通过子宫电位对脑神经祖细胞进行神经祖细胞的振动定位

该协议允许我们在一个关键的动物模型中进行体内基因操作，使我们能够研究一个正在发育的新皮质的扩展和折叠。这种方法的主要优点是利用高空间和时间特异性来靶向那些神经干细胞，这些神经干细胞是大脑发育的关键细胞类型。在开始手术之前，将玻璃毛细管拉到微型移液器拉拔器上，并使用钳子切断毛细管的端骨部分，以调整毛细管尖端的直径。

在胚胎第33天，在PBS中加入适当的DNA浓度，辅以0.1%的快速绿色与温和混合，并放置一个3小时禁食，麻醉，怀孕的雌性雪铁龙在手术台上与热垫。通过触摸眼皮和捏皮肤之间的皮肤第二和第三或第三和第四脚趾之间的两个后肢确认适当的水平。异氟兰可引起不良反应，包括恶心和头晕。

在以液体形式处理异氟兰时，请使用防护设备。在手术过程中，使用适当的毒气罐捕获气体。将动物皮下注射镇痛剂、抗生素和葡萄糖，并在动物的眼睛上放置软膏。

使用剪子剃腹部，用水、肥皂和碘溶液清洁裸露的皮肤。然后，用纱布擦拭擦干皮肤，用酒精和碘磨砂消毒。在子宫电穿孔中，在动物上放置一个无菌的窗帘，并使用手术刀在线巴伊布处进行大约5厘米的皮肤切口。

使用剪刀切割肌肉层，并在切口部位周围放置纱布棉签。用 PBS 将纱布弄湿，将子宫放在拭子上。使用带长尖端的移液器，将一个拉玻璃毛细管与每个胚胎的5微升DNA溶液混合在一起。

将加载的毛细管连接到支架上，然后将支架的另一侧连接到管子和喉舌上。找到第一个胚胎的头部，并在头部旁边放置光纤光源。使用色素虹膜作为参考点，用玻璃毛细管的尖端穿透皮肤、头骨和脑组织，并使用口腔通量，以方便将3-5微升的注射溶液输送到脑半球之一的心室。

由于注射溶液含有0.1%的快速绿色，成功注射将导致注射心室的深绿色染色，现在将可见为肾形结构。注射后，将钳子电极放在胚胎头部上方的子宫上，将正极放在要瞄准的区域上方，将负极放在注射区域下方。将电脉冲的脉冲长度设置为 50 毫秒，将脉冲电压设置为 100 伏特，将脉冲间隔设置为 1 秒，将脉冲数设置为 5。

当所有参数都设置好后，按脉冲"，并迅速将几滴热 PBS 滴到电穿孔胚胎上。当所有胚胎都进行电穿孔时，将子宫返回到腹腔，并使用 4-0 缝合线用腹膜关闭肌肉层。以类似的方式关闭皮肤，用铝喷雾覆盖伤口。

然后用热源将动物返回到其笼子并进行监测，直到完全恢复。在胚胎第37天电穿孔四天后，大多数靶向细胞及其后代仍在生殖区，细胞很少在皮质板内进一步观察。前代体身份可以通过循环细胞的标记物（如PCNA）的免疫荧光来检查，而接受线粒体病的祖体子体可以通过磷蛋白3等标记物显示。

在产后零日，电穿孔8天后，靶细胞的后代扩散到所有组织学层。使用转录因子标记的组合，可以揭示不同的基底祖体种群。例如，Sox2 是增殖祖细胞的标记，包括基底径向胶质。

T盒脑蛋白2是神经源基底祖体的标志，主要是中间祖体。到产后第16天，大多数目标细胞停止分裂和分化成神经元和胶质，产后第16天雪铁龙表现出典型的折叠模式。雪铁龙胚胎的子宫电穿孔是研究基因功能的极强方法。

它使我们能够研究与进化中新皮质扩张有关的基因，包括人类特异性基因。使用这种强大的方法，我们确实已经能够找出人类新皮质的进化扩张可能如何工作的关键特征。