在球蛋白细胞炎中进行半细胞外DNA半定量的受监督机器学习

肾上腺炎导致病理性肾上腺损伤，细胞大量死亡，细胞外DNA释放。该协议允许在病理损伤期间释放地点的细胞外DNA可视化。这项技术的优点是它测量肾脏细胞死亡的细胞外DNA。

与血清或尿液相反，细胞外DNA测量是病理损伤的代理标记。这种方法的意义是，细胞外DNA染色和图像分析都很容易转移到其他自身免疫性疾病，如风湿性关节炎和狼疮。这种方法需要肾脏组织学的基本知识。

为了能够准确检测球状细胞外DNA，研究人员必须能够正确识别球状细胞外DNA。对于细胞外DNA染色，首先在60摄氏度的滑架中加热感兴趣的样品60分钟，然后将幻灯片浸入两个40分钟的烟气罩中溶剂变化中。第二次浸入后，在100%乙醇中对样品进行两次补水，每次处理5分钟，在70%乙醇中再补充一次。

最后一次治疗后，使用钳子将幻灯片放入高压力锅中放入沸腾的抗原检索溶液中 10 分钟。揭开抗原表名后，将压力锅从热转移到水槽中，并立即将冷自来水放在盖子上。在抗原检索溶液中，让幻灯片平衡 20 分钟，然后每次洗涤时用 0.01 摩尔 PBS 将样品用 0.01 摩尔 PBS 洗涤两次。

第二次洗涤后，使用疏水笔在肾脏组织样本周围画圆，并在室温下用 5%牛血清白蛋白中 60 微升的 10% 鸡血清阻止任何非特异性染色，30 分钟。在孵育结束时，在4摄氏度的湿度室中，小心地用60微升的原抗体的阻尼溶液更换。第二天早上，在PBS的轨道摇床上清洗幻灯片两分钟，然后在每张幻灯片中加入60微升适当的荧光素结合二次抗体，在室温下孵育40分钟。

在孵育结束时，如演示，在PBS中清洗幻灯片，随后在0.3%苏丹黑色70%乙醇中进行治疗，以淬火任何潜在的形式素引起的自荧光。30 分钟后，用自来水清洗滑梯，清除任何沉淀物，将滑梯浸入 PBS 中 10 分钟，以防止任何进一步的苏丹黑沉淀物形成。在孵化结束时，将滑梯安装到共和玻璃盖玻片上，用三滴 60 微升的安装溶液加用 DAPI，用指甲油密封盖玻片。

让幻灯片在室温下固化 24 小时。将它们存放在摄氏四度，防止光线照射，然后根据标准协议通过共声激光扫描显微镜进行成像。请务必用指甲油密封盖玻片，以防止成像过程中的任何移动，并清洁乙醇的盖玻片，以提高成像分辨率。

每张幻灯片成像 20 glomeruli 后，打开 ImageJ 中的可训练 Weka 分段插件，然后将第一个图像放到 ImageJ 工具栏上。单击图像、颜色和拆分通道。将显示显示原抗体染色的图像。

若要创建单个图像的合并文件，请单击颜色和合并通道。将出现一个弹出窗口，要求将颜色分配给每个通道。选中创建合成并保留源图像框，然后单击"确定"。将显示合并的复合图像。

以原抗体染色为指导，在球状塔夫特周围绘制一个感兴趣的区域。要对单个蓝色 DAPI 图像执行高斯模糊，请单击过程、滤镜和高斯模糊。将模糊设置为一对二。

图像会变得有点模糊，但核会显得光滑，背景会变软。接下来，单击插件、分段和可训练的 Weka 分段，并使用免费手动工具跟踪完整的核。添加所有感兴趣的核后，添加类 1 框，使用行工具将背景区域划分到类二框。

单击"创建新类"并使用线条工具勾勒出 DAPI 染色的核外 DNA 轮廓。单击列车分类器并获取概率。切换鼠标以获取所有组件的黑白图像，选择对象以白色突出显示。

要复制此图像，请单击图像并复制。在图像下，调整和阈值。使用鼠标按钮调整阈值，直到只观察到细胞外DNA。

在阈值之后，单击进程、二进制，并制作二进制，然后复制以前生成的感兴趣的光大区域。按"控制移位 E"可选择编辑、选择和还原以还原所选内容。要仅测量球状中细胞外DNA颗粒，请单击"分析粒子"和"确定"。将生成一个结果表，显示包含细胞外 DNA 的粒子数、面积、平均像素和球状百分比。

若要将分类器另存为细胞外 DNA 分类器，请单击保存分类器并保存数据。若要将模型重新应用到后续图像，请重复初始图像处理，如选择加载分类器和保存的分类器文件之前所示。日志菜单将弹出并运行模型。

模型运行后，单击加载数据并选择细胞外 DNA.arff。然后单击"创建结果"。如果生成的图像无法拾取所有核、背景或细胞外 DNA，请单击重新训练分类器并根据需要添加更多分类器。

在这里，显示代表性DNA和β-actin染色的单通道图像。合并这两幅图像后，可以绘制一个感兴趣的区域，以测量小鼠肾球状体内的细胞外DNA，如所证明的可训练韦卡分段。该模型可用于识别来自对照患者的肾脏活检标本中的细胞外DNA，或与与肌羚羊体血管炎患者进行肾脏活检的比较。

此外，这个程序可以转化为肾脏组织样本中的其他污渍，例如，为嗜中性粒细胞外陷阱染色，并在与安卡相关的血管炎中沉积细胞外肌精。重要的是，当多个用户分析相同数据时，不会观察到显著差异。分析最关键的步骤是提供足够的背景、核和细胞外DNA示例，其中球蛋白作为 Weka 分段程序的分类器。

此方法易于传输。例如，可以通过对凋亡或坏死标记物的特定抗体进行染色，进一步分析不同类型的细胞死亡。我们的技术可用于其他炎症过程，如评估自身免疫肾病中的TLR表达或人体肾脏活检中的细胞外肌细胞酶表达。