Name: 使用光可转换的登德拉2，在老化的蛋白质周转量中，在体内C.Elegans (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 了解利用光可转换荧光蛋白Dendra2在活体秀丽隐杆线虫中追踪亨廷顿蛋白降解的方法。该技术可定量分析蛋白质周转动态，适用于研究蛋白质稳态网络及神经退行性疾病机制。

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感谢德国研究基金会（DFG，项目编号KI-1988/5-1，授予JK；NeuroCure卓越集群向MLP提供的NeuroCure博士奖学金）提供的经费支持。同时感谢柏林莱布尼茨分子药理学研究所（FMP）成像核心设施提供成像设备。此外，我们还要感谢Diogo Feleciano在实验室建立了Dendra2系统并提供了相关操作指导。

1. 表达神经元亨廷顿蛋白-Dendra2融合蛋白的秀丽隐杆线虫（C. elegans）的构建
<ol>
	<li>通过传统的限制性内切酶消化10、Gibson 组装11或任意选择的方法，将编码目的蛋白（POI）的基因克隆至线虫表达载体（例如 pPD95_75，Addgene #1494）中。插入启动子以驱动目的组织或特定发育阶段的表达。将 Dendra2 荧光蛋白在阅读框内与目的蛋白的N端或C端融合。</li>
	<li>构建表达融合蛋白的转基因 C. elegans（例如通过显微注射）12。 
	注意：携带转基因的质粒将以染色体外阵列形式存在。融合构建体的整合并非必需，但可根据需要进行13。在本实验方案中，通过显微注射将携带融合构建体亨廷顿蛋白外显子1-Dendra2（HTT-D2）的质粒导入 C. elegans，该构建体由泛神经元启动子 Prgef-1 驱动表达。所用 C. elegans 表达骨架来自 Kreis 等人14，含Q25或Q97的亨廷顿蛋白外显子1序列来自 Juenemann 等人15，Dendra2 荧光蛋白序列来自 Hamer 等人16。</li>
</ol>
2. 年龄匹配与维护  秀丽隐杆线虫
<ol>
	<li>通过碱性次氯酸盐溶液处理17 或在 20 °C 下产卵 4 小时的方法同步所有线虫的年龄，以实现年龄匹配。对于产卵操作，将 10 只怀卵成虫置于新接种的大肠杆菌的线虫生长培养基（NGM）平板上，放置 4 小时后移除。在此时间段内产下的卵将发育为同步化的线虫。</li>
	<li>将实验用 C. elegans 培养于接种了大肠杆菌 E. coli OP50 作为食物来源的线虫生长培养基（NGM）平板上，遵循标准的线虫培养方法18。</li>
	<li>在 20 °C 下将线虫培养至所需发育阶段。本实验方案所需的年龄为第 4 天和第 10 天。 
	注意：第 4 天的年轻成虫可通过其生殖腺内存在卵以及高度活跃的运动能力来识别。第 10 天的老龄线虫已过生育期，并出现组织退化和运动能力下降的现象19。</li>
	<li>对于第 10 天的线虫，在第 3 天达到 L4 阶段后，一旦线虫具备生育能力，应每日转移一次，以避免种群混杂。</li>
</ol>
3. 成像用显微镜载玻片的制备
<ol>
	<li>在成像当天制备显微镜载玻片。将普通级琼脂糖以3% (w/v) 的浓度溶于ddH2O中，在微波炉中加热融化，稍作冷却。</li>
	<li>剪去1 mL移液器吸头的尖端，吸取约400 µL融化的琼脂糖。将少量琼脂糖轻轻滴加至洁净的玻璃载玻片上，立即盖上另一张载玻片，确保两张玻片之间形成一层薄薄的琼脂糖垫。待其干燥后，轻轻滑动或抬起上层载玻片。</li>
	<li>将带有琼脂糖垫的载玻片置于加湿容器中，防止干燥。这些载玻片可在2–3小时内使用。 
	注意：避免在琼脂糖中产生小气泡，因为线虫可能被困在其中。</li>
</ol>
4. 共聚焦显微镜参数的定义
注意：在固定线虫并进行数据采集之前，需在共聚焦采集软件中定义所有设置。这些设置可根据所选的成像硬件和软件进行调整。
<ol>
	<li>打开共聚焦显微镜软件并定义激光成像设置。将绿色Dendra2的激发/发射光路设置为486-553 nm，红色Dendra2的光路设置为580-740 nm。根据荧光染料的强度调节两个通道/激光器的功率和增益。不要更改数字增益或偏移，并将针孔设为完全打开。</li>
	<li>定义采集设置：选择逐通道顺序扫描模式，并在每帧之间切换通道。将扫描模式设为帧扫描，帧尺寸设为1,024 × 1,024，线步进为1。设置平均次数为2，采用均值法进行平均，扫描模式为单向扫描线。将位深度设为8位。</li>
	<li>定义Dendra2转化的多维采集参数。使用405 nm半导体激光器进行转化和漂白，能量功率设为60%。如有条件，启用安全漂白GaAsP模式以保护检测器。</li>
	<li>选择两个周期的时间序列，周期间间隔为0.0 ms，正常开始和结束。在第二次扫描的第一轮后开始漂白，并重复30次。当荧光强度下降至50%时停止漂白。</li>
	<li>将转化过程的采集速度/像素驻留时间设为快速（例如，最大值=12），而拍摄快照图像时设为中速（例如，中等值=5）。 
	注意：此处定义的漂白参数仅为指导性建议。对于其他标记Dendra2的目标蛋白（POI），激光功率、漂白迭代次数及相关参数需通过实验确定。</li>
</ol>
