Name: 微图设计及植物和土壤样品制备，进行15次氮气分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习微小区设计方法进行¹⁵N示踪研究，实现玉米生长季多次植物与土壤采样。该技术可量化肥料氮对土壤-作物系统的影响，提升氮肥利用效率与管理指南。

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作者感谢明尼苏达玉米研究提供的支持 &amp;#38; 促进委员会、Hueg-Harrison 研究员项目以及明尼苏达州发现、研究与创新经济（MnDRIVE）研究员项目。

1. 野外地点描述
注意：进行15N示踪田间试验时，所选试验地点应尽量减少因土壤、地形和物理特征引起的变异5。由于坡度、风力或水流迁移以及耕作导致的土壤侧向移动，可能发生交叉污染；而土壤氮素的垂直分布可能受到地下水流和暗管排水的影响6。
<ol>
	<li>描述实验田间试验地点，包括以往的管理措施（如前茬作物和耕作方式）、经纬度、土壤物理和化学性质（如土壤质地分析、初始肥力状况、pH值和土壤容重）。</li>
	<li>记录研究地点及田块四角的GPS坐标。</li>
	<li>描述生长季期间的管理措施，包括病虫害管理（除草剂、杀虫剂或杀菌剂的使用）、土壤养分管理（包括施用量、养分来源、施用位置和施用时间）、耕作措施、灌溉事件及灌溉量，以及残留物管理。</li>
	<li>由于作物生长和微生物介导的氮素转化过程受土壤水分、土壤温度和空气温度的影响，应记录气候信息，包括每日最高和最低气温、每日降水量，以及多个深度（与土壤采样深度相对应）的土壤水分和温度数据。</li>
</ol>
2. 实验设计
<ol>
	<li>种植六行玉米（约86,000株/ha）-1在76 cm行距下种植，最终小区尺寸为15.2 m × 4.6 m。
	<ol>
		<li>在纵向长度的两端各设立1.5米的边界区域（0–1.5米，13.7–15.2米），并在取样区和收获区相邻处增设一段长1.5米的边界区域（9.8–11.3米）图1).</li>
		<li>将第2行和第3行指定为当季植株和土壤采样区（1.5–9.8 m），将第4行和第5行指定为玉米籽粒产量收获区（1.5–9.8 m）。</li>
		<li>建立一个面积为11.3–13.7 m的微区试验地，尺寸为2.4 m × 3.8 m，以宽度方向居中。收集所有 15该区域的植物和土壤样品富含氮，取样时在长度和宽度方向上均保留 0.38 m 的未取样边界，以尽量减少边缘效应（图2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用不同颜色的标记旗标示处理小区和微区的角落。</li>
</ol>
3. 土壤与植物样品的注意事项
<ol>
	<li>为未富集材料和富集材料分别使用专用的设备和处理区域。富集材料对未富集材料（肥料、土壤或植物）的污染，或反之，会显著影响实验结果。</li>
	<li>按照预期15N富集度从低到高的顺序收集和处理15N富集的土壤和植物样品，以最大限度减少交叉污染。每次处理不同样品之间，须彻底清洁工作台面、手套、工具和仪器，以最大限度降低样品残留导致的交叉污染。</li>
	<li>尽量减少微区内的人员走动，以防止未富集取样区域受到污染。进入微区时应穿戴防护鞋套，离开微区时应将其脱下。</li>
</ol>
4. 15N 标记肥料的制备与施用
<ol>
	<li>根据参考文献2中关于肥料15N利用效率（F15NUE）研究的指导原则，将10 atom % 15N标记的尿素稀释为5 atom % 15N标记的尿素，并溶于2 L去离子水中，以确保尿素肥料的均匀标记。 
	注意：所需15N标记肥料的浓度取决于农学研究的目标。如果储备的15N标记肥料浓度过高，可使用常规未标记肥料进行稀释，稀释比例可依据以下公式3计算： 
	X2 = [(C1/C2) - 1] × X1 
	其中，X2为所需添加的常规未标记肥料质量，X1为示踪剂肥料质量，C1为原始示踪剂肥料的同位素浓度（以原子百分比过量表示，即实测原子百分比减去自然本底浓度，通常取0.3663 atom %），C2为最终混合物的同位素浓度。例如，若使用100 g 10 atom %标记的尿素，要获得最终5 atom %的同位素浓度，则需加入92.7 g常规未标记肥料： 
	X2 = {[(10 - 0.3663)/5] - 1} × 100。</li>
	<li>分析溶液中的15N浓度以验证标记效果。作者使用了加州大学戴维斯分校稳定同位素实验室提供的分析服务。 
	注意：土壤-植物-微生物体系对肥料添加的反应可能受肥料物理形态的影响。根据研究目标，尿素溶液可直接以液态施用，或脱水重结晶。结晶物可通过Carver压片机在10,000 psi压力下压制成片，随后粉碎并过筛至所需粒径3。</li>
	<li>使用校准过的背负式CO2喷雾器将15N标记的尿素溶液均匀施用于微区（图3A）。若实验涉及多个氮施用量或不同标记水平，建议为每个标记水平指定专用的CO2喷雾器，或使用同一喷雾器时按从低到高标记浓度的顺序施用，以尽量减少处理间的交叉污染。</li>
	<li>在施肥后24小时内，通过轻度耕作、手工耙地或至少0.6 cm的灌溉将含尿素肥料混入土壤，以最大限度降低氨挥发损失的风险。</li>
	<li>在第二个生长季期间，微区不再施用额外的15N标记尿素肥料。为避免因氮素差异导致玉米生长响应不同，应对整个试验区施用常规未标记尿素。</li>
</ol>
5. 田间样品处理：地上部玉米生物量
<ol>
	<li>在每个取样阶段，从取样区域内采集六株地上玉米植株的混合样品（15N（未富集）和一个地上部分六株玉米植株的混合样品 15富氮小区。每个取样植株之间应至少间隔两株植物，以避免显著改变植株生长动态。作者在玉米生理发育的V8和R1期采集了植物样品。11 生理成熟期（图2).</li>
