Name: 果蝇黑色素的循环训练 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学习利用Drosophila melanogaster进行昼夜节律同步化的实验方法，通过免疫印迹和免疫荧光技术验证周期蛋白表达模式。该方法为研究生物钟调控机制及相关疾病提供了可靠的技术基础。

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特别感谢密苏里大学堪萨斯城分校以及 Jeffrey L. Price 实验室。

1. 果蝇饲料制备
<ol>
	<li>每 1 升水中，准备含有 4.69 g 干糖蜜、19.70 g 活性干酵母、87.22 g 玉米粉和 7.83 g 琼脂的果蝇培养基。</li>
	<li>将上述成分加入慢炖锅中，并将温度调至 250 °F。在添加成分时充分搅拌。</li>
	<li>加热过程中保持慢炖锅盖上盖子，并每隔 10 分钟搅拌一次，直至培养基达到持续沸腾状态。持续沸腾维持 20 分钟后关闭热源。</li>
	<li>加入 83.60 mL 水，并在冷却过程中保持慢炖锅无盖。</li>
	<li>使用玻璃温度计每隔 10 分钟搅拌并记录一次培养基温度。避免培养基表面形成薄膜。</li>
	<li>当培养基冷却至 60 °C 时，按每升水添加量加入 10.44 mL Tegosept 和 5.51 mL 丙酸（参见步骤 1.1）。</li>
	<li>充分混合，并将温度调至 60 °C，以防止培养基过快冷却。</li>
	<li>根据需要使用 Droso-filler 泵送果蝇培养基。</li>
	<li>对于窄口试剂管，泵送 10 mL；对于 6 盎司平底瓶，泵送 60 mL。</li>
</ol>
2. 收集特定年龄的果蝇
<ol>
	<li>在25 °C下培养野生型果蝇，观察培养瓶，持续5-7天，直至大量蛹（约200只蛹）附着在瓶壁上。所用培养瓶为6盎司的果蝇品系培养瓶，底部为方形。</li>
	<li>清除瓶内已有的成虫。可将成虫倾倒至新瓶中，或放入70%乙醇中灭活。使用#0号画笔的钝端将残留的成虫推入培养基中。每次使用前后，务必用70%乙醇擦拭画笔。</li>
	<li>将已清除成虫的培养瓶置于25 °C培养箱中静置3天，以使下一代果蝇羽化。这些果蝇的龄期将介于0至3天之间。</li>
</ol>
3. 果蝇分离
<ol>
	<li>3天后，将雄性和雌性分开，并为每个时间点分别收集所需数量的两种性别果蝇。可通过检查生殖器来区分果蝇性别：雄性具有深色、圆形的生殖器，而雌性则具有颜色较浅、更尖的生殖器。此外，雌性果蝇体型明显大于雄性。
	<ol>
		<li>使用CO2麻醉垫有效分离果蝇并区分性别。用画笔移动果蝇，以避免将其杀死。</li>
		<li>每个时间点收集100只雄性和100只雌性，每瓶装50只雄性，每瓶装100只雌性。雄性倾向于更具攻击性，当每瓶中有100只个体时，其社会互动会导致大量死亡；而雌性在每瓶最多100只的情况下则不受影响。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在以下时间点进行收集：ZT1、ZT7、ZT13和ZT19（表1）。请注意，在黑暗条件下（ZT12–ZT24）进行的收集对光敏感，而ZT0–ZT11期间的收集在光照时段内进行，房间灯光可以开启。请注意，使用两个独立的培养箱，其光照周期互为12小时反相，以便所有收集工作均可在白天完成，无需在夜间进行。</li>
	<li>利用多余的果蝇建立新的果蝇培养瓶，用于后续的同步化培养。每个新培养瓶中放入25只雌性和5–7只雄性，并置于25 °C的培养箱中。</li>
</ol>
4. 果蝇培养
<ol>
	<li>将果蝇置于光照可控的培养箱中培养3-5天，以实现昼夜节律的同步化。确保培养箱完全避光，因为即使微量的光污染也会干扰同步化过程。</li>
</ol>
5. 免疫荧光固定
<ol>
	<li>节律同步化后，为将用于免疫荧光的样品准备新的固定液小瓶。在将果蝇从培养箱中取出之前，为每100只待固定的果蝇，在每个新的窄口小瓶中加入4.8 mL用1×PBS + 0.1% Tween-20稀释的4%多聚甲醛。每个小瓶容纳100只雄性或100只雌性昼夜节律同步化果蝇。将窄口小瓶置于冰上。</li>
</ol>
6. 免疫荧光样品收集
<ol>
	<li>进行免疫荧光实验收集果蝇时，从培养箱中取出培养瓶后，打开瓶盖，迅速将瓶子倒置插入漏斗中。轻轻敲击瓶子，使果蝇通过漏斗落入溶液中，从而引导果蝇进入离心管；将两管各含50只雄蝇的样品合并，共100只雄蝇置于同一离心管中，另一管则使用单管100只雌蝇。</li>
	<li>在黑暗条件下进行ZT13和ZT19时间点的果蝇收集；可使用红光照明以便观察，因为果蝇对红光波长不敏感，从而减少光污染的影响13。特别是隐花色素蛋白（cryptochrome protein）对蓝光极为敏感，必须避免暴露于蓝光14。
	<ol>
		<li>为减少光照暴露，确保收集房间完全避光，所有光源均被遮蔽或覆盖。将用于ZT13和ZT19时间点的离心管用铝箔包裹，以便在下一步将其放置于旋转混合仪上时避免光照。ZT1和ZT7时间点的果蝇对光不敏感，可无需铝箔包裹直接放置于混合仪上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 摇摆式混合器与储存
<ol>
	<li>收集果蝇后，用胶带封住含有固定液的离心管管口，防止溢出，并将离心管置于4 °C、165 RPM的旋转混合仪上固定4小时。完成此固定步骤后，果蝇不再对光敏感，因此可移除锡箔以确认溶液流动且果蝇完全浸入固定液中。</li>
	<li>从旋转混合仪上取下含有果蝇的离心管后，移除甲醛，并用3,000 µL的1x PBS洗涤三次，每次洗涤时翻转离心管。</li>
	<li>将载有免疫荧光样品的离心管存放于4 °C，以待后续进行免疫荧光实验15。</li>
</ol>
8. 蛋白质提取样品的收集
<ol>
	<li>准备四个 50 mL 离心管和一个装有液氮的杜瓦瓶，用于保存样品以进行蛋白质提取</li>
	<li>收集用于蛋白质或核酸提取的果蝇时，按照步骤 6.1 的方法将果蝇从培养瓶转移到离心管中，迅速盖紧管盖以防止果蝇逸出，并将离心管立即放入液氮中进行速冻</li>
</ol>
9. 蛋白质提取物的储存
<ol>
	<li>将速冻样品于 -80 °C 保存，用于蛋白质提取。可依据下游分析（包括免疫印迹16）所需的蛋白质提取方案进行处理。</li>
</ol>

