Name: 小鼠胚胎干细胞体外神经元分化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学习小鼠胚胎干细胞体外神经元分化的高效方法，通过优化方案三实现78%巢蛋白阳性神经前体细胞和68%β-微管蛋白III阳性神经元的高效诱导。该技术成本低、操作简便，为神经生物学和发育生物学研究提供了标准化模型。

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本工作受到中国国家自然科学基金（No. 31501099）的资助，&#160;的&#8194;中年和&#8194;年轻&#8194;的&#8194;的&#8194;教育&#8194;部门&#8194;中国湖北&#8194;中国湖北省（编号：Q20191104）。同时，我们感谢武汉科技大学的邓文胜教授提供小鼠胚胎干细胞系 A2lox。

1. 小鼠胚胎干细胞培养
<ol>
	<li>制备0.1%明胶包被的细胞培养皿或培养板。
	<ol>
		<li>向60 mm细胞培养皿中加入2 mL灭菌的0.1%明胶溶液（0.1% w/v，溶于水），轻轻摇晃培养皿以确保表面均匀包被。</li>
		<li>将培养皿放入5% CO₂培养箱中2 37 °C 培养箱中孵育 1 小时以完成包被。</li>
		<li>在接种细胞前，移除0.1%明胶溶液。 
		注意：去除明胶后，无需干燥或洗涤包被的培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>小鼠胚胎干细胞（A2lox 和 129）培养
	<ol>
		<li>将mESCs（A2lox和129）细胞接种于经0.1%明胶包被的60 mm细胞培养皿中，加入mESC生长培养基，在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养箱中分别培养。mESC生长培养基由85%的Knock-out DMEM/F12、15% Knock-out血清替代物（KSR）、0.1 mM β-巯基乙醇（2ME）、2 mM GlutaMAX、1%非必需氨基酸（NEAA）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1000 U/mL白血病抑制因子（LIF）、10 nM CHIR-99021（GSK-3抑制剂）和0.33 nM PD0325901（MEK抑制剂）组成。 
		注意：β-mercaptoethanol 具有可燃性，且吸入有毒。使用时应远离火源，并佩戴口罩以避免吸入。</li>
		<li>每天更换mESC培养基，以促进A2lox和129细胞的更好生长。</li>
		<li>当细胞达到80%融合度时，移除培养基并向培养皿中加入1 mL 0.1%胰蛋白酶。轻轻晃动30秒，确保胰蛋白酶均匀覆盖所有细胞。</li>
		<li>将细胞静置约1分钟 胰蛋白酶用1 mL移液器吸出并去除胰蛋白酶。</li>
		<li>向培养皿中加入 2 mL mESC 生长培养基，用移液器上下吹打数次，制成单细胞悬液。</li>
		<li>使用血细胞计数板尽可能准确地测定悬浮液中细胞的密度。</li>
		<li>将细胞分为7组，并使用所示的不同方案诱导分化 表1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从小鼠胚胎干细胞分化为神经前体细胞（第一阶段）
<ol>
	<li>制备0.1%明胶包被的细胞培养板或盖玻片。
	<ol>
		<li>使用前，按照步骤1.1制备0.1%明胶包被的6孔板或盖玻片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案1进行第一阶段分化（表1)
	<ol>
		<li>接种约 2 × 104 将mESCs以每孔2 mL基础分化培养基I接种于0.1%明胶包被的6孔板中。在显微镜下检查细胞密度。</li>
		<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 孵育6小时以促进贴壁。</li>
		<li>贴壁后，从培养箱中取出细胞，用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。</li>
		<li>加入2 mL基础分化培养基I（表1向每个孔中加入）并将细胞放回培养箱中。</li>
		<li>将细胞培养8天以诱导分化。每2天更换一次基础分化培养基I。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案2进行第一阶段分化（表1)
	<ol>
		<li>加入 1.5 x 106 将mESCs置于10 mL基础分化培养基I中，在非黏附性细菌培养皿内于37 °C、5% CO₂条件下培养，以诱导胚状体形成2 培养箱</li>
		<li>2天后，将细胞聚集体转移至15 mL离心管中，静置沉降。</li>
		<li>移除上清液，加入10 mL新鲜的基础分化培养基I，重悬拟胚体。将其重新接种至新的非黏附性细菌培养皿中，继续分化培养2天。</li>
		<li>在显微镜下观察类胚体的形成情况（图2A).</li>
		<li>按照步骤2.3.2-2.3.3所述收集拟胚体。将约50个拟胚体接种至每孔2 mL基础分化培养基I中，接种于经0.1%明胶包被的6孔板中。</li>