	<li>按照步骤 3.1 和 3.2 中所述原则，将 V8 和 R1 地上生物量切碎（≤5 cm × ≤5 cm）；可使用园林碎枝机，效果令人满意。将切碎的生物量放入标记好的布袋或纸袋中，并置于强制通风烘箱中烘干 60 °C 直至恒重。记录生物量干重（图3B).</li>
	<li>将生理成熟的玉米植株分为秸秆（包括叶片、苞叶和茎秆等所有营养组织）、籽粒和穗轴部分。切碎后置于强制通风烘箱中干燥 60 °C 直至恒重。记录生物量干重。</li>
	<li>在小区内，将所有玉米秸秆在土表处割断，捆成束，按小区标记后移出田间（图3C). 调整微区角落的标志旗，使其几乎与土壤表面齐平，以尽量降低在收获期间或收获后耕作时被联合收割机移除的风险。</li>
	<li>从收获区域收获谷物，并将产量折算为15.5%含水量下的报告值12. 使用小区收割机采集剩余的试验区域。</li>
	<li>从微区外收集未经富集的生物量。将微区地上部分的生物量切碎后重新施加到相应的样地图3D).</li>
	<li>将残茬通过耕作混入土壤表层，注意尽量减少土壤和玉米残茬在微区范围内的输入或输出。若因耕作移除了微区角落的标记旗，应及时更换。</li>
	<li>将第二年种植的玉米种在与第一年玉米相同的行上。</li>
	<li>仅在生理成熟期采集第二年地上部玉米生物量，并按照步骤5.3所述方法处理，如同第一年玉米样品。从微区中心区域（1.52 m × 0.76 m）采集微区样品，以避免耕作后可能发生的信号稀释图2）。从收获区收获谷物，并将产量折算为含水量15.5%时的产量进行报告。</li>
	<li>按照步骤 3.1 和 3.2 的原则，将 100 至 200 g 干燥植物材料充分混合并研磨，使其通过 2 mm 筛孔。充分混合研磨后的材料，并将一部分样品置于标记好的纸币袋中保存，用于后续处理。 
	注意：托马斯 Wiley 磨粉机适用于植物组织研磨，而 Perten 实验室磨粉机 3610 适用于谷物研磨。 
	注意：研磨植物样品的人员应佩戴护耳器，并佩戴经美国国家职业安全与健康研究所（NIOSH）认证的 N95 颗粒物过滤口罩，以防止吸入粉尘。</li>
</ol>
6. 野外样品处理：土壤
<ol>
	<li>在种植后第8天采集第一年的土壤样品 15氮肥施用时期为V8期、R1期、收获后至耕作前。在第二年种植前和收获后采集土壤样品。由于采样操作的限制，作者在生长季内采集了0–15 cm、15–30 cm和30–60 cm深度的土壤样品，收获后采集了0–15 cm、15–30 cm、30–60 cm和60–90 cm深度的土壤样品，第二年种植前采集了0–30 cm、30–60 cm和60–120 cm深度的土壤样品。 
	注意：若土壤取样器无法将土壤样品采集至目标最大深度作为单个土芯，则应从同一钻孔中采集更深层的土芯，同时弃去上层1 cm的土壤，以避免上层土壤掉落造成的污染。
	<ol>
		<li>在V8和R1期，从无养分添加的采样区域使用手提式取土器采集四芯（直径1.8 cm）复合土壤样品。其中1个土芯取自玉米垄内，另3个土游戏副本取自玉米垄间。</li>
		<li>在播种前和收获后，使用液压取样器从未添加养分的采样区域采集两个芯（直径5 cm）的复合土壤样品。</li>
		<li>在微区试验田采集15芯（直径1.8 cm）的复合土壤样品，采样时间为处理后第8天 15使用手提式探针在V8期和R1期施用氮素富集肥料，于玉米行内采集3至4个土芯，行间采集11至12个土芯。 
		注意：土壤具有高度异质性。从富集小区内采集的土芯数量越多，对真实情况的估计越准确 15土壤氮的氮富集13.</li>
		<li>在小区内于播种前和收获后，使用液压取样器采集三个土芯（直径5 cm）的复合土壤样品。</li>
		<li>将每个复合土壤样品在桶中混匀，然后放入预先标记好的纸袋中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>干燥土壤样品于 35 °C 在强制通风烘箱中烘干至恒重。将每个样品研磨，使其通过2 mm筛。若能在每份样品之间彻底清洁，机械土壤研磨机即可满足要求。 
	注意：土壤样品可通过将样品平铺在托盘上以薄层进行风干。托盘应放置在无外界氮源污染的区域。未富集样品与富集样品应物理分隔，以防止交叉污染。 
	注意：研磨土壤样品的人员应佩戴护耳器，并佩戴经美国国家职业安全与健康研究所（NIOSH）认证的N95颗粒物防护口罩，以防止吸入粉尘。</li>
</ol>
7. 实验室样品处理：研磨土壤和植物样品
<ol>
	<li>将粉碎的植物样品（2 mm）置于60 °C的烘箱中过夜干燥。</li>
	<li>按照步骤3中所述原则，将干燥的植物样品或土壤材料研磨至细腻、类似面粉的质地。可使用滚筒研磨罐作为合适的研磨方式。 
	注意：作者使用的研磨罐为自行设计的传送带系统，可同时处理54个滚筒罐。
	<ol>
		<li>将每个滚筒罐（250 mL硼硅酸盐玻璃罐，带螺口盖）装入10至20 g粉碎后的植物或土壤样品以及7根不锈钢棒（长8.5 cm，直径0.7 cm）。</li>
		<li>以0.4 × g的转速滚动滚筒罐6–24小时，或直至样品达到细腻、类似面粉的质地。</li>
		<li>将研磨好的细粉转移至洁净并已标记的20 mL闪烁小瓶中。</li>
		<li>每处理完一个样品后，需用肥皂和水清洗滚筒罐、不锈钢棒和盖子，以去除任何残留物。
		<ol>
			<li>将滚筒罐和盖子浸入5% HCl酸浴中（由36–38%浓盐酸配制）过夜14。 
			警告：盐酸具有腐蚀性，可导致严重皮肤灼伤、眼部损伤，吸入后有害。操作时务必穿戴防护服、手套及眼部和面部防护装备。若接触皮肤或眼睛，应立即用大量清水彻底冲洗。运输酸液时必须使用次级容器。配制时务必始终将酸缓慢加入水中，因该反应为放热反应。酸液泄漏时应立即用碳酸氢钠中和。 
			注意：可配制大体积酸浴，例如在208 L塑料容器中配制100 L的5% HCl溶液。应在通风橱内分批配制若干小体积溶液，再转移至塑料容器中。每三个月更换一次酸浴溶液。</li>
