止血钳，修剪结扎线末端。移除止血钳后务必检查是否有出血。</li>
	<li>按照步骤 3.16 和 3.17 所述方法缝合肌层和皮肤。遵循步骤 3.18 以及 4.1–4.3 中的术后处理方案。术后至少将动物留在动物房内两周，并定期进行兽医检查。待动物完全恢复后，可将其捐赠用于领养。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

雪貂胚胎内电穿孔是一种重要的技术，与其他方法相比具有优势和局限性。该方法存在一些关键步骤和限制，同时也需考虑潜在的改进方法及未来应用方向。
自从Victor Borrell及其同事开创性地通过电穿孔或病毒注射对出生后雪貂新皮层进行遗传操作以来35,42,43，雪貂已成为一种可进行遗传操作的模式生物。通过子宫内电穿孔实现胚胎发育期间的遗传操作19,20，使得研究人员能够在更早的发育阶段靶向神经前体细胞，从而开辟了新的研究可能性。与出生后的操作相比，子宫内电穿孔能够靶向更大范围的新皮层区域，并作用于分化程度较低的神经前体细胞，这些细胞会依次产生新皮层的所有其他细胞类型。尤为重要的是，与病毒靶向相比，子宫内电穿孔可实现更高空间精度的靶向操作。
<p class="jove_con...

新皮层是哺乳动物大脑皮层的外层结构，也是高级认知功能的中枢1,2,3,4,5。为了在胚胎发育过程中实现对哺乳动物新皮层的急性基因操作，已探索了两种不同的方法：病毒转染6和胚胎内电穿孔7。这两种方法均可有效靶向新皮层细胞，但也存在一定的局限性。与病毒转染相比，胚胎内电穿孔的主要优势在于能够在新皮层内实现空间特异性，这是通过调控电&#160;场的方向来实现的。
自从电穿孔首次被证明可促进DNA在体外进入细胞以来8，该技术已应用于将DNA递送至多种脊椎动物体内。在发育神经科学领域，胎鼠新皮质的宫内电穿孔技术于2001年首次被报道9,10。该方法包括将DNA混合物注射至胚胎脑的侧脑室，随后使用镊形电极施加电场，从而实现空间上的精确操控7,11。此后，宫内电穿孔已被广泛用于递送核酸，以调控小鼠新皮质中内源基因或外源导入基因的表达。近年来，通过在小鼠新皮质中应用CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术，该方法取得了重要进展，包括：（1）在终末分裂后神经元12,13和神经前体细胞14中实现基因失活；（2）实现基因组15和表观基因组16的编辑。
在小鼠的首次报道之后不久，子宫内电穿孔技术即被应用于胚胎大鼠的新皮质17,18。非啮齿类动物则一直存在技术挑战，直至2012年首次报道对雪貂（一种小型食肉动物）成功实施子宫内电穿孔19,20。自此以后，雪貂的子宫内电穿孔已被广泛用于研究新皮质发育机制，包括标记神经前体细胞和神经元20,21,22,23、调控内源基因表达（包括应用CRISPR/Cas9技术）24，以及递送异位基因21,22,25，其中包括人类特异性基因26。此外，雪貂的子宫内电穿孔还被用于研究在病理条件下人类新皮质发育的特征27,28。
在新皮质发育的研究背景下，与小鼠相比，雪貂作为模式生物的优势在于其能够更好地重现一系列类似人类的特征。在解剖学水平上，雪貂表现出典型的皮质折叠模式，这种模式也存在于人类和大多数其他灵长类动物中，但在小鼠或大鼠中则完全缺失4,29,30,31。在组织学水平上，雪貂具有两个不同的室下带生发区，分别称为内侧室下带（ISVZ）和外侧室下带（OSVZ）32,33，两者由内侧纤维层分隔23。这些特征同样存在于包括人类在内的灵长类动物中，但不存在于小鼠中34。在雪貂和人类中，ISVZ和OSVZ含有大量神经前体细胞，而小鼠的室下带（SVZ）仅含有稀疏的神经前体细胞21,32,35,36。在细胞水平上，雪貂表现出较高比例的一类神经前体细胞亚型，称为基底放射状胶质细胞或外侧放射状胶质细胞（bRG或oRG），这类细胞被认为在哺乳动物新皮质的进化扩张中起关键作用34,37,38。因此，bRG在人类胎儿和雪貂胚胎的新皮质中高度富集，但在小鼠胚胎新皮质中极为罕见35,36。此外，雪貂的bRG在形态多样性方面与人类bRG相似，远优于小鼠的bRG21。最后，在分子水平上，发育中的雪貂新皮质表现出与人类胎儿新皮质高度相似的基因表达模式，这些模式被认为在控制皮质折叠发育等方面发挥重要作用39。
雪貂bRG的细胞生物学和分子特征使其&#160;具有高度增殖性，类似于人类的bRG。这导致神经元产量增加，并促进形成更为发达且高度复杂的新生皮层34。这些特性使雪貂成为研究新生皮层发育中人类特有特征的优秀模式生物，而这些特征无法在小鼠中建模26,40。为了充分利雪貂作为模式生物的优势，本研究建立了相应方法。该方法包括在E33期雪貂胚胎中进行子宫内电穿孔，转入由泛表达启动子CAG驱动的表达GFP的质粒（pGFP）。电穿孔后的胚胎可在胚胎期或出生后进行分析。为了减少实验动物的使用数量，雌性雪貂（jills）在子宫切除术后被绝育，并捐赠作为宠物收养。若目标胚胎需在胚胎期取材，则进行第二次手术，通过剖宫产取出胚胎，随后对jills实施子宫切除；若目标胚胎需在出生后阶段分析，则在幼崽断奶或被处死后对jills实施子宫切除。因此，本文也提供了一套针对jills的子宫切除术操作方案。