		<li>配制1 mM全反式维甲酸（all-trans RA）储备液（溶于DMSO），分装后避光保存于-80 °C冰箱中。 
		注意：RA 不稳定，在制备 RA 原液时应注意避光并减少与空气接触。</li>
		<li>为诱导RA，向每孔中加入2 µL RA储备液，使终浓度为1 µM。</li>
		<li>将培养板放入5% CO₂培养箱中2 37 °C 培养箱中继续培养并分化 4 天。</li>
		<li>每2天更换一次全部2 mL基础分化培养基I（含1 µM RA）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案3的I期分化表1)
	<ol>
		<li>植物 1.5 × 106 将mESCs置于10 mL基础分化培养基I中，接种于非黏附性细菌培养皿，于37 °C、5% CO₂条件下培养2天以形成拟胚体。2 培养箱</li>
		<li>在显微镜下观察拟胚体的形成情况图2B).</li>
		<li>将细胞聚集体转移至15 mL离心管中，静置沉降。</li>
		<li>小心移除上清液，加入10 mL新鲜的基础分化培养基I重悬细胞。</li>
		<li>将约50个类胚体接种至每孔2 mL基础分化培养基I中，接种于经0.1%明胶包被的6孔板中。</li>
		<li>为诱导RA，向每孔中加入2 µL RA储备液，使终浓度为1 µM。</li>
		<li>将培养板放入5% CO₂培养箱中2 在37 °C培养箱中继续培养并分化6天。每2天更换一次完全的I型基础分化培养基（含1 µM RA）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案4的I期分化表1)
	<ol>
		<li>种子接种量约为 2 x 104 将mESCs以每孔2 mL基础分化培养基I接种至经0.1%明胶包被的6孔板中。将培养板置于5% CO₂培养箱中。2 在37 °C培养箱中孵育6小时，以促进细胞贴壁。</li>
		<li>贴壁后，用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 2 mL 基础分化培养基 I，在 5% CO₂2 37 °C 培养箱</li>
		<li>为诱导视黄酸（RA），向每孔加入2 µL全反式RA储备液（工作浓度为1 µM），继续诱导分化4天。</li>
		<li>在整个过程中，每2天更换一次全部培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案5的I期分化表1)
	<ol>
		<li>接种约 2 × 104 将mESCs加入2 mL基础分化培养基I中，每孔接种于0.1%明胶包被的6孔板。将培养板置于5% CO₂培养箱中2 在37 °C培养箱中孵育6小时，以促进贴壁。</li>
		<li>用 2 mL PBS 洗涤细胞两次。每孔加入 2 mL 基础分化培养基 I，在 5% CO₂ 条件下培养 2 天以诱导分化。2 37 °C 培养箱</li>
		<li>对于后续的视黄酸（RA）诱导，向每孔中加入2 µL RA储备液，使终浓度为1 µM。将培养板置于5% CO₂培养箱中。2 在37 °C培养箱中继续诱导分化6天。</li>
		<li>在整个过程中，每2天更换一次全部培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案6的I期分化表1)
	<ol>
		<li>植物 1.5 × 106 mESCs 接种于10 mL N2B27 培养基 II 的非黏附性细菌培养皿中（表1以促进拟胚体的形成。</li>
		<li>第2天nd 第天，按照步骤 2.3.2–2.3.3 所述收集细胞聚集体，并用 10 mL 新鲜 N2B27 培养基 II 重悬拟胚体。</li>
		<li>将它们重新接种到新的无黏附性细菌培养皿中，并在5% CO₂条件下继续分化2天。2 在37 °C培养箱中孵育。在显微镜下观察类胚体的形成情况。</li>
		<li>第4天th 第几天，收集拟胚体。将约50个拟胚体每孔接种至经0.1%明胶包被的6孔板中，每孔加入2 mL N2B27培养基II。</li>
		<li>向每个孔中加入 2 µL 全反式 RA 储存液，继续诱导分化 4 天。每两天更换一次全部培养基（含 1 µM RA 的 N2B27 培养基 II）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用方案7的I期分化表1)
	<ol>
		<li>接种约 2 × 104 将mESCs加入2 mL基础分化培养基I中，每孔接种于0.1%明胶包被的6孔板。将培养板置于5% CO₂培养箱中。2 在37 °C培养箱中孵育6小时，以促进贴壁。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞两次。随后，向每孔加入 2 mL N2B27 培养基 II，在 37 °C、5% CO₂ 条件下培养 8 天以诱导分化。2 培养箱</li>
		<li>每2天更换一次全部N2B27培养基II。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 细胞形态观察
<ol>
	<li>每天在倒置相差显微镜下观察上述7组细胞的分化状态。</li>
	<li>在第8天随机选取至少12个视野拍照，记录每组细胞的形态学变化。</li>
</ol>
4. 免疫荧光染色
<ol>