			<li>用去离子水对滚筒罐和盖子进行三次冲洗，并自然晾干。</li>
			<li>将不锈钢棒浸入0.05 M NaOH溶液中过夜14（通过将2 g NaOH溶于1 L去离子水中配制）。每天需配制新的0.05 M NaOH溶液。 
			警告：氢氧化钠可导致严重皮肤灼伤和眼部损伤。操作时务必穿戴防护服和眼部防护装备。一旦衣物被污染，应立即脱去，并用清水冲洗皮肤或眼睛数分钟。</li>
			<li>用流动的热水冲洗不锈钢棒5分钟。倾去废水后，再用去离子水冲洗三次。将不锈钢棒置于铺有纸巾的托盘上自然晾干。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 称取研磨后的植物和土壤样品，用于总氮和15N分析
<ol>
	<li>分析若干具有代表性的植物和土壤样品的全氮含量（例如，通过燃烧法分析15）。根据分析仪的技术要求，计算可提供足够氮含量用于15N分析的样品质量。 
	注意：作者使用了加州大学戴维斯分校稳定同位素设施提供的分析服务。富集样品的称样量优化目标为含20 µg氮，最大不超过100 µg氮。</li>
	<li>将样品按预期15N丰度从低到高排序。在每次运行中，每隔第八至第十二个样品设置一个重复样，以检验样品的精密度。每次运行至少包含一个检核查样16。</li>
	<li>标记一个洁净的96孔板及其配套盖子，并安装单个孔的防蒸发环。将一张洁净的索引卡裁剪至略小于盖子内径的尺寸，放入盖内，以防止运输过程中样品在孔间移动。</li>
	<li>佩戴腈手套，使用实验室擦拭纸和乙醇清洁微量天平、工作台面、药匙和镊子。将清洁后的工具放置在实验台上的吸水纸上。 
	注意：未富集和已富集的样品应使用独立的天平和工具处理，以避免交叉污染。</li>
	<li>使用镊子将一个预先成型的5 mm × 9 mm锡胶囊置于洁净的工作表面上，例如带有5 mm × 8 mm凹槽的不锈钢块上。轻轻敲击胶囊使其落入凹槽，必要时重塑其圆柱形状并压平底部。 
	注意：由于样品质量极小，样品污染风险较高。切勿用手套接触胶囊。若胶囊接触到除镊子、洁净工作面、天平称盘或96孔板以外的任何表面，应立即丢弃。</li>
	<li>用镊子轻轻将胶囊顶部约1 mm部分向外翻展，以便后续操作。为避免在去皮时损坏天平，将胶囊悬停于微量天平称盘上方1至2 mm处再释放。对胶囊去皮归零。使用镊子将胶囊放回洁净的工作表面。</li>
	<li>使用药匙小心地将所需质量的细磨样品加入胶囊中。避免将样品洒落在胶囊外表面或工作台上。</li>
	<li>使用镊子缓慢压紧胶囊上部三分之一处，并折叠封口。继续用镊子将胶囊折叠并压成球形，注意不要刺穿或撕裂锡箔。 
	注意：氮含量较低的样品可能需要超过5 mm × 9 mm胶囊容量的样品量。此时可使用更大的胶囊（例如9 mm × 10 mm）。</li>
	<li>使用镊子将封装好的胶囊从1 cm高度多次轻摔在洁净的深色表面或镜面上，检查是否泄漏。若未见粉尘逸出，则采用与步骤8.6所述相同的方法称量样品重量。记录样品质量。将胶囊放入96孔板中，并记录其所在孔位。
	<ol>
		<li>若在深色表面上出现粉尘，记录样品重量。将样品用第二个锡胶囊重新包裹，再次检查是否泄漏，并将其放入洁净的96孔板中。 
		注意：若包裹后的胶囊过大无法放入96孔板，可使用24孔板或48孔板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在处理不同样品之间，使用乙醇和实验室擦拭纸清洁所有工具和表面，特别注意药匙和镊子的边缘部分。</li>
	<li>用胶带将96孔板盖子固定，并将板子存放在干燥器中。</li>
</ol>
9. 计算
<ol>
	<li>使用以下公式计算植物或土壤样品中所含氮的质量（kg∙ha-1）。 
	<img src="/files/ftp_upload/61191/61191eq1.jpg" alt="总氮计算公式，显示植物样品的氮含量分析。" data-altupdatedat="1788250015000"> 
	<img src="/files/ftp_upload/61191/61191eq2.jpg" alt="土壤总氮计算公式，用于土壤分析；公式中包含质量与密度参数。" data-altupdatedat="1788250015000"></li>
	<li>计算植物和土壤样品的肥料氮比例（Nf）、肥料来源氮（FDN）和土壤来源氮（SDN）17。 
	<img src="/files/ftp_upload/61191/61191eq3.jpg" alt="静态平衡公式，Nf 方程显示养分流动，是理解土壤养分动态的关键。" data-altupdatedat="1788250015000"> 
	其中 A 为 15N 的原子百分比富集度。</li>
	<li><img src="/files/ftp_upload/61191/61191eq4.jpg" alt="植物或土壤氮方程，\(FDN_{Plant\ or\ Soil} = N_f \times Total\ N_{Plant\ or\ Soil}\)。" data-altupdatedat="1788250015000"> 
	<img src="/files/ftp_upload/61191/61191eq5.jpg" alt="氮平衡方程；SDN = 总氮 - FDN；土壤养分分析公式。" data-altupdatedat="1788250015000"></li>
	<li>计算肥料15N利用效率17。 
	<img src="/files/ftp_upload/61191/61191eq6v2.jpg" alt="肥料氮利用效率方程，图示利用植物与肥料数据计算F15NUE的方法。" data-altupdatedat="1788250015000"></li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