<table><tbody><tr><td>1毫升注射器</td><td>BD</td><td>309628</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td>手术</td></tr><tr><td>铝喷雾剂</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>手术</td></tr><tr><td>阿莫西林+克拉维酸（Synulox RTU）</td><td>WDT</td><td>6301</td><td>手术</td></tr><tr><td>毛细管固定器</td><td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>泛醇软膏溶液</td><td>Bayer</td><td>6029009.00.00</td><td>手术</td></tr><tr><td>手术铺巾（45×75厘米）</td><td>Hartmann</td><td>2513052</td><td>手术</td></tr><tr><td>镊形电极，铂镀层，5毫米</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>快绿染料</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>雪貂（Mustela putorius furo）</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>实验生物体</td></tr><tr><td>光纤光源</td><td>Olympus</td><td>KL1500LCD</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Allgaier instrumente</td><td>08-033-130</td><td>手术</td></tr><tr><td>3C-SA 镊子</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td><td>手术</td></tr><tr><td>55号镊子</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>手术</td></tr><tr><td>5-SA 镊子</td><td>Rubis Tech</td><td>5-SA</td><td>手术</td></tr><tr><td>大号纱布敷料</td><td>Hartmann</td><td>401723</td><td>手术</td></tr><tr><td>小号纱布敷料</td><td>Hartmann</td><td>401721</td><td>手术</td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>抗体</td></tr><tr><td>GFP 抗体</td><td>Aves labs</td><td>GFP1020</td><td>抗体</td></tr><tr><td>玻璃毛细管（含丝硼硅酸盐玻璃，外径：1.2毫米，内径：0.69毫米，长度：10厘米）</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF120-69-10</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td>手术</td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>手术</td></tr><tr><td>碘（聚维酮碘溶液，100 毫克/毫升）</td><td>Meda</td><td>997437</td><td>手术</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>CP</td><td>21311</td><td>手术</td></tr><tr><td>加样吸头 20&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>安乃近</td><td>WDT</td><td>99012</td><td>手术</td></tr><tr><td>梅岑鲍姆解剖剪</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>手术</td></tr><tr><td>微量移液器拉制仪</td><td>Sutter Instrument</td><td>Model P-97</td><td>电穿孔</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td>NA</td><td>来自 Kalebic 等人，eLife，2018</td></tr><tr><td>PCNA 抗体</td><td>Millipore</td><td>CBL407</td><td>抗体</td></tr><tr><td>pH3 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td>抗体</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Aesculap</td><td>294200104</td><td>手术</td></tr><tr><td>剃毛器</td><td>Braun</td><td>EP100</td><td>手术</td></tr><tr><td>Sox2 抗体</td><td>R+D Systems</td><td>AF2018</td><td>抗体</td></tr><tr><td>13厘米手术钳</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>手术</td></tr><tr><td>双头手术勺（Williger）</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>手术</td></tr><tr><td>手术洞巾</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>手术</td></tr><tr><td>小型手术剪</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>手术</td></tr><tr><td>缝合针持</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>手术</td></tr><tr><td>Tbr2 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>抗体</td></tr><tr><td>3毫升移液管</td><td>Fischer scientific</td><td>13439108</td><td>手术</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>手术</td></tr></tbody></table>