	<li>样品制备：将种子mESCs接种于0.1%明胶包被的盖玻片上，按照步骤2中所述方案进行8天分化培养。</li>
	<li>洗涤：第8天th 第几天，从培养箱中取出样本，吸去分化培养基。用1 mL PBS轻轻冲洗细胞一次，持续5分钟。</li>
	<li>固定：向每个样品中加入1 mL 4%多聚甲醛，在室温（RT）下固定细胞20分钟。</li>
	<li>洗涤：固定后，用 1 mL PBS 轻柔地洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。</li>
	<li>透化：向每个样本中加入1 mL含0.2% TritonX-100的PBS溶液，室温孵育8分钟。</li>
	<li>洗涤：通透化后，用1 mL PBS轻轻洗涤细胞3次，每次5分钟。</li>
	<li>封闭：向每个样本中加入1 mL含10%胎牛山羊血清的PBS溶液，室温孵育1小时，以阻断非特异性结合。</li>
	<li>一抗孵育
	<ol>
		<li>使用含5%正常山羊血清的PBS缓冲液按1:100比例稀释抗Nestin抗体。</li>
		<li>向不同样品中加入500 µL稀释的抗体，于4 °C孵育过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤：移除抗体，用1 mL PBS轻轻洗涤样品，每次8分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>孵育二抗
	<ol>
		<li>使用含5%正常山羊血清的PBS缓冲液将Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG按1:500比例稀释。</li>
		<li>向不同样品中加入500 µL稀释的抗体，在室温下避光孵育2小时。 
		注意：使用荧光二抗后，所有后续步骤均需避光操作，以防止荧光淬灭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>洗涤：移除二抗，用1 mL PBS轻轻洗涤样品，每次8分钟，共洗涤3次。</li>
	<li>细胞核染色与封片
	<ol>
		<li>在干净的载玻片上滴加一滴DAPI封片剂。</li>
		<li>小心地将样品从培养板中取出，将细胞面朝下置于DAPI封片剂上。室温下避光放置5分钟。</li>
		<li>用吸水纸吸去多余的 DAPI 封片剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>荧光显微镜观察
	<ol>
		<li>将样本置于荧光显微镜下，使用适当的滤光片检测 DAPI 和 Alexa Fluor 488 的信号。</li>
		<li>为每个样本均匀且随机地选取10-15个不同的视野，使用CCD相机记录图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 从神经前体细胞向神经元的分化（第二阶段）
<ol>
	<li>按照步骤 2.4 中详述的方案 3（8 天，表 1）进行 mESC 衍生细胞的 I 期分化，该方案的分化效率最高（见 图 3）。 
	注意：I 期分化后，应通过上述的细胞形态学观察和免疫荧光检测进行质量控制，以确保获得健康且高产量的神经前体细胞（NPCs）。</li>
	<li>将约 5 × 105 个 mESC 衍生细胞接种于 2 mL 基础分化培养基 I 中，每孔接种至经 0.1% 明胶包被的 6 孔板中。将 mESC 衍生细胞随机分为 3 组，分别对应 II 期方案 1、方案 2 和方案 3。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中孵育 6 小时，使细胞贴壁，随后用 2 mL PBS 洗涤两次。</li>
	<li>分别向上述各组的每孔中加入 2 mL 基础分化培养基 I、N2B27 培养基 I 和 N2B27 培养基 II（表 2）。</li>
	<li>将培养板放回培养箱中，继续分化 10 天，每 2 天更换相应的培养基。</li>
	<li>检查分化状态，并记录如步骤 3 中所述的形态学变化。</li>
	<li>在第 18 天，评估神经元（β-Tubulin III 阳性）的生成情况，并利用步骤 4 中的方法确定三种方案的分化效率。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在本研究中，我们建立了一种简单且高效的从小鼠胚胎干细胞（mESCs）向神经元分化的诱导方法，该方法成本低且所需材料易于获取。该方法中，先进行2天的拟胚体形成，随后进行6天的视黄酸（RA）诱导，可有效促进mESCs向神经前体细胞（NPCs）分化（I阶段-方案3）。在II阶段分化中，N2B27培养基II（II阶段-方案3）对NPCs向神经元的分化诱导效果最佳。为确保实验成功，需特别关注若干关键步骤。
首先，类胚体的健康状态是整个分化过程的关键。三维类胚体的形成通常用于引导胚胎干细胞的分化8。在本研究中，我们探讨了类胚体悬浮培养的合适时间。如图2所示，在该条件下悬浮培养2天后，形成了具有明亮核心的圆形类胚体。然而，当培养4天时，许多类胚体相互黏连，且其核心变暗，表明核心细胞发生了凋亡。后续的分化结果进一步证实了延长类胚体形成时间所带来的不良影响。在一些已有报道的研究中，类胚体的悬浮培养时间可长达10天，但所用培养基中胎牛血清（FBS）浓度较低或不含FBS<sup class="xr...

