通过缝合小鼠传入淋巴管阻断淋巴流

该方法可在最大程度减少对淋巴内皮细胞损伤的情况下中断淋巴液流动，并通过精确控制阻断时机，用于研究淋巴液流动对淋巴结内稳态及免疫应答的影响。协助演示该操作的是我实验室的研究生 Jingna Xue。准备注射装置时，截取约30厘米长的聚乙烯导管。

将针头A的尖端连接至一段导管的一端。小心地取下另一根针头，并将其断开的一侧连接至聚乙烯导管的另一端。然后将针头A连接至一支1毫升结核菌素注射器上。

使用前立即用生理盐水配制10:1的氯胺酮-赛拉嗪混合液。通过腹腔注射250 µL氯胺酮/赛拉嗪混合液使小鼠麻醉后，用脚趾夹捏法确认是否完全麻醉。用电动剃毛器剃除腿部周围的毛发，然后在腿部周围涂抹脱毛膏。

五分钟后，用湿润的纸巾擦去残留的毛发和脱毛膏，然后用无菌水清洁腿部。在腿部周围喷洒70%乙醇以消毒操作区域。将小鼠置于俯卧位，并使用手术胶带暴露右腿的操作区域。

在小鼠右足垫皮内注射5 µL的1%伊文思蓝染料，或注射装置导管中的9厘米液体。轻轻按摩足垫，以促进液体进入淋巴管。在解剖显微镜下，于腘窝下缘5毫米处确定切口位置。

使用剪刀做一个长约五毫米的小切口。然后用精细操作镊子扩大切口，暴露收集淋巴管。辨认通向腘窝淋巴结的两条传入淋巴管。

使用持针器，小心地将缝合针插入输入淋巴管与隐动脉之间。轻柔地将针从输入淋巴管周围拉出。仔细牵拉缝线，留出约两厘米的线尾。

使用持针器协助打外科结。轻轻按摩足垫，确保伊文思蓝染料不会通过缝合部位，然后用剪刀剪去多余的缝线。缝合其他传入淋巴管，随后使用与淋巴管缝合相同的缝线关闭皮肤切口。

对于假手术对照组，在左侧足垫皮内注射5 µL的1%伊文思蓝染料，并按摩足垫。切开皮肤后，不缝合血管直接闭合伤口。术后观察小鼠时，右腿应出现水肿，且伊文思蓝染料扩散至大腿部位，而对照腿的伊文思蓝染料则局限于足垫区域。

手术后立即在右侧足垫和左侧足垫皮内注射 10 微升 2% FITC。FITC 注射后 2、6 和 12 小时，采集安乐死小鼠腘窝区域的淋巴结。仔细清除 pLNs 周围的邻近脂肪组织。

将pLNs包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，使髓窦区域朝向冷冻模具的一侧。使用冷冻切片机制备20微米的冷冻切片。为确定pLNs中FITC的分布情况，采用共聚焦显微镜对冷冻切片进行成像。

在FITC注射后2小时、6小时和12小时拍摄的共聚焦图像显示，结扎输入淋巴管后，腘窝淋巴结中FITC的聚集显著减少。残余的FITC主要积聚在淋巴结的淋巴窦内。周围脂肪组织的共聚焦图像显示，当淋巴管因结扎而阻塞时，FITC进入组织并滞留在淋巴结窦内，但未能有效分布至整个淋巴结。

尝试该方法时，需注意将缝合针插入血管与淋巴管之间至关重要，此步骤失败可能导致血管破裂。完成该方法后，可通过感染或其他免疫刺激对小鼠进行免疫，以研究淋巴液流动如何调控免疫保护作用。

淋巴流动的功能尚未被充分理解。该方法可用于在无淋巴流动的情况下研究淋巴结中的细胞迁移。