稳定同位素研究是追踪和量化土壤-作物系统中固定氮（FDN）的有效工具。然而，氮示踪研究涉及三个主要假设，若这些假设被违背，则可能使采用该方法所得出的结论无效。这些假设是：1）示踪剂在整个系统中均匀分布；2）所研究过程的发生速率保持一致；3）从15N富集池中离开的氮不会重新返回3。由于本研究关注的是总固定氮在整个土壤-作物系统中的分布情况，因此假设2和假设3的影响极小21。
由于15N标记物质成本较高，通常会限制15N示踪研究的规模。因此，在开展氮素示踪研究之前，研究人员应仔细规划研究目标，需考虑以下因素：取样次数、研究持续时间（数天至数年）、氮肥施用量，以及在施用15N标记肥料后，由于与大量土壤氮的混合稀释，仍能从自然丰度（0.366 原子%）中检测出差异所需的15N富集浓度2。参考文献2中已报道了不同类型农学研究中常用的...

氮肥（N）的使用对于满足全球不断增长人口对粮食、纤维、饲料和燃料的需求至关重要，但农田中氮素的流失可能对环境质量产生负面影响。由于氮素在土壤-作物系统中会经历多种转化过程，因此有必要更深入地了解氮素循环、作物对氮素的吸收利用以及肥料氮素的总体归趋，以改进管理措施，提高氮素利用效率，并最大限度减少氮素对环境的损失。传统的氮肥研究主要关注处理措施对季末指标的影响，例如作物产量、作物氮素吸收量相对于施氮量的比率（表观肥料利用率）以及土壤中残留的氮素含量。尽管这些研究能够量化整个系统的氮素输入、输出和利用效率，但无法识别或量化来源于肥料或土壤的氮素在土壤-作物系统中的具体去向。必须采用基于稳定同位素的不同方法，来追踪和量化来源于肥料的氮素（FDN）在土壤-作物系统中的归趋。
氮有两种稳定同位素， 14氮和 15N，在自然界中以约272:1的相对恒定比例存在 14N/15N1 （浓度为 0.366 原子 %） 15N 或 3600 ppm 15N2,3）。添加 15氮富集肥料增加总产量 15土壤系统中的氮含量。如 15氮富集肥料与非富集土壤氮混合后，所测得的变化 14N/15氮素比例使研究人员能够追踪土壤剖面中的固定态氮（FDN）及其向作物中的迁移3,4. 可通过测量总质量来计算质量平衡 15系统及其各部分中的氮示踪剂2。因为 15氮富集肥料明显比常规肥料昂贵， 15氮富集微区通常嵌套于处理样地之内。本文旨在描述一种小样地研究方法&#160;利用微区设计在玉米生长季内进行多次土壤和植株取样Zea mays L.) 及制备植物和土壤样品以测定全量元素的方案 15氮素分析。这些结果可用于估算氮肥利用效率，并建立包含原状土壤和作物中固定态氮（FDN）的氮素部分收支平衡。

