Name: 在球蛋白细胞炎中进行半细胞外DNA半定量的受监督机器学习 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学习使用监督式机器学习对肾小球肾炎中的细胞外DNA进行半定量分析。该方法通过图像分析技术实现ecDNA的可视化与定量，为评估肾脏病理损伤及治疗效果提供可靠的替代标志物。

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我们感谢莫纳什显微成像中心提供尼康C1直立共聚焦激光扫描显微镜的使用，以及莫纳什组织学平台对肾组织的处理。

<ol><li>O'Sullivan, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+participation+of+myeloperoxidase+in+antineutrophil+cytoplasmic+antibody+%28ANCA%29-associated+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis.</a> Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).</li>
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<li>Chapman, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caught+in+a+Trap%3F+Proteomic+Analysis+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+in+Rheumatoid+Arthritis+and+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Caught in a Trap? Proteomic Analysis of Neutrophil Extracellular Traps in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus.</a> Frontiers in Immunology. 10, 423(2019).</li>
<li>Oliveira, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudan+Black+B+treatment+reduces+autofluorescence+and+improves+resolution+of+in+situ+hybridization+specific+fluorescent+signals+of+brain+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+%26+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Sudan Black B treatment reduces autofluorescence and improves resolution of in situ hybridization specific fluorescent signals of brain sections.</a> Histology & Histopathology. 25 (8), 1017-1024 (2010).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li>
<li>Schreiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necroptosis+controls+NET+generation+and+mediates+complement+activation%2C+endothelial+damage%2C+and+autoimmune+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Necroptosis controls NET generation and mediates complement activation, endothelial damage, and autoimmune vasculitis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (45), E9618-E9625 (2017).</li>
<li>Antonelou, M., Perea Ortega, L., Harvey, J., Salama, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-myeloperoxidase+antibody+positivity+in+patients+without+primary+systemic+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Anti-myeloperoxidase antibody positivity in patients without primary systemic vasculitis.</a> Clinical and Experimental Rheumatology. 37 (2), 86-89 (2019).</li>
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无任何披露内容。

目前已有多种检测肾小球肾炎患者及小鼠模型血清和尿液中促炎标志物的实验方案。本方案可直接分析肾小球内细胞死亡产物（ecDNA、NETs 和 ecMPO）。该方案中最关键的步骤是组织制备和成像。采用荧光染色法进行分析时，主要限制因素是组织自发荧光。经甲醛固定、石蜡包埋的组织易产生自发荧光，可能掩盖特异性荧光信号。染色方法的最后一步是将切片浸入苏丹黑溶液，可有效减弱组织自发荧光，通过降低信噪比，凸显抗体特异性染色信号19。组织成像时必须使用至少40倍油镜放大倍数，以便检测较小的ecDNA和MPO片段。成像过程中，必须采用逐线扫描方式采集图像，以确保不同荧光标记之间无信号串扰。
该分析方案的一个优势在于其通过ImageJ提供开放获取，可供任何人使用16我们已在此证明，该方法可轻松适用于检测肾组织内不同的荧光标记物。一旦在Trainable Weka Segmentation中确定了模型，便可无偏倚地以完全相同的方式应用于后续图像的分析。这种分析的监督性质允许通过额外的阈值设定步骤对分割中的任何误...

髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（MPO-AAV）是一种自身免疫性疾病，可导致肾功能衰竭，其病理特征为肾小球损伤，伴随大量细胞死亡和脱氧核糖核酸（DNA）释放1,2。DNA可通过作为危险信号激活免疫系统。在正常健康状态下，DNA位于细胞核内，从而避免与免疫系统接触。在病原过程或自身免疫状态下，细胞外释放的自身DNA会被免疫系统识别为一种强效的促炎性损伤相关分子模式（DAMP）3。细胞外DNA（ecDNA）可通过多种不同的生化通路介导的机制从死亡细胞中释放，例如凋亡、坏死性凋亡、中性粒细胞胞外诱捕网形成（NETs）、坏死或焦亡4,5,6,7,8。
本文描述了在实验性抗MPO GN的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肾脏组织切片以及MPO-AAV患者肾活检样本中，对来自死亡细胞所释放的细胞外DNA（ecDNA）进行染色和定量的方法9,10。目前已有多种方法可用于检测血清和尿液中的循环双链DNA（dsDNA）及DNA复合物，以及体外实验中的相关成分11,12。这些方法虽然能够准确测定ecDNA的含量，但无法确定ecDNA在解剖学上的释放位置。已有部分方法可特异性检测与细胞凋亡相关的ecDNA，例如TUNEL法，以及细胞碎片的检测方法13,14。然而，尚无一种方法可用于在发生病理损伤的FFPE肾脏组织中，对所有形式细胞死亡所累积的ecDNA进行定量检测。该技术的建立对于判断实验性治疗手段是否能够清除靶器官内病理损伤部位的ecDNA具有重要意义。
从肾脏样本获取的多幅图像会产生大量数据，通常由单个用户进行分析。这种分析方式耗费人力、耗时较长，且由于存在用户主观偏差，其他用户难以获得可靠且可重复的结果。Trainable Weka Segmentation 是 ImageJ 的一款开源软件插件，利用前沿的生物信息学工具，通过机器学习算法对像素进行分类。15,16. 该方法是 &#34;可训练的&#34; 通过学习用户对像素片段的分类，并将新学到的分类结果应用于其他图像。该方法依赖于 ImageJ 程序中常用的分析工具，这些工具被用于 &#34;分类&#34; 将每个像素归类为属于特定片段 &#34;班级&#34;程序一旦学会 &#34;分类器&#34;，可用于识别同一图像中其他类似的已分类区域。该模型随后会被保存，并应用于同一批实验中的其他图像组。
目前在肾组织切片中就地检测ecDNA的主要障碍是福尔马林固定引起的内源性自发荧光，以及图像分析过程的劳动强度较大。本文描述了如何淬灭这种自发荧光、检测ecDNA，并利用有监督的机器学习实现ecDNA的高通量定量分析。我们此前已发表过使用ImageJ宏程序测量中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和细胞外髓过氧化物酶（ecMPO）的方法，现进一步展示如何通过有监督的机器学习实现这些方法的半自动化1。我们还展示了该机器学习工具的可适应性，能够在同一图像中对NETs和ecMPO的替代染色进行分类识别。本文所述的ecDNA、NETs和ecMPO检测染色方法可推广至其他实体器官和疾病，例如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮，在这些疾病中ecDNA、NETs和ecMPO在推动疾病进展中发挥重要作用17,18。