<ol><li>Halberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+physiological+and+clinical+aspects+of+24-hour+periodicity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal-Lancet%22%5BJournal%5D)">Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity.</a> The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).</li>
<li>Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+to+remember%3A+the+role+of+circadian+clocks+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory.</a> Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).</li>
<li>Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+circadian+rhythms+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet.+Neurology%22%5BJournal%5D)">Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases.</a> The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).</li>
<li>Hood, S., Amir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegeneration+and+the+Circadian+Clock%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+aging+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurodegeneration and the Circadian Clock.</a> Frontiers in aging Neuroscience. 9, 170(2017).</li>
<li>Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Circadian+Clock+and+Cancer%3A+New+Frontiers+for+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment.</a> Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).</li>
<li>Zehring, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-element+transformation+with+period+locus+DNA+restores+rhythmicity+to+mutant%2C+arrhythmic+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster.</a> Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).</li>
<li>Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+circadian+behavioural+rhythms+by+gene+transfer+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila.</a> Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).</li>
<li>Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+period+gene+product+of+Drosophila+reveal+diverse+tissue+distribution+and+rhythmic+changes+in+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system.</a> Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).</li>
<li>Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+of+the+Drosophila+period+gene+product+on+circadian+cycling+of+its+messenger+RNA+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels.</a> Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+period+gene+encodes+a+predominantly+nuclear+protein+in+adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila.</a> Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).</li>
<li>Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+in+nuclear+localization+of+period+protein+by+a+second+clock+mutation%2C+timeless%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless.</a> Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).</li>
<li>Price, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((double-time+is+a+novel+Drosophila+clock+gene+that+regulates+period+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation.</a> Cell. 94 (1), 83-95 (1998).</li>
<li>Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+entrainment+to+red+light+in+Drosophila%3A+requirement+of+Rhodopsin+1+and+Rhodopsin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6.</a> Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).</li>
<li>Vinayak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exquisite+light+sensitivity+of+Drosophila+melanogaster+cryptochrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome.</a> PLoS Genetics. 9 (7), e1003615(2013).</li>
<li>Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Immunofluorescent+Staining+of+Mushroom+Body+and+Photoreceptor+Neurons+in+Adult+Drosophila+melanogaster+Brains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains.</a> Journal of Visualized Experiments. (129), e56174(2017).</li>
<li>Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+Blotting%3A+Sample+Preparation+to+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Western Blotting: Sample Preparation to Detection.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2359(2010).</li>
<li>Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrainment+of+the+Drosophila+circadian+clock%3A+more+heat+than+light%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+signal+Transduction+Knowledge+Environment%22%5BJournal%5D)">Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light.</a> Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65(2007).</li>
<li>Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separate+sets+of+cerebral+clock+neurons+are+responsible+for+light+and+temperature+entrainment+of+Drosophila+circadian+locomotor+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Rhythms%22%5BJournal%5D)">Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms.</a> Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).</li>
<li>Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+phosphorylation+of+the+Drosophila+period+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).</li>
<li>Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuroarchitecture+of+the+circadian+clock+in+the+brain+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Research+and+Technique%22%5BJournal%5D)">The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster.</a> Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).</li>
<li>Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+for+clock+mutants+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Genetic screens for clock mutants in Drosophila.</a> Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).</li>
</ol>

