通过在小鼠中吸液性淋巴血管阻止淋巴流
2020年5月14日
提出了一种通过手术阻断淋巴血管来阻止淋巴流动的方案。
此方法以最小的淋巴内皮细胞损伤中断淋巴流动，并精确控制阻断时间，可用于研究淋巴流如何影响淋巴结中的平衡和免疫反应。帮助演示这个程序的将是我实验室的研究生薛静娜。要准备注射装置，切割约30厘米的聚乙烯管。
将针尖 A 连接到管的一端。小心地将另一根针断开，将断裂的一侧连接到聚乙烯管的另一端。然后将针头 A 连接到一毫升的结核素注射器上。
使用前，立即在盐水中准备10:1氯胺酮-锡氨酸混合物。麻醉小鼠后，注射250微升的氯胺酮/木胺混合物内，确保完全麻醉与头趾捏。用剪发器在腿部周围剃毛，然后在腿部周围涂抹脱毛霜。
五分钟后，用湿润的组织擦去残留的毛皮和脱毛霜，然后用无菌水清洁腿部。在腿部周围喷洒 70%乙醇，对操作区域进行消毒。将鼠标放在易发位置，并使用手术胶带将手术区域露出右腿。
在贸易中，将5微升的1%埃文斯蓝色染料，或9厘米的液体从注射装置管到鼠标的右脚垫。轻轻按摩足垫，帮助液体进入淋巴血管。在解剖显微镜下，从波莱特叶的下边缘定位一个切口部位五毫米。
用一把剪刀，做一个大约五毫米长的小切口。然后使用精细的操作钳来拉伸切口并暴露收集的淋巴血管。识别导致流行淋巴结的两个发性淋巴血管。
使用针架，小心地将缝合针插入支点淋巴血管和下垂动脉之间。轻轻地将针头拉出，围绕发状淋巴血管。小心地拉缝合线，留下大约两厘米的缝合线。
使用针架帮助打结。轻轻按摩脚垫，以确保没有埃文斯蓝色染料通过缝合现场，然后用剪刀切割多余的字符串。缝合其他发性淋巴血管，然后用用于淋巴血管的相同缝合关闭皮肤切口。
对于假控制，在左脚垫中注入5微升1%的埃文斯蓝色染料，并按摩脚垫。用切口打开皮肤，然后闭合伤口，而不使血管破裂。当监测小鼠手术后，右腿应显示水肿，与埃文斯蓝色染料蔓延到大腿，而控制腿将显示埃文斯蓝色染料限制在脚垫。
手术后，在右脚垫和左侧立即注射10微升2%FITC。FITC注射后2、6和12小时，从安乐死小鼠的fossa收集流行淋巴结。小心地去除 pLNs 周围的佩里诺达尔脂肪组织。
将 pLN 嵌入最佳切割温度化合物中，将模干窦区域朝向低温模具的一侧。使用低温准备 20 微米冷冻部分。要确定 pLN 中的 FITC 分布，请用共和显微镜对低温部分进行成像。
在 FITC 注射后两、六和 12 小时拍摄的共和图像显示，在使发淋巴血管苏化后，FITC 在流行淋巴结中的积累大大减少。pLNS 中的残留 FITC 优先积聚在淋巴结鼻窦中。近脂肪组织的共生图像显示，当淋巴血管被苏化阻塞时，FITC进入组织时淋巴结鼻窦，但它没有有效地分布在整个淋巴结。
尝试此方法时，重要的是要记住，在血管和淋巴血管之间插入缝合针至关重要。此步骤的故障可能会使船只中断。执行此方法后，有可能为感染或其他免疫刺激的小鼠接种疫苗，以研究淋巴流如何调节免疫保护。
淋巴流的功能不被很好地理解。此方法可用于研究淋巴结中没有淋巴流动的细胞迁移。
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概述
本文介绍了一种通过外科缝合传入淋巴管来阻断淋巴流的协议。该方法能够最大程度地减少对淋巴内皮细胞的损伤，并精确控制阻断的时间，从而有助于研究淋巴流对体内平衡和免疫反应的影响。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 血管生物学
背景
- 淋巴管在免疫反应中起着关键作用。
- 了解淋巴流对于研究体内平衡至关重要。
- 当前的方法可能会损伤淋巴内皮细胞。
- 对淋巴流的精确控制对实验的准确性至关重要。
研究目的
- 提出一种淋巴流阻断的外科协议。
- 研究淋巴流对免疫反应的影响。
- 在实验过程中最大程度地减少对淋巴结构的损伤。
使用的方法
- 传入淋巴管的外科缝合。
- 使用聚乙烯管制备注射装置。
- 连接注射器和针头以进行精确注射。
- 由研究生演示该程序。
主要结果
- 该方法有效地阻断了淋巴流。
- 观察到对淋巴内皮细胞的损伤最小。
- 实现了对阻断时间的精确控制。
- 该程序允许对淋巴功能进行详细的研究。
结论
- 该外科协议是淋巴研究的宝贵工具。
- 了解淋巴流可以增强对免疫反应的认识。
- 这种方法可以适用于各种涉及淋巴功能的实验设置。
常见问题
Executive Industry Relevance
Blocking lymph flow via surgical suturing of afferent lymphatic vessels enables precise interrogation of lymphatic function in immune homeostasis and antigen transport. This approach supports target validation in immunomodulatory drug development by isolating lymph-dependent mechanisms. It provides a mechanistic de-risking tool for preclinical models assessing lymph node microenvironment modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional validation of lymph-dependent targets in immune regulation pathways.
- Operational Value: Allows hypothesis testing of lymph flow impact on chemokine expression and high endothelial venule function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lymphatic blockade systems for assessing compound effects on lymph-mediated antigen trafficking.
- Operational Value: Provides reproducible blockade timing for standardized assay conditions in lymphatic function screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling of lymph node microenvironment in inflammation and immune response studies.
- Operational Value: Enables continuity from discovery to preclinical validation by maintaining lymphatic structure integrity during intervention.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of lymph-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Supports mechanistic interrogation of lymph flow in immune cell trafficking and LN homeostasis.
- Screening: Enables quantitative assessment of FITC antigen accumulation as a functional readout for lymphatic blockade efficacy.
- Analytics: Facilitates confocal imaging-based quantification of antigen distribution in lymph nodes and perinodal tissue.
- Translational Research: Connects lymphatic function to immune response outcomes in preclinical disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable surgical platform for modulating lymph flow across multiple immune-related target validations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in lymph-immune interactions by enabling precise temporal control of blockade.
- Operational Value: Minimizes endothelial cell damage, preserving tissue viability for longitudinal immune monitoring.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in immunomodulator development by clarifying lymph-dependent mechanisms of action.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on lymph flow dependency in immune protection.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise in vessel identification and suturing technique.
- Demands dissection microscopy and precision instrumentation for afferent lymphatic vessel access.
- Necessitates standardized postoperative monitoring for edema and dye diffusion as functional validation.
- Involves adaptation considerations across murine strains and lymphatic vessel variability.
- Limited to acute blockade studies due to potential compensatory lymphatic remodeling over time.