胚胎干细胞（ESCs）具有多能性，在特定条件下可分化为神经前体细胞（NPCs），并进一步分化为神经元1基于ESC的神经发生为模拟神经发生过程提供了最佳平台，因此可作为一种有效的工具&#160;发育生物学研究，并可能助力再生医学2,3在过去的几十年中，已有多种诱导胚胎神经发生的方法被报道，例如转基因方法4，使用小分子5，使用三维基质微环境6，以及共培养技术7然而，这些方案大多受限于特定条件或操作难度较高，因此不适合在大多数实验室中使用。
为了寻找一种操作简便且成本低廉的方法，以实现从小鼠胚胎干细胞（mESCs）高效地进行神经分化，本研究采用了组合筛选策略。如图1所示，将整个胚胎神经发生过程分为两个阶段。第一阶段（Phase I）指mESCs向神经前体细胞（NPCs）分化的过程，第二阶段（Phase II）则涉及NPCs进一步向神经元的后续分化。根据操作简便、成本低、材料易得以及高分化效率的原则，分别在第一阶段筛选了七种方案，在第二阶段筛选了三种方案，这些方案基于传统的贴壁单层培养体系或类胚体形成体系8,9。通过细胞形态学观察和免疫荧光检测，对两个阶段中各方案的分化效率进行了评估。通过组合各阶段中最高效的方案，我们建立了优化的小鼠胚胎干细胞神经分化方法。