<table><tbody><tr><td>20 mL 闪烁瓶</td><td>ANY；Fisher Scientific 为一个示例</td><td>0334172C</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 硼硅酸盐玻璃瓶</td><td>QORPAK</td><td>264047</td><td></td></tr><tr><td>48 孔板</td><td>EA Consumables</td><td>E2063</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>EA Consumables</td><td>E2079</td><td></td></tr><tr><td>布质零件袋（30×50 cm）</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>用于玉米穗</td></tr><tr><td>CO2 背负式喷雾器</td><td>ANY；Bellspray Inc 为一个示例</td><td>Model T</td><td></td></tr><tr><td>硬币信封（6.4×10.8 cm）</td><td>ANY；ULINE 为一个示例</td><td>S-6285</td><td>用于 2 mm 研磨植物样品</td></tr><tr><td>玉米切碎机</td><td>ANY；DR Chipper Shredder 为一个示例</td><td>SKU:CS23030BMN0</td><td>用于切碎玉米生物量</td></tr><tr><td>玉米种子</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>适合该地区的杂交品种</td></tr><tr><td>一次性鞋套</td><td>ANY；Boardwalk 为一个示例</td><td>BWK00031L</td><td></td></tr><tr><td>200 试验证乙醇</td><td>ANY；Decon Laboratories Inc. 为一个示例</td><td>2701TP</td><td></td></tr><tr><td>带抽绳的织物袋（90×60 cm）</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>用于植物样品采集</td></tr><tr><td>尿素肥料（46-0-0）</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>~0.366 原子% 15N</td></tr><tr><td>手耙</td><td>ANY；Fastenal Company 为一个示例</td><td>5098-63-107</td><td></td></tr><tr><td>手用镰刀</td><td>ANY；Home Depot 为一个示例</td><td>NJP150</td><td>用于植物样品采集</td></tr><tr><td>手持式土壤取样探针</td><td>ANY；AMS 为一个示例</td><td>401.01</td><td></td></tr><tr><td>液压土壤取样探针</td><td>ANY；Giddings 为一个示例</td><td>GSPS</td><td></td></tr><tr><td>盐酸，12N</td><td>Ricca Chemical</td><td>R37800001A</td><td></td></tr><tr><td>研磨罐磨机</td><td>ANY；Cole-Parmer 为一个示例</td><td>SI-04172-50</td><td></td></tr><tr><td>实验室磨粉机</td><td>Perten</td><td>3610</td><td>用于研磨谷物</td></tr><tr><td>精确至四位小数的微量天平</td><td>ANY；Mettler Toledo 为一个示例</td><td>XPR2</td><td></td></tr><tr><td>N95 颗粒物过滤式面罩呼吸器</td><td>ANY；ULINE 为一个示例</td><td>S-9632</td><td></td></tr><tr><td>氯丁橡胶或丁基橡胶手套</td><td>ANY</td><td>NA</td><td>用于盐酸浴操作</td></tr><tr><td>纸质五金袋（13.3×8.7×27.8 cm）</td><td>ANY；ULINE 为一个示例</td><td>S-8530</td><td>用于土壤样品和玉米籽粒</td></tr><tr><td>植物研磨机</td><td>ANY；Thomas Wiley Model 4 Mill 为一个示例</td><td>1188Y47-TS</td><td>用于将切碎的玉米生物量研磨至 2 mm 颗粒</td></tr><tr><td>塑料标签</td><td>ULINE</td><td>S-5544Y-PW</td><td>用于标记织物袋和微区茎秆捆</td></tr><tr><td>氢氧化钠颗粒，ACS 级</td><td>Spectrum Chemical</td><td>SPCM-S1295-07</td><td></td></tr><tr><td>土壤研磨机</td><td>ANY；AGVISE 不锈钢研磨机带电机为一个示例</td><td>NA</td><td>用于将土壤研磨并通过 2 mm 筛网</td></tr><tr><td>锡胶囊 5×9 mm</td><td>Costech Analytical Technologies Inc.</td><td>041061</td><td></td></tr><tr><td>锡胶囊 9×10 mm</td><td>Costech Analytical Technologies Inc.</td><td>041073</td><td></td></tr><tr><td>尿素（46-0-0）</td><td>MilliporeSigma</td><td>490970</td><td>10 原子% 15N</td></tr></tbody></table>