研究人员成功且一致地使用该同步化方案。该方法可固定大量样本，以便储存并用于后续分析。此外，该策略可保存由同步化诱导的神经活动模式，供后续研究检查。
固定保存是同步化过程中的关键步骤，因为它有助于稳定脑组织，并为分析数据池中的每个大脑提供更充足的时间，从而减少因果蝇老化导致活力丧失而造成的浪费21。主要目标是尽可能多地对果蝇进行昼夜节律同步化，以确保持续供应可用于头部解剖的样本，最终进行免疫荧光或蛋白质提取，观察实验结果并判断其可靠性。为确保固定过程中昼夜节律同步状态得以维持，必须彻底消除任何光源污染。固定过程可使黑腹果蝇（Drosophila）在保存期间维持其神经系统的&#34;时间标记&#34;，以便后续解剖和分析，其结果与同步化后立即解剖并进行免疫荧光检测的果蝇相比无明显差异。就免疫荧光前的固定而言，实验室经反复验证确认，果蝇样本至少在一个月内均保持有效。若用于蛋白质印迹（western blot）的蛋白质提取，将样本储存在 -80 °C 条件下可使脑组织长期保持可用状态。
另一个关键的实验步骤是果蝇的性别鉴定。此步骤必须准确进行，因为在固定前若将两种性别的果蝇置于同一试剂瓶中，可能导致交配，从而产生年龄更小的后代，若误将雄性当作雌性或反之进行分析，将会干扰蛋白质分析结果。此外，在进行性别鉴定时，重要的是要移除有时附着在雌性果蝇上的幼虫样本，以防止在雌性果蝇试剂瓶内产生新的子代，进而可能影响实验结果的准确性。
节律同步化实验方案的下一步可能涉及数据分析相关的内容。该实验方案的重点是蛋白质定位，但如果存在其他受昼夜节律同步化影响的变量，则需要通过新的途径进行探索，通常需要进行蛋白质或核酸提取。此外，大脑中还有其他蛋白质仍可通过本方案进行分析。与该方案相关的实验已分析了某些特定蛋白质，但在昼夜节律生物学中发挥作用的基因和蛋白质列表尚未穷尽。该方案在实现建立昼夜节律这一目标方面是有效的，但其应用范围十分广泛。