<table><tbody><tr><td>抗巢蛋白抗体 [大鼠-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td><td>保存于 -80 &amp;deg;C，避免反复冻融</td></tr><tr><td>兔源抗&amp;beta;-微管蛋白 III 抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td><td>保存于 -80 &amp;deg;C，避免反复冻融</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠 IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>B-27 补充剂（50X），无血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td><td>Selleck</td><td>S1263</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 标记山羊抗兔 IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，避免反复冻融</td></tr><tr><td>荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>室温保存</td></tr><tr><td>GlutaMAX 补充剂</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>免疫染色一抗稀释缓冲液</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>KnockOut 血清替代物</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，避免反复冻融</td></tr><tr><td>人白血病抑制因子</td><td>Sigma</td><td>L5283</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>含 DAPI 的水性封片剂（Fluoroshield）</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td><td>保存于 4 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>N-2 补充剂 (100X)</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Jackson</td><td>005-000-121</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>非粘附性细菌培养皿</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (1X)</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>PD0325901（Mirdametinib）</td><td>Selleck</td><td>S1036</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>视黄酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>保存于 -80 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>129 品系小鼠胚胎干细胞</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>维持于无饲养层培养体系中</td></tr><tr><td>干细胞冻存液（无 DMSO）</td><td>ZENOAQ</td><td>stem cellbanker DMSO free</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C，避免反复冻融</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶 (1X) 溶液</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td><td>保存于 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>保存于 4 &amp;deg;C，并避光</td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td><td>保存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经发生关键机制并可能促进再生医学研究的有力工具。本文建立了一种高效且低成本的小鼠胚胎干细胞体外神经元分化方法。, 采用组合筛选策略。在本方案所定义的条件下，经过2天的拟胚体形成和6天的视黄酸诱导，可实现小鼠胚胎干细胞（mESCs）向神经前体细胞（NPCs）的快速高效分化，表现为形成结构紧密、具有神经突样形态且Nestin阳性的A2lox和129系衍生物。拟胚体的健康状态、视黄酸（RA）处理的时间点以及RA浓度均对分化过程至关重要。在后续由NPCs向神经元的分化过程中，N2B27培养基II（添加Neurobasal培养基）更有利于神经元细胞的长期维持与成熟。该方法效率高、成本低、操作简便，可成为神经生物学与发育生物学研究的有力工具。