微区设计及用于15氮分析的植物与土壤样品制备

Microplot Design and Plant and Soil Sample Preparation for 15Nitrogen Analysis

许多&#160;氮肥研究通常评估处理措施对生长季末指标（如籽粒产量或氮素累积损失）的总体效应。要追踪并量化肥料来源氮（FDN）在土壤-作物系统中的去向，必须采用稳定同位素方法。本文旨在描述一种小块田间试验&#160;采用非受限设计 15两个生长季内用于多次土壤和植物取样的氮富集微区试验，以及总氮 15氮素分析。本方法通过在美国明尼苏达州中南部开展的一项重复种植玉米的研究进行演示（玉米（Zea mays） L.）。每个处理包括六行玉米（行距76 cm），行长15.2 m，一端嵌入一个微型小区（2.4 m × 3.8 m）。施用肥料级尿素，氮素用量为135 kg N∙ha⁻¹。-1 种植时，微区施用氮-15丰度为5原子百分比的尿素 15在生长季节期间多次采集土壤和植物样品，所有操作过程中均使用独立工具，并将未富集与富集样品进行物理分离，以尽量减少交叉污染。土壤和植物样品经干燥后，先研磨至可通过2 mm筛网，再使用滚压研磨机进一步研磨至类似面粉的细度。示踪研究需要额外的规划、更长的样品处理时间与更多的人工投入，并会产生更高的成本 15与传统的氮素研究相比，氮富集材料和样品分析能够提供更精确的信息。然而，通过质量平衡方法，结合生长季内多次取样事件的示踪研究，研究人员可估算肥料氮在土壤-作物系统中的分布，并估算系统中未被计入的肥料氮去向。

本文所展示的结果来自 2015 年建立于明尼苏达大学位于明尼苏达州威西卡附近的南部推广与研究中心的田间试验点。该试验点在 2015 年之前采用玉米–大豆［Glycine max (L.) Merr］轮作体系，而在 2015 年和 2016 年生长季期间则采用玉米–玉米轮作体系。土壤类型为 Nicollet 壤质黏土（细质地壤土，混合型，高活性，中性湿润半淀积土）–Webster 壤质黏土（细质地壤土，混合型，高活性，中性典型湿润潜育土）复合体。除氮素（N18）外，土壤养分管理均按照大学推荐方案进行。多个氮肥处理采用随机完全区组设计，设四个重复，但本文仅展示种植时施用 135 kg N∙ha-1 尿素的处理。土壤容重采用 intact core 方法测定19，在每个重复中，于 0–15 cm、15–30 cm、30–60 cm、60–90 cm 和 60–120 cm 深度层次的中心位置采集两个 5 cm 深度的样品。容重数据在各深度层次内...