地球上几乎所有生物，从最大的生物到单细胞生物，都有一个周期约为一天的内部生物钟。这被称为昼夜节律（circadian rhythm，该词由Franz Halberg于1953年提出，源自拉丁语circas，意为“大约”或“接近”，以及&#34;dies&#34;，意为“日”）1。尽管目前已知核心生物钟的部分组成成分，并对其基本功能机制有了初步理解，但关于生物节律如何在全身维持，仍有许多未解之处。尤为重要的是，生物节律的失调与多种不良健康后果相关，包括记忆形成障碍、睡眠障碍、季节性情感障碍、抑郁症、双相情感障碍、糖尿病、肥胖症、神经退行性疾病以及癌症2,3,4,5。
Drosophila 是研究昼夜节律生物学的成熟模型。该模型在遗传学和生物化学上易于操作，且可轻松实现大量个体的同步化（如下所示）。事实上，诺贝尔奖在表彰发现昼夜节律的关键研究时所引用的七篇核心论文均充分利用了果蝇模型的这些优势6,7,8,9,10,11,12。
此外，我们展示了收集同步化果蝇的有效策略，可用于免疫荧光、核酸或基于蛋白质提取的分析。利用这些方法，可以处理并储存大量样本，以备将来分析使用。这些方法具有很高的优势，具有良好的可重复性，能够获得数百只同步化果蝇，可用于构建大规模的数据集。

<table><tbody><tr><td>100-1000 μL 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>ES-1000</td><td></td></tr><tr><td>10-100 μL 移液器</td><td>Eppendorf</td><td>ES-100</td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛溶液</td><td>15710</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423500</td><td></td></tr><tr><td>麻醉过滤器连接套件</td><td>World Precision Instruments</td><td>EZ-251A</td><td></td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-100</td><td></td></tr><tr><td>糖蜜粉</td><td>食品服务直接供应</td><td>OT280504</td><td></td></tr><tr><td>果蝇饲料填充泵</td><td>geneseesci.com</td><td>59-169</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养瓶，6盎司方形底，带封口棉塞</td><td>geneseesci.com</td><td>32-130BF</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养管，窄型K-树脂超大容量</td><td>geneseesci.com</td><td>32-118SB</td><td></td></tr><tr><td>干性活性酵母</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-103</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15720</td><td></td></tr><tr><td>EZ Basic 麻醉系统</td><td>世界精密仪器公司</td><td>EZ-175</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 离心管</td><td>康宁</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 圆底管</td><td>康宁</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>精细尖头Sharpie记号笔</td><td>记号笔</td><td>30001</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 摇摆式混合器</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>Flugs-窄口塑料瓶</td><td>Genesee Scientific</td><td>49-102</td><td></td></tr><tr><td>玻璃温度计</td><td>科尔-帕尔默</td><td>EW-08008-12</td><td></td></tr><tr><td>液氮软管</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>398202</td><td></td></tr><tr><td>液氮罐-杜瓦瓶</td><td>库博医疗公司</td><td>900109-1</td><td></td></tr><tr><td>液氮转运容器</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>61891-02</td><td></td></tr><tr><td>画笔（红松鼠毛）#0 号</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>66100-00</td><td>用于按性别分离果蝇，且不会造成伤害。</td></tr><tr><td>塑料漏斗</td><td>Plews 和 Edelmann</td><td>570-75-062</td><td></td></tr><tr><td>偏光显微镜</td><td>显微镜中心</td><td>1100100402241</td><td>用于在鉴定果蝇性别时更清晰地观察</td></tr><tr><td>ProPette 移液器吸头</td><td>MTC Bio 公司</td><td>P5200-100U</td><td></td></tr><tr><td>ProPette 吸头</td><td>MTC Bio 公司</td><td>P5200-1M</td><td></td></tr><tr><td>ProPette 吸头</td><td>MTC Bio 公司</td><td>P5200-5M</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1386-1L</td><td></td></tr><tr><td>棉球</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-100</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds 品牌标准铝箔</td><td>订书钉</td><td>1381273</td><td></td></tr><tr><td>烤箱式慢炖锅（Crockpot）</td><td>Hamilton Beach</td><td>32950</td><td></td></tr><tr><td>Scotch 810 魔术胶带</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>77300</td><td></td></tr><tr><td>带有按压式喷头的喷雾瓶</td><td>美国塑料</td><td>66446</td><td>用于喷洒乙醇以清洁工作台面区域</td></tr><tr><td>Tegosept</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技果蝇培养箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>3990FL</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Revco 4 度实验室冰箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>REL7504D</td><td></td></tr><tr><td>赛默飞世尔科技 Revco 实验室超低温冰箱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>REL7504A</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Anatrace</td><td>T1003-1-GA</td><td></td></tr></tbody></table>