2天类胚体形成+6天视黄酸诱导在促进mESCs向NPCs分化方面效果最佳（第一阶段）。为确定最有利于mESCs向NPCs分化的最佳方案（第一阶段），在A2lox和129两种mESCs系中测试了7种不同方案（表1），并通过光学显微镜监测各组细胞的分化状态。如图3A所示，在“2天类胚体形成+6天视黄酸诱导”处理组（第一阶段方案3）中，大多数A2lox和129细胞系的衍生物呈现出紧密堆积且具有神经突样形态，表明已形成NPCs。然而，在“4天类胚体形成+4天视黄酸诱导”处理组（第一阶段方案2）中，细胞状态较差并出现凋亡现象，可能由于类胚体内部营养不足所致。单层培养结合视黄酸诱导（第一阶段方案4和5）也可引导mESCs分化，但神经突样细胞的比例不及第一阶段方案3。同时，第一阶段方案6和7中的大多数A2lox和129衍生物细胞胞体较小，并倾向于发生凋亡，提示N2B27培养基II不能有效支持胚胎神经发生。
为了进一步确认神经前体细胞（NPCs）的形成，采用免疫荧光检测各组中Nestin阳性细胞（NPCs...

本文建立了一种低成本且易于操作的方法，可实现胚胎干细胞向神经元的快速高效分化。该方法适用于在各实验室中推广应用，可为神经科学研究提供有力工具。

小鼠胚胎干细胞（mESCs）的神经分化是阐明神经发生过程中关键机制的潜在工具，以及……

从小鼠实验中进行神经元分化是阐明神经发生过程中关键机制的优良模型。我们展示了一种利用公司toro筛选策略优化的胚状体神经发生方法。该技术具有高效、低成本和操作简便的优点，适合在实验室中推广应用。它是神经科学研究中一种强大的工具。采用方案一进行分化时，将20,000个鼠胚胎干细胞接种至含有2毫升基础分化培养基的0.1%明胶包被的六孔板中，每孔一孔。细胞贴壁后，用2毫升PBS洗涤细胞，每孔加入2毫升基础分化培养基，然后将细胞放回培养箱中继续培养。让细胞分化8天，每两天更换一次培养基。进行方案二时，将150万个鼠胚胎干细胞加入含有10毫升基础分化培养基的非黏附性细菌培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育培养板，以促进胚胎体形成。两天后，将细胞聚集体转移至15毫升离心管中，静置沉降。吸去上清液，加入10毫升新鲜的基础分化培养基重悬胚状体。然后将其重新接种至新的非黏附培养皿中，继续培养两天。收集约50个胚状体，将其接种到含2毫升基础分化培养基的六孔板中（每孔接种），六孔板需预先用明胶包被。进行视黄酸诱导时，向每个孔中加入2微升视黄酸储备液，使终浓度为1微摩尔。将培养板放回培养箱中，继续分化细胞4天。若采用方案三进行分化，则重复方案二的操作，但仅允许胚胎小体形成2天，随后进行6天的视黄酸诱导。应通过显微镜检查对拟胚体的形成进行质量控制。只有具有明亮核心的拟胚体才能在后续过程中成功分化。对于方案四，将每孔20,000个鼠胚胎干细胞接种至明胶包被的培养板中，并按照方案一进行操作。在细胞分化培养四天后，向每个孔中加入2 µL全反式维甲酸（all trans RA）储备液，并将培养板继续孵育四天。要执行方案五，请重复方案四的操作，但在分化仅两天后即开始RA诱导。对于方案六，将150万个干细胞接种至含有10 mL N2B27培养基二的非黏附性细菌培养皿中，于37°C和5% CO₂条件下孵育，以促进类胚体的形成。两天后，按照先前所述方法收集细胞聚集体，并用10毫升新鲜的N2B27培养基二重新悬浮拟胚体。将其接种至新的非黏附性细菌培养皿中，继续分化两天。第四天时，收集拟胚体，并将每孔约50个拟胚体接种到经明胶包被的六孔板中，每孔加入2毫升N2B27培养基二。向每个孔中加入2 µL的全反式RA储备液，并继续诱导分化4天。进行方案七时，将约20,000个细胞接种于2 mL基础分化培养基中，每孔接种至明胶包被的培养板。待细胞贴壁后，用PBS洗涤两次，然后向每孔加入2 mL N2B7培养基2，于37°C和5% CO₂条件下培养8天，使细胞分化。采用方案三进行第一阶段分化后，将约500,000个鼠胚胎干细胞衍生物以每孔2毫升基础分化培养基接种至0.1%明胶包被的培养板中。将这些衍生物随机分为三组，以测试三种第二阶段分化方案。将培养板孵育6小时后，用2毫升PBS洗涤细胞两次，并根据具体方案向每孔加入2毫升基础分化培养基、N2B27培养基一或N2B27培养基二。将培养板放入培养箱中，让细胞再分化10天，每两天更换相应的培养基。共测试了七种方案，以确定小鼠胚胎干细胞向普通前体细胞或NPCs分化的最佳方案。这些方案在A2lox细胞和129细胞上均进行了测试，并使用光学显微镜监测每组细胞的分化状态。在方案三中，大多数A2lox和129衍生细胞表现出良好的堆叠结构及类似神经突起的形态，表明神经前体细胞（NPCs）的形成。然而，采用方案二分化的细胞则呈现凋亡特征，这可能是由于类胚体内部缺乏营养所致。为进一步确认NPCs的形成，通过免疫荧光检测鉴定了巢蛋白（nestin）阳性的细胞。方案三获得的巢蛋白阳性细胞比例最高，在A2lox和129衍生细胞中分别达到78%和69%。本研究测试了三种将神经前体细胞（NPCs）分化为神经元的方案，结果确定方案三诱导分化的效率最高。在第二阶段方案三中，大多数A2lox和129系衍生物均表现出延长的类神经元结构，具有清晰的神经突和细胞体延伸。免疫荧光检测进一步证实了神经元的生成，在A2lox和129系衍生物中，采用方案三时β-微管蛋白III阳性细胞的比例分别高达68%和59%。在进行该操作时，重要的是确保小鼠细胞在诱导分化前处于健康且未分化的状态。此外，在扩增体形成后以及第二阶段分化前，应进行严格的质量控制。该技术为神经生物学和发育生物学领域的研究人员提供了一个标准模型，有望成为阐明神经发生过程中关键机制的有力工具。

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我们开发了一种新方案以提高效率 体外...