<table><tbody><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td>用 PBS 配制成 5% 和 1% 溶液，可批量配制后冷冻保存——解冻后即弃用。</td></tr><tr><td>鸡抗山羊 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21468</td><td>使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物</td></tr><tr><td>鸡抗小鼠 IgG（H+L）交叉吸附抗体，Alexa Fluor 647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-121468</td><td>使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物</td></tr><tr><td>鸡抗兔 IgG（H+L）交叉吸附抗体 Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21441</td><td>使用前在小型离心机中离心 1 分钟，以避免抗体混合液中存在游离偶联物</td></tr><tr><td>鸡血清</td><td>SIGMA</td><td>C5405</td><td>用 1% BSA/PBS 配制</td></tr><tr><td>盖玻片 24 × 60 mm</td><td>Azerscientific</td><td>ES0107222</td><td>#1.5，此为非标准厚度——专为共聚焦显微镜设计</td></tr><tr><td>EDTA 10 mM</td><td>SIGMA</td><td>E6758</td><td>将 TRIS 与 EDTA 溶于蒸馏水中，调 pH 至 9，用于抗原修复，可配制成 10 倍浓度溶液</td></tr><tr><td>乙醇 30%、70% 和 100%</td><td>Chem Supply</td><td>UN1170</td><td>以 100% 未变性乙醇形式提供——用蒸馏水稀释至 30% 和 70%</td></tr><tr><td>甲醛 4%（10% 中性缓冲福尔马林）</td><td>TRAJAN</td><td>NBF-500</td><td>将肾脏组织放入含 3 ml 福尔马林的 5 ml 管中，室温固定 16 小时，福尔马林应在通风橱中使用</td></tr><tr><td>组织学载玻片 — Ultra Super Frost，Menzel Glaser，25 × 75 × 1.0 mm</td><td>TRAJAN</td><td>J3800AM4</td><td>必须使用带正电荷涂层的载玻片。不推荐使用多聚-L-赖氨酸包被载玻片，因为在抗原修复步骤中组织易从载玻片脱落</td></tr><tr><td>山羊抗人/小鼠 MPO 抗体</td><td>R&amp;D</td><td>AF3667</td><td>收到后分装并于 -80°C 冷冻保存</td></tr><tr><td>Histosol</td><td>Clini Pure</td><td>CPL HISTOSOL 08</td><td>直接使用，置于 200 ml 染色架容器中，在通风橱中操作</td></tr><tr><td>疏水笔</td><td>VECTOR Labs</td><td>H-400</td><td>用于在肾脏组织周围画圈</td></tr><tr><td>小鼠抗人/小鼠肽基精氨酸脱亚胺酶 4（PAD4）</td><td>ABCAM</td><td>ab128086</td><td>收到后分装并于 -80°C 冷冻保存</td></tr><tr><td>尼康 C1 共聚焦激光扫描头，连接至尼康 Ti-E 倒置显微镜</td><td>Coherent Scientific</td><td></td><td>收到后分装并于 -80°C 冷冻保存</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>SIGMA</td><td>P38135</td><td>0.01 M PB/0.09% NaCl，每次配制 5 L</td></tr><tr><td>6 L Tefal Secure 5 Neo 不锈钢压力锅</td><td>Tefal</td><td>GSA-P2530738</td><td>在当地家居用品商店购买</td></tr><tr><td>Prolong Gold DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36962</td><td>直接滴加至盖玻片上</td></tr><tr><td>兔抗人/小鼠 Beta Actin 抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab8227</td><td>收到后分装并于 -80°C 冷冻保存</td></tr><tr><td>兔抗人/小鼠 H3Cit 抗体</td><td>ABCAM</td><td>ab5103</td><td>收到后分装并于 -80°C 冷冻保存</td></tr><tr><td>24 片染色架</td><td>ProScitech</td><td>H4465</td><td>所选染色架必须能耐受加压煮沸及在 60°C 烤箱中孵育</td></tr><tr><td>苏丹黑 B</td><td>SIGMA</td><td>199664</td><td>0.3%，将 3 g 加入 1 L 瓶中，溶于 70% 乙醇，过滤后避光保存——室温下可稳定保存 6 个月</td></tr><tr><td>Tris 10 mM</td><td>SIGMA</td><td>T4661</td><td>将 TRIS 与 EDTA 溶于蒸馏水中，调 pH 至 9，用于抗原修复，可配制成 10 倍浓度溶液</td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Trajan</td><td>XL005/20</td><td>必须在通风橱中使用</td></tr></tbody></table>

监督式机器学习用于肾小球肾炎中细胞外dna的半定量分析

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

肾小球细胞死亡是髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（MPO-AAV）的病理特征。在包括凋亡、坏死、坏死性凋亡、中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和焦亡在内的多种细胞死亡形式中，均会释放细胞外脱氧核糖核酸（ecDNA）。目前对这类细胞死亡的检测耗时较长，且需要多种不同的生物标志物来识别不同生化形式的细胞死亡。ecDNA的检测通常在血清和尿液中进行，作为肾损伤的替代指标，而非在发生病理损伤的实际靶器官中检测。当前在肾脏中研究ecDNA的主要困难在于，无论是实验研究还是存档的人类肾活检样本，均缺乏针对福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）的有效检测方法。本方案概述了在FFPE组织（包括人和小鼠来源）中对ecDNA进行染色、淬灭自发荧光，并利用公开可用的开源ImageJ插件“可训练Weka分割”（trainable Weka segmentation）对所得图像中的ecDNA进行定量分析的步骤。该Weka可训练分割工具应用于肾小球内的ecDNA识别，程序可学习并分类ecDNA信号。训练所得的分类器可应用于后续获取的肾脏图像，从而减少对每张图像进行人工标注的需求。该可训练Weka分割方法的适应性进一步在实验性小鼠抗MPO肾小球肾炎（GN）的肾组织中得到验证，可用于识别NETs和细胞外MPO（ecMPO），这两者均为抗MPO GN常见的病理因素。本方法实现了对肾组织中ecDNA的客观分析，清晰展示了可训练Weka分割程序在区分健康正常肾组织与病变肾组织中ecDNA方面的有效性。该方案可轻松拓展应用于其他器官中ecDNA、NETs及ecMPO的识别。