黑腹果蝇的昼夜节律同步

Circadian Entrainment of Drosophila Melanogaster

生物体中几乎普遍存在昼夜节律，其作用是将生物活动与地球绕太阳公转的周期协调一致。为了鉴定产生这种节律的因素并理解其产生的输出效应，需要将模式生物同步到明确的昼夜时间点。本文详细描述了一种将大量黑腹果蝇（Drosophila）同步至特定昼夜节律的实验方法。此外，我们还详细说明了在同步化后，为进行免疫荧光、核酸或基于蛋白质提取的分析而准备样品的后续步骤。

通过可控的昼夜节律同步，研究人员可利用ZT1-ZT19的时间安排，在昼夜节律周期中的特定时间点进行生物学研究，或根据需要增加额外的时间点。本文中，我们使用光照与黑暗条件使果蝇同步于昼夜节律周期，并通过检测周期蛋白（period protein）的免疫印迹和免疫荧光分析来验证同步效果，该蛋白是昼夜节律同步的标志物（图1）。在正确同步的情况下，周期蛋白应呈现特征性的强度和迁移模式（图1A），并在ZT1时间点的脑部特定区域可见（图1B）。尽管其他因素（包括食物和温度）也可能影响昼夜节律同步，但光照是最简单且最易于控制的因素17。在本方法中，培养箱温度保持恒定，依赖受光照影响的脑钟神经元实现节律同步18。
<img alt="显示不同ZT时相、脑切片及细胞投射示意图中Period蛋白表达的抗Period免疫印迹。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61176/61176fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：节律同步性的验证。（A）对来自已同步果蝇头部的全细胞提取物进行免疫印迹分析，显示了周期蛋白（period protein）迁移率和表达强度的典型模式19。使用抗Per抗体检测了每个指定外界时间（ZT）点采集的1.4只雌性果蝇头部样本。（B）在ZT时相采集的已同步果蝇脑组织的免疫荧光图像，其中Period蛋白呈现特征性分布模式（下排图像，改编自Helfrich-Forster20）。图中展示了脑部不同切片区域的图像，涵盖了在ZT1时相应表达Period蛋白的所有神经元。比例尺为40 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61176/61176fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ZT1</td>
			<td>ZT7</td>
			<td>ZT13</td>
			<td>ZT19</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>光照时间：上午10点至晚上10点</td>
			<td>光照时间：上午10点至晚上10点</td>
			<td>黑暗时间：上午9点至晚上9点</td>
			<td>黑暗时间：上午9点至晚上9点</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>上午11点采集，光照1小时后</td>
			<td>下午5点采集，光照7小时后</td>
			<td>上午10点采集，黑暗1小时后</td>
			<td>下午4点采集，黑暗7小时后</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：ZT1-ZT19 昼夜节律时间安排表。