在体电穿孔靶向雪貂新皮层中的神经前体细胞

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

在分析单个基因于哺乳动物发育过程中所起作用时，体内操控胚胎发育期间的基因表达是首选方法。在体电穿孔（in utero electroporation）是体内操控胚胎哺乳动物大脑基因表达的关键技术。本文介绍了一种针对雪貂（一种小型食肉动物）胚胎新皮质的在体电穿孔实验方案。由于雪貂新皮质具有一系列在人类和非人灵长类动物中存在、但在小鼠或大鼠等啮齿类模型中缺失的解剖学、组织学、细胞和分子特征，因此雪貂正越来越多地被用作研究新皮质发育的模型。本研究在雪貂胚胎发育第33天（E33）进行在体电穿孔，该时期处于神经发生中期。在体电穿孔主要靶向脑侧脑室壁上的神经前体细胞。在神经发生过程中，这些前体细胞可产生所有其他类型的神经细胞。本研究展示了在E37、出生后第1天（P1）和P16时的代表性结果与分析，分别对应于在体电穿孔后的第4、9和24天。在较早阶段，被靶向细胞的子代主要为多种神经前体细胞亚型；而在较晚阶段，大多数标记细胞为终末分裂后的神经元。因此，在体电穿孔能够用于研究遗传操作对各类神经细胞的细胞和分子特性的影响。通过影响不同细胞群体，在体电穿孔还可用于操控雪貂新皮质的组织学和解剖学特征。重要的是，所有这些效应均为急性效应，且其时空特异性由实验者精确控制。

在E33期对雪貂进行子宫内电穿孔，成功靶向了胚胎新皮层脑室表面排列的神经前体细胞（图1）。这些细胞被称为顶端前体细胞，具有高度增殖能力，在发育过程中产生所有其他类型的细胞。通过不对称分裂，顶端前体细胞生成另一个顶端前体细胞和一个更为分化的细胞，通常是基底前体细胞（BP），后者从脑室表面脱离。基底前体细胞迁移至次级生发区，即SVZ。当电穿孔在E33期进行时，许多新生的基底前体细胞迁移至SVZ最基底的部分，并在那里形成了OSVZ22。
4天后在E37阶段检测电穿孔效应时，大多数被靶向的细胞及其子代仍位于生发区（VZ、ISVZ和OSVZ，参见 图2A）且在皮质板（CP）更基部的位置很少见到细胞。被标记细胞的子代主要由神经前体细胞类型和新生神经元组成。可通过针对细胞周期标记物（如PCNA）的免疫荧光染色来鉴定前体细胞的身份26 (图2B...