本文描述了一种适用于多次生长季内植物和土壤取样事件的15N示踪研究的微区试验设计。同时提出了用于15N分析的土壤和植物样品采集与处理步骤，包括研磨和称重操作规程。

许多氮肥研究评估处理措施对生长季末指标（如籽粒产量或氮素累积损失）的总体影响。

该方法可帮助研究人员量化肥料驱动的氮素对土壤-作物系统的影响，并解答有关氮素利用效率的问题。该技术的主要优势在于，可在连续两个生长季内进行多次土壤和植株取样。该方法有助于我们更深入地理解氮素循环中的矿化和迁移过程，从而改进氮肥管理指南。建立田间试验小区时，种植六行玉米，行距为76厘米，最终小区尺寸为15.2米×4.6米。在小区纵向两端各设置1.5米的边行保护区，并在取样区和收获区相邻处额外设置一个1.5米长的边行保护区。将第二行和第三行指定为生长季期间植株和土壤取样区，第四行和第五行为玉米籽粒产量的收获区。建立一个以宽度方向为中心、面积为2.4米×3.8米的微型样地，用于收集所有富集氮的植物和土壤样品，在长度和宽度方向上均保留38米的未采样边界，以尽量减少边缘效应。然后使用不同颜色的标志旗标定处理样地和微型样地的四个角。进入微型样地时需穿戴鞋套，并尽量减少在微型样地内的走动，以防止未富集区域受到污染，离开微型样地时应脱下鞋套。施用氮-15标记肥料时，将10原子百分比的氮-15标记尿素与普通尿素混合稀释至5原子百分比的氮-15标记尿素，并将尿素溶解于2升去离子水中，以确保尿素肥料的均匀标记。使用经校准的背负式二氧化碳喷雾器，将氮-15标记尿素溶液均匀喷施于微型小区。施肥后24小时内，通过轻度耕作、手工耙地或喷灌64厘米的水量，将含尿素的肥料混入土壤，以尽量减少挥发损失的风险。在每个采样阶段，从采样区域内采集6株地上部分未富集氮-15的玉米植株混合样品，以及从氮-15富集微区中采集6株地上部分玉米植株混合样品。将VH期和R1期的地上生物量切碎，并将切碎后的生物量放入标记好的袋子中，置于60摄氏度的强制通风烘箱中烘干至恒重。记录生物量的干重，并将100至200克干燥植株材料充分混合后研磨，直至能通过2毫米筛孔。然后充分混合研磨后的材料，并将子样品存入贴有标签的硬币信封中以供进一步处理。对于土壤样品的处理，在施肥后八天内，使用手动取样器从VH和R1区域的未施肥采样区采集四个直径为1.8厘米的土芯，组成混合土壤样品，且采样时间应与植株采样同步；同时使用另一个单独的手动取样器从微区试验 plot 采集15个直径为1.8厘米的土芯，组成混合土壤样品。将每个混合土壤样品在桶中均质化，然后放入预先贴好标签的纸袋中。然后将土壤样品置于35 °C的强制通风烘箱中干燥至恒重，再将每个样品研磨至可通过2毫米筛网。在实验室进行样品处理时，先将研磨后的植物样品于60 °C烘箱中干燥过夜，然后分别将干燥后的植物和土壤样品放入滚磨罐中，在4 ×g条件下滚磨6至24小时，直至样品达到细粉状的一致质地。随后将充分研磨后的材料转移至洁净并贴好标签的20 mL硅烷化小瓶中。为了测定每个样品中的总氮和氮-15浓度，佩戴腈手套后，首先使用实验室擦拭纸和乙醇清洁微量天平、工作台面、药匙和镊子。将清洁后的工具放置在实验台上的擦拭纸上，并用镊子轻轻撑开样品胶囊的开口。将改装后的胶囊置于微量天平称量盘上方一到两毫米处，撕开胶囊，使其内容物落入天平上。使用镊子将胶囊放回洁净的工作台面，用刮勺小心地向胶囊中加入所需质量的精细研磨样品材料。用镊子缓慢地夹紧已装样胶囊顶部的三分之一，然后折叠封口。继续折叠并压紧胶囊，注意不要刺破或撕裂锡箔，直至形成球形。 使用镊子将包裹好的胶囊从一厘米高度多次掉落至干净的深色表面，以检查是否泄漏。若无粉末出现，则按前述方法称量样品，并将胶囊放入96孔板的一个孔中，记录孔位。每次样品封装之间，需用乙醇和实验室擦拭纸清洁所有工具和表面，特别注意刮刀和镊子的边缘。在此代表性分析中，地上玉米生物量样品中来自肥料的氮浓度在生长季早期最高，随后在每个连续取样时期逐渐降低。然而，来自土壤的氮始终是地上生物量氮的主要组成部分，表明土壤氮供应对玉米最佳生长的重要性。在第一年的生理成熟期，地上生物量氮中约有27%来自肥料，籽粒、秸秆和穗轴各组分中也观察到相似的比例。在第二年的生理成熟期，地上生物量中仅回收了第一年施用肥料所含氮素的2%。大约每公顷有1.6千克来自第一年肥料的氮素随籽粒被带走。施肥后八天内，大部分来自肥料的氮素如预期般集中在土壤剖面的前15厘米土层中。然而，每公顷约有22千克的氮素已迁移至更深层土壤中，而4%至10%来自肥料的氮素则无法追溯。事实上，在第一年和第二年结束时，土壤-玉米体系内可追溯的肥料来源氮素不足50%，其余部分要么损失至环境中，要么淋溶至90厘米深的土壤采样层以下。在进行该操作时，应格外小心以避免交叉污染，否则可能导致结果无效。可进一步分析土壤的无机和有机组分，以加深对氮循环动态的理解。通过植物不同部位分析植物样品，可用于阐明氮素吸收和随时间转运的过程。

