小鼠胚胎干细胞体外神经元分化

从小鼠实验中进行神经元分化是阐明神经发生过程中关键机制的优良模型。我们展示了一种利用公司toro筛选策略优化的胚状体神经发生方法。该技术具有高效、低成本和操作简便的优点，适合在实验室中推广应用。

它是神经科学研究中一种强大的工具。采用方案一进行分化时，将20,000个鼠胚胎干细胞接种至含有2毫升基础分化培养基的0.1%明胶包被的六孔板中，每孔一孔。细胞贴壁后，用2毫升PBS洗涤细胞，每孔加入2毫升基础分化培养基，然后将细胞放回培养箱中继续培养。

让细胞分化8天，每两天更换一次培养基。进行方案二时，将150万个鼠胚胎干细胞加入含有10毫升基础分化培养基的非黏附性细菌培养皿中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育培养板，以促进胚胎体形成。两天后，将细胞聚集体转移至15毫升离心管中，静置沉降。

吸去上清液，加入10毫升新鲜的基础分化培养基重悬胚状体。然后将其重新接种至新的非黏附培养皿中，继续培养两天。收集约50个胚状体，将其接种到含2毫升基础分化培养基的六孔板中（每孔接种），六孔板需预先用明胶包被。

进行视黄酸诱导时，向每个孔中加入2微升视黄酸储备液，使终浓度为1微摩尔。将培养板放回培养箱中，继续分化细胞4天。若采用方案三进行分化，则重复方案二的操作，但仅允许胚胎小体形成2天，随后进行6天的视黄酸诱导。

应通过显微镜检查对拟胚体的形成进行质量控制。只有具有明亮核心的拟胚体才能在后续过程中成功分化。对于方案四，将每孔20,000个鼠胚胎干细胞接种至明胶包被的培养板中，并按照方案一进行操作。

在细胞分化培养四天后，向每个孔中加入2 µL全反式维甲酸（all trans RA）储备液，并将培养板继续孵育四天。要执行方案五，请重复方案四的操作，但在分化仅两天后即开始RA诱导。对于方案六，将150万个干细胞接种至含有10 mL N2B27培养基二的非黏附性细菌培养皿中，于37°C和5% CO₂条件下孵育，以促进类胚体的形成。

两天后，按照先前所述方法收集细胞聚集体，并用10毫升新鲜的N2B27培养基二重新悬浮拟胚体。将其接种至新的非黏附性细菌培养皿中，继续分化两天。第四天时，收集拟胚体，并将每孔约50个拟胚体接种到经明胶包被的六孔板中，每孔加入2毫升N2B27培养基二。

向每个孔中加入2 µL的全反式RA储备液，并继续诱导分化4天。进行方案七时，将约20,000个细胞接种于2 mL基础分化培养基中，每孔接种至明胶包被的培养板。待细胞贴壁后，用PBS洗涤两次，然后向每孔加入2 mL N2B7培养基2，于37°C和5% CO₂条件下培养8天，使细胞分化。

采用方案三进行第一阶段分化后，将约500,000个鼠胚胎干细胞衍生物以每孔2毫升基础分化培养基接种至0.1%明胶包被的培养板中。将这些衍生物随机分为三组，以测试三种第二阶段分化方案。将培养板孵育6小时后，用2毫升PBS洗涤细胞两次，并根据具体方案向每孔加入2毫升基础分化培养基、N2B27培养基一或N2B27培养基二。

将培养板放入培养箱中，让细胞再分化10天，每两天更换相应的培养基。共测试了七种方案，以确定小鼠胚胎干细胞向普通前体细胞或NPCs分化的最佳方案。这些方案在A2lox细胞和129细胞上均进行了测试，并使用光学显微镜监测每组细胞的分化状态。

在方案三中，大多数A2lox和129衍生细胞表现出良好的堆叠结构及类似神经突起的形态，表明神经前体细胞（NPCs）的形成。然而，采用方案二分化的细胞则呈现凋亡特征，这可能是由于类胚体内部缺乏营养所致。为进一步确认NPCs的形成，通过免疫荧光检测鉴定了巢蛋白（nestin）阳性的细胞。

方案三获得的巢蛋白阳性细胞比例最高，在A2lox和129衍生细胞中分别达到78%和69%。本研究测试了三种将神经前体细胞（NPCs）分化为神经元的方案，结果确定方案三诱导分化的效率最高。

在第二阶段方案三中，大多数A2lox和129系衍生物均表现出延长的类神经元结构，具有清晰的神经突和细胞体延伸。免疫荧光检测进一步证实了神经元的生成，在A2lox和129系衍生物中，采用方案三时β-微管蛋白III阳性细胞的比例分别高达68%和59%。在进行该操作时，重要的是确保小鼠细胞在诱导分化前处于健康且未分化的状态。

此外，在扩增体形成后以及第二阶段分化前，应进行严格的质量控制。该技术为神经生物学和发育生物学领域的研究人员提供了一个标准模型，有望成为阐明神经发生过程中关键机制的有力工具。