本文介绍了一种利用子宫内电穿孔技术在雪貂胚胎脑中进行遗传操作的实验方案。该方法可在体内实现对新皮层中神经前体细胞的靶向操作。

在分析单个基因于哺乳动物胚胎发育过程中所起作用时，体内操控基因表达是首选方法。

本方案使我们能够在一种关键的动物模型中进行体内遗传操作，从而研究发育中新皮层的扩张与折叠过程。该方法的主要优势在于能够以高时空特异性靶向神经干细胞，而这类细胞正是大脑发育过程中的关键细胞类型。在开始实验之前，使用显微拉针仪将玻璃毛细管拉制成针尖，并用镊子剪去毛细管远端部分，以调节毛细管尖端的直径。在胚胎发育第33天，将适当浓度的DNA溶于PBS中，加入0.1%的快绿染料并轻轻混匀。将禁食3小时、已麻醉的妊娠雪貂置于带有加热垫的手术台上。通过轻触眼周皮肤以及捏压后肢第二与第三趾或第三与第四趾之间的皮肤，确认麻醉深度是否合适。异氟烷可能引起恶心、头晕等不良反应。处理液态异氟烷时，应使用防护设备。手术过程中，使用适当的罐体收集气体。对动物皮下注射镇痛剂、抗生素和葡萄糖，并在动物眼睛上涂抹眼膏。使用剪毛器剃除腹部毛发，并用清水、肥皂和碘溶液清洁暴露的皮肤。然后用纱布擦干皮肤，并用酒精和碘液进行消毒。进行子宫内电穿孔时，将无菌手术单覆盖在动物体表，使用手术刀在腹中线处做一个约5厘米长的皮肤切口。使用剪刀剪开肌层，并在切口周围放置纱布块。用 PBS 润湿纱布，将子宫置于纱布上。使用带有长尖端的移液器，向每根拉制的玻璃毛细管中加入每胚胎 5 µL 的 DNA 溶液，用于注射。将装有样品的毛细管固定在持针器上，并将持针器另一端连接至导管和吹管。找到第一个胚胎的头部，并将光纤光源置于头部旁边。以有色虹膜作为参考点，用玻璃毛细管尖端穿透皮肤、颅骨和脑组织，通过口吸法将3–5微升注射溶液注入其中一个大脑半球的脑室内。由于注射溶液中含有0.1%的快绿（Fast Green），成功的注射会导致被注射的心室呈现深绿色染色，此时可观察到呈肾形的结构。注射后，将镊子电极放置在胚胎头部上方的子宫位置，正极置于目标区域上方，负极置于注射区域下方。将电穿孔脉冲长度设为50毫秒，脉冲电压设为100伏，脉冲间隔设为1秒，脉冲次数设为5次。当所有参数设置完毕后，按下“Pulse”按钮，并迅速在电穿孔后的胚胎上滴加数滴预热的PBS。当所有胚胎均完成电穿孔后，将子宫复位至腹膜腔内，使用4-0缝线将肌肉层与腹膜一起缝合。以类似方式缝合皮肤，并用铝喷雾覆盖伤口。然后将动物放回带有热源的笼子中，并持续监测直至完全恢复卧位。在胚胎第37天进行电穿孔后第4天，大多数靶向细胞及其子代仍位于生发区，很少在皮层板更基底部的位置观察到这些细胞。可通过针对细胞周期标志物（如PCNA）的免疫荧光染色来检测前体细胞的身份，而正在进行有丝分裂的前体细胞亚群则可通过磷酸化组蛋白3等标志物显示。在出生后第零天，即电穿孔后的第八天，被靶向细胞的子代细胞已分布至所有组织学层。通过联合使用转录因子标记物，可揭示不同的基底前体细胞群体。例如，Sox2 是增殖性前体细胞的标记物，包括基底放射状胶质细胞。T-box 脑蛋白 2 是神经源性基底前体

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

通过子宫电位对脑神经祖细胞进行神经祖细胞的振动定位

子宫内活体注射与电穿孔技术应用于胚胎大鼠新皮质，为操控单个前体细胞提供了强大工具……...

E16 大鼠胚胎的宫内脑室内注射与电穿孔

子宫内活体注射与电穿孔转染胚胎小鼠新皮层是一种强大的技术，可用于操控单个神经前体细胞……...

E15小鼠胚胎的子宫内脑室内注射与电穿孔技术

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在体电穿孔靶向雪貂新皮层中的神经前体细胞

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