本文详细介绍了如何将果蝇与昼夜节律同步。这是研究生物节律和时间生物学的第一步，也是最重要的一步。

在几乎所有生物中都普遍存在，昼夜节律将生物活动与地球绕太阳公转的周期协调一致。为确定产生这种……的因子

同步果蝇以确定昼夜节律时间是研究受生物钟调控或对生物钟产生响应事件的第一步。所有模型的同步均遵循相同的基本方法。该操作包含多个步骤，初看起来可能令人难以掌握。预计需要尝试数次才能感觉自然。在三分钟的步骤中保持温度稳定，并且要求关闭光源。使用慢炖锅在121摄氏度下制备果蝇食物，边加热边加入成分并混合均匀。盖上慢炖锅盖子，将内容物加热至剧烈沸腾，每10分钟搅拌一次。剧烈沸腾20分钟后，关闭热源，向慢炖锅中加入83.6毫升水。食物冷却过程中保持锅盖打开。食物冷却过程中，每隔10分钟搅拌一次，以防止表面形成膜状物。同时使用玻璃温度计每隔10分钟测量一次温度。当食物温度降至60摄氏度以下时，按照文稿中的描述加入Tegosept和丙酸。充分混匀，并调节慢炖锅以维持温度，略低于60摄氏度。使用蠕动泵分配果蝇培养基。对于窄口小瓶，泵入10毫升；对于6盎司方形底瓶，泵入60毫升。将野生型果蝇在25摄氏度下培养10至12天，直至约有200个蛹附着在瓶内壁。为去除成虫，将果蝇倾倒至新培养瓶中，并使用0号画笔的钝端将残留的成虫推入瓶内。使用前后均需用70%乙醇擦拭画笔。将蛹在25摄氏度下培养，以使下一代成虫羽化。三天后，果蝇的年龄将为0至3天。请注意，温度、光照，甚至食物的选择都会影响节律的同步化。务必在实验过程中妥善保存每组对照。在预定的取样时间点，使用二氧化碳麻醉垫使果蝇 immobilize（固定），并收集100只雄性和100只雌性果蝇。雌性果蝇体型明显大于雄性。还可以通过检查外生殖器来区分果蝇。雄性具有深色、圆形的外生殖器，而雌性则具有较浅色、更尖的外生殖器。将雄性和雌性分别放入不同的小瓶中，每瓶放置100只雌性或50只雄性。当一个试剂瓶中有100只果蝇时，雄性之间的社会互作会导致大量死亡。为使果蝇能够进行昼夜节律的同步化，需将试剂瓶置于光照可控的培养箱中培养3至5天。为了获得后续用于节律同步化的果蝇，可将剩余的25只雌性以及5至7只雄性转移至新的培养瓶中。将瓶子在 25 摄氏度下孵育。每收集 100 只果蝇，准备一个窄口小瓶，加入 4.8 毫升固定液。将窄口小瓶放入一桶冰中，并将冰桶、纸巾、铝箔和胶带带至培养箱。收集果蝇时，先将漏斗插入窄口小瓶中，然后取下果蝇培养瓶的瓶盖，迅速将其倒置插入漏斗中。轻轻敲击，促使果蝇进入固定剂小瓶中。收集雄性果蝇时，将两管各含50只果蝇合并至一个窄口小瓶中。用铝箔包裹ZT13和ZT19时间点的试管。转移果蝇后，用胶带将瓶盖固定，以防泄漏。将小瓶置于165转/分钟、4摄氏度的摇床上，孵育4小时。此时果蝇已不再对光敏感，因此可移去锡箔以确认果蝇是否完全浸入固定液中。从摇床取出小瓶后，吸除甲醛溶液，然后用3000 µL的1×PBS缓冲液清洗果蝇三次，每次清洗时均需倒置小瓶。将小瓶储存于 4°C，以待后续进行免疫荧光实验。使用光照与黑暗循环使果蝇适应昼夜节律。通过免疫印迹及对周期蛋白（period protein）的免疫荧光分析来验证节律同步，周期蛋白是昼夜节律同步的标志物。对从同步化果蝇头部制备的全细胞提取物进行免疫印迹，显示出周期蛋白迁移率和强度的经典模式。在ZT1时点采集的同步化果蝇脑组织的免疫荧光结果显示，周期蛋白呈现特征性分布模式。该方法可作为开展免疫荧光、免疫印迹、免疫沉淀、行为学分析以及任何其他用于比较生物钟运行过程中信号通路变化技术的起始点。通过能够同步您的模式生物，您可以探究所关注的通路是否会随时间发生变化，以及这些通路中的变化是否会导致生物节律的紊乱。许多疾病在生物钟失调时会加重。明确其潜在机制将有助于我们为患有阿尔茨海默病和帕金森病等疾病的患者开发出更有效的药物。

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