microplot-design-plant-soil-sample-preparation-for-15nitrogen

Research

科研

JoVE Journal

Environment

环境

微图设计及植物和土壤样品制备，进行15次氮气分析

本方法介绍了如何构建和操作一个连续的13C和15N同位素标记室，用于植物组织的均一或差异标记。文中讨论了对柳枝稷（Andropogon...

用于植物同位素均匀或差异性代谢与结构标记的连续13C和15N标记室的设计与操作

本文详细演示了一种完整的土壤芯渗漏水收集器的提取与组装方法，并展示了其在研究地表施用家禽粪便后淋滤液及伴随养分流失方面的应用。...

一种采集与构建土壤芯式渗漏仪的方案

本研究介绍了一种用于研究土壤渗漏计中地下水分、地球化学及微生物异质性的挖掘方法。该渗漏计模拟了一个最初处于均质条件的人工坡面，在18个月期间经过八次灌溉，累计接受了约5,000...

用于水文、地球化学与微生物学耦合研究的土壤溶滤器采样

先前的研究表明，大气氮氧化物的氮同位素组成可能用于区分环境中不同来源的影响。本文报道了一种自动化、可移动、基于野外的高效率收集大气NOx的方法，可用于每小时时间分辨率下的氮同位素分析。...

用于NOx氮同位素分析的自动化高分辨率移动采集系统

传统的土壤采样方法任意地确定土壤样本数量。本文提出一种简单而高效的聚类土壤采样设计，用于展示土壤空间异质性，并定量确定所需土壤样本数量及相关采样精度。...

在异质性研究样地中进行土壤采样

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本方案介绍了一种利用薄膜扩散梯度（DGT）结合质谱成像技术，对多种不稳定的无机营养元素和污染物溶质进行亚毫米级二维可视化的实验流程。文中详细描述了溶质采样及高分辨率化学分析方法，用于对陆生植物根际溶质进行定量分布图谱绘制。...

土壤中不稳定的无机植物养分与污染物的二维可视化与定量分析

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城市径流研究设施的设计与建造

理解环境异质性在物种共存中的作用通常集中在群落物种组成外部的异质性类型上。我们提供了利用经历植物-土壤反馈调控的土壤来创建土壤异质性处理的新颖且详细的方法，即与群落组成相关的内在异质性。...

操纵植物诱导的土壤异质性实验方案

传统的温度梯度板可在其表面形成一系列温度梯度。在温度梯度板表面垂直焊接加强筋，可控制其深度方向的温度，从而拓展可能的研究应用。...

一种带护板的热梯度培养台，用于调控土壤温度以评估植物生长及监测土壤过程

学习微小区设计方法进行¹⁵N示踪研究，实现玉米生长季多次植物与土壤采样。该技术可量化肥料氮对土壤-作物系统的影响，提升氮肥利用效率与管理指南。

微区设计及用于¹⁵氮分析的植物与土壤样品制备

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