这些图像展示了成功使用可训练的Weka分割方法来减少对小鼠诱导抗MPO GN的荧光染色FFPE肾组织中ecDNA进行劳动密集型手动测量所需的多个步骤。这些步骤在图1和图2中进行了总结，图像直接取自Weka分割程序，概述了分析过程中的每一步。随后在图3中展示了该分析的测量结果，证明了该程序能够确定在未诱导抗MPO GN的对照组织中沉积于肾小球内的不同量的ecDNA。图4表明，该ecDNA模型可被调整用于识别对照患者（微小病变疾病患者的肾小球在组织学水平上几乎无损伤）以及MPO-AAV患者的肾活检标本中的ecDNA。图5展示了该程序在肾组织中其他染色方法中的可转化能力。我们使用了一例诱导实验性抗MPO GN小鼠肾组织的代表性样本，对NETs和ecMPO进行染色，随后利用可训练的We...

细胞死亡过程中释放的细胞外DNA（ecDNA）具有促炎性，并参与炎症反应。在损伤部位检测ecDNA可评估靶器官中治疗干预的效果。本方案描述了利用机器学习工具对肾组织中ecDNA的定量进行自动化测量的方法。

监督式机器学习用于肾小球肾炎中细胞外DNA的半定量分析

肾小球细胞死亡是髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎（MPO-AAV）的病理特征。细胞外……