小鼠胚胎干细胞高效分化为运动神经元

本视频演示了一种方法 体外 从小鼠胚胎干细胞（mESCs）生成神经前体细胞（NPCs）。将mESCs在悬浮培养中形成拟胚体（EBs），随后诱导其分化为NPCs 通过...

一种从小鼠胚胎干细胞生成神经前体细胞的技术

该视频展示了一种将神经前体细胞分化为神经元的细胞培养方法。通过在添加了生长因子的富含营养的培养基中孵育细胞，前体细胞成熟为具有发育良好的轴突和树突的神经元。一种稳定剂可确保细胞在整个分化过程中的存活率，并防止氧化损伤。...

神经前体细胞向神经元的分化

本视频展示了一种将胚胎干细胞分化为具有功能性突触的神经元网络群体的技术。该方法概述了胚胎干细胞向神经元分化的步骤、神经元网络形成的诱导过程，以及培养物中网络化神经元的富集方法。...

将小鼠胚胎干细胞分化为神经元网络群体

本文描述了一种定制方案，用于将小鼠胚胎干细胞分化为特定的高纯度神经元群体，这些神经元具有功能性的突触并表现出网络活动特征。电生理学分析表明，在暴露于A至G型肉毒神经毒素及破伤风神经毒素后，突触传递功能丧失。...

利用干细胞来源的中枢神经系统神经元网络培养物对生物性神经毒素进行功能评估

本方案详细描述了使用无血清单层培养法从胚胎干细胞诱导生成神经前体细胞的方法。这些前体细胞可用于分化为成熟的神经细胞类型，或用于研究神经特化过程，并可适用于多孔板形式的化合物筛选高通量扩增。...

小鼠胚胎干细胞在无血清单层培养条件下的神经分化

我们介绍了一种利用小鼠胚胎干细胞生成二维或三维类胚体的技术。随后，我们阐述了如何通过视黄酸诱导类胚体细胞的神经分化，以及如何利用前体细胞标志物的免疫荧光染色和免疫印迹法分析其分化状态。...

二维和三维拟胚体中视黄酸诱导小鼠胚胎干细胞神经分化的分析

本方案描述了一种利用改良的拟胚体转单层法从小鼠胚胎干细胞生成皮层中间神经元前体细胞及有丝分裂后中间神经元前体的方法。这些前体细胞可用于 体外...

小鼠胚胎干细胞向皮层中间神经元前体细胞的分化

本文介绍一种从E13小鼠胚胎神经节隆起中分离神经干细胞的新型显微手术技术。...

小鼠胚胎神经干细胞的分离与培养

本文介绍了一种人类胚胎干细胞单细胞培养及其后续分化为神经前体细胞的实验方案。该方案操作简便、稳定可靠、可扩展性强，适用于药物筛选和再生医学应用。...

利用人胚胎干细胞单细胞培养实现高效神经分化

我们描述了利用悬滴法将小鼠胚胎干细胞在体外分化为神经元细胞的实验步骤。此外，我们通过RT-qPCR、免疫荧光、RNA测序和流式细胞术进行了全面的表型分析。...

小鼠胚胎干细胞向神经前体细胞及神经元的分化与鉴定

学习小鼠胚胎干细胞体外神经元分化的高效方法，通过优化方案三实现78%巢蛋白阳性神经前体细胞和68%β-微管蛋白III阳性神经元的高效诱导。该技术成本低、操作简便，为神经生物学和发育生物学研究提供了标准化模型。

小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

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