肾小球肾炎可导致病理性肾小球损伤，伴随大量细胞死亡和细胞外DNA释放。本方案可实现对病理损伤过程中细胞外DNA释放位点的可视化。该技术的优势在于能够检测肾脏中因细胞死亡所释放的细胞外DNA。与血清或尿液不同，细胞外DNA的检测是病理损伤的一种替代性标志物。该方法的意义在于，细胞外DNA染色及图像分析均可便捷地应用于其他自身免疫性疾病，如类风湿关节炎和系统性红斑狼疮。该方法需要具备肾脏组织学的基本知识。为了准确检测肾小球的细胞外DNA，研究人员必须能够正确识别肾小球。进行细胞外DNA染色时，首先将待测样本置于载玻片架中，在60摄氏度下加热60分钟，然后在通风橱内将载玻片浸入溶剂中，每次40分钟，共更换两次溶剂。第二次浸泡后，用100%乙醇处理两次、70%乙醇处理一次，每次五分钟，以使样本复水。最后一次处理后，用镊子将切片放入高压锅中的煮沸抗原修复液内，高温加热10分钟。抗原表位暴露后，将高压锅从热源上移开并立即在水槽中用冷水冲洗锅盖表面。随后让切片在抗原修复液中平衡20分钟，再将样本置于0.01摩尔PBS溶液中，于旋转摇床上清洗两次，每次5分钟。第二次洗涤后，使用疏水性笔在肾组织样本周围画圈，并加入60 µL含10%鸡血清的5%牛血清白蛋白溶液，在室温下封闭非特异性染色30分钟。孵育结束后，在湿盒中用60 µL目的一抗溶液替换封闭液，于4°C过夜孵育。次日早晨，在轨道摇床上用PBS洗涤切片，每次2分钟，洗涤后每张切片加入60 µL相应的荧光标记二抗溶液，在室温下孵育40分钟。孵育结束后，按照演示方法用 PBS 洗涤载玻片，随后用含 70% 乙醇的 0.3% 苏丹黑处理，以淬灭可能由甲醛引起的自发荧光。30 分钟后，用自来水洗涤载玻片以去除任何沉淀物，并将载玻片浸入 PBS 中 10 分钟，防止进一步形成苏丹黑沉淀。孵育结束后，将载玻片用三滴每滴 60 µL 的封片液（含 DAPI）封固于共聚焦显微镜用盖玻片上，并用指甲油密封盖玻片。将载玻片在室温下固化24小时。按照标准方案，将其在4°C避光保存，直至进行共聚焦激光扫描显微成像。务必用指甲油密封盖玻片，以防止成像过程中发生移动，并用乙醇清洁盖玻片，以提高成像分辨率。每张切片成像 20 个肾小球后，在 ImageJ 中打开可训练的 Weka 分割插件，并将第一张图像拖放到 ImageJ 工具栏上。点击图像、颜色，然后分离通道。此时将显示显示一抗染色的图像。要创建单个图像的合并文件，请点击颜色并合并通道。此时将弹出一个对话框，要求为每个通道分配一种颜色。勾选“创建复合图像”和“保留源图像”选项，然后点击“确定”。一个合并后的复合图像将会显示。以一抗染色作为参考，在肾小球毛细血管丛周围绘制感兴趣区域。要对单通道蓝色 DAPI 图像执行高斯模糊，请点击 process（处理）、filters（滤镜），然后选择 Gaussian blur（高斯模糊），将模糊值设置为 1 至 2。图像会略微模糊，但细胞核将呈现平滑状态，背景也会被柔化。接下来，点击插件、分割和可训练的Weka分割工具，使用自由手绘工具勾勒完整的细胞核。当所有感兴趣的细胞核均已被添加后，将其归入类别一框中，然后使用线条工具将背景区域划分至类别二框中。单击“创建新类别”，使用线条工具勾勒经 DAPI 染色的核外 DNA 轮廓。单击“训练分类器”以获取概率图。切换鼠标以获得所有组分的黑白图像，其中所选对象以白色高亮显示。要复制此图像，请单击图像并进行复制。在图像下方，调整并设置阈值。使用鼠标按钮调整阈值，直到仅观察到细胞外DNA为止。阈值处理后，依次点击“Process”（处理）、“Binary”（二值化）和“Make Binary”（生成二值图像），并复制先前生成的肾小球感兴趣区域。按 Ctrl+Shift+E 选择“Edit”（编辑）、“Selections”（选择）和“Restore”（恢复），以恢复选定区域。为仅测量肾小球内的细胞外DNA颗粒，点击“Analyze Particles”（分析颗粒）并确认。系统将生成一个结果表，显示颗粒数量、面积、平均像素值以及含有细胞外DNA的肾小球百分比。要将分类器保存为细胞外DNA分类器，请点击“保存分类器”并保存数据。若要在后续图像中重新应用该模型，请重复初始的图像处理步骤，然后选择“加载分类器”及已保存的分类器文件。日志菜单将弹出并运行该模型。模型运行完成后，单击“加载数据”并选择 extracellularDNA.arff 文件，然后单击“创建结果”。如果生成的图像未能识别出所有细胞核、背景或细胞外DNA，请单击“重新训练分类器”，并根据需要添加更多分类器。此处展示了代表性的 DNA 和 β-肌动蛋白染色的单通道图像。将两幅图像合并后，可围绕肾小球区域绘制感兴趣区域，以使用可训练的 Weka 分割方法测量小鼠肾小球内的细胞外 DNA，如图所示。该模型可用于识别对照患者肾活检标本中的细胞外 DNA，或与髓过氧化物酶抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎患者的肾活检标本进行比较。此外，该程序还可应用于肾脏组织样本中的其他染色，例如用于染色中性粒细胞胞外诱捕网以及在抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎中胞外髓过氧化物酶的沉积。重要的是，当多个用户分析相同数据时，未观察到显著差异。分析中最关键的步骤是为Weka分割程序提供足够多的背景、细胞核以及带有肾小球的胞外DNA示例，作为分类器的学习样本。该方法易于转移应用。例如，可通过针对凋亡或坏死标志物的特异性抗体染色，进一步分析不同类型的细胞死亡。我们的技术也可用于其他炎症过程的研究，例如在自身免疫性肾病中评估 TLR 表达，或在人类肾活检组织中检测细胞外髓过氧化物酶的表达。

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科研

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免疫学与感染

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