5. 将秀丽隐杆线虫（C. elegans）装载到显微镜载玻片上
注意：如果可能，将一台解剖显微镜放置在共聚焦显微镜装置附近，并在成像前立即固定线虫样品。
<ol>
	<li>在琼脂糖垫相对一侧的玻璃盖玻片上，用永久性记号笔绘制一个包含四个方格的窗口，并对它们进行编号。</li>
	<li>用移液器将 15 µL 左旋咪唑滴加到琼脂糖垫中央。左旋咪唑的浓度需根据线虫的年龄调整：成像第 4 天的线虫使用 2 mM 左旋咪唑；成像第 10 天的线虫使用 0.5 mM 左旋咪唑。</li>
	<li>用金属挑针将四条线虫转移至液体中。借助睫毛挑针，将每条线虫轻轻移至窗口中的一个方格内。旋转睫毛挑针，使残留的 E. coli OP50 被稀释，其荧光背景不会干扰信号采集。</li>
	<li>等待线虫几乎停止运动后，轻轻将盖玻片覆盖在液体上，使线虫被固定在琼脂糖垫与盖玻片之间的左旋咪唑液层中。</li>
	<li>将倒置的载玻片置于共聚焦显微镜载物台上，对线虫进行成像。</li>
</ol>
6. 绿色Dendra2的转化：零时数据采集
注意：脉冲-追踪实验首先通过不可逆地将 Dendra2 融合蛋白从绿色荧光蛋白转化为红色荧光蛋白来启动。
<ol>
	<li>使用显微镜目镜，在20倍物镜下通过绿色荧光定位第一条线虫。聚焦于头部或尾部，然后切换至共聚焦模式。</li>
	<li>启动488 nm蓝色激光的实时扫描，以在EGFP绿色通道（激发/发射波长 = 486–553 nm）中观察绿色Dendra2。选择单个神经元并将其调至清晰对焦状态。放大3倍，并提高激光束的目标强度4。 
	注意：每条线虫仅选择一个神经元。每个神经元将作为一个独立样本或数据点。</li>
	<li>找到最大投影平面，并根据荧光染料的亮度调整增益或激光功率，以获得饱和但不过曝的图像（可通过颜色范围指示器判断）。确定参数后，停止扫描。 
	注意：避免对样品进行过长时间或过高功率的照射，因为可见蓝光（488 nm）激发虽效率较低且速度较慢，但仍可能引起Dendra2的转化4。</li>
	<li>在软件中打开感兴趣区域（ROIs）选择选项卡，围绕所选神经元绘制第一个感兴趣区域。再定义一个更大的第二感兴趣区域，覆盖线虫头部并包含第一个ROI。</li>
	<li>在漂白设置中，设定第一个ROI需进行采集、漂白和分析；第二个ROI仅进行采集和分析，不进行漂白。</li>
	<li>将扫描速度设为最大（即快速像素驻留时间），开始实验以转化所选的Dendra2神经元。 
	注意：实验完成后，所获取的图像将包含两张图片：转化前和转化后。在绿色通道中，第一张图像应具有较强的绿色信号，第二张图像中该信号因Dendra2的转化而减弱；在红色通道中，第一张图像应为阴性，无信号，第二张图像中则出现红色信号。若绿色信号未减弱，则表明转化未发生，应调整参数（如405 nm激光功率或迭代次数）。若第一张图像中已存在红色信号，则说明使用的488 nm激光功率过高，部分绿色Dendra2已被提前转化为红色。此时应重新选择新的神经元或线虫。</li>
	<li>转化完成后立即使用绿色561 nm激光进行实时扫描，以在红色通道（激发/发射波长 = 580–740 nm）中观察Dendra2。利用颜色范围指示器找到转化后神经元的焦点及其对应的最大投影，避免过曝。</li>
	<li>迅速将扫描速率调至较低的像素驻留速度（例如5倍），以更高分辨率采集两个通道的静态图像。此图像定义为转化后的零时间点（T0）。 
	注意：转化后图像的采集速度可调整，但一经选定，整个数据采集过程中必须保持一致。</li>
	<li>将扫描图像以可识别的名称和/或编号保存，并附加“零时间点”标签（T0）。 
	注意：建议同时保存转化实验的图像（步骤6.6），以展示转化前无红色信号、转化后出现红色信号的结果。</li>
</ol>
7. 在选定的第二个时间点对转化后的红色 Dendra2 进行成像以获取数据
<ol>
	<li>为了追踪 Dendra2 随时间的降解情况，需设定第二个时间点，对同一条线虫/神经元进行重新成像。根据实验设计选择第二个时间点，以回答特定的生物学问题。在本方案中，Dendra2 分别在光转化后 2 小时（T2）和 24 小时（T24）进行成像。
	<ol>
		<li>在选定的时间点，利用目镜和红色荧光找到同一条线虫/神经元。</li>
		<li>打开该线虫/神经元的 T0 时相图像，并重新加载或复用图像采集参数。确保在获取 T0、T2 和 T24 小时图像时，快照的采集参数完全一致。</li>
		<li>在红色通道中实时扫描，将已转化的红色神经元调至焦点。由于红色 Dendra2 随时间逐渐降解，最大投影的强度指示将显示较弱的信号。请勿更改任何采集参数，并以与首次成像相同的速度（例如 5×）获取快照图像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>若需追踪光转化后 4 小时或更长时间的 Dendra2 降解情况，则在光转化后将线虫回收。
	<ol>
		<li>在完成四条线虫的光转化和成像后，立即将载玻片从显微镜上取下。轻轻移除盖玻片，使用金属挑针将每条线虫从琼脂糖垫上逐一挑起。</li>
		<li>将每条线虫单独转移至标记清晰且可识别的 NGM 平板上。</li>
		<li>在第二个时间点，将线虫再次置于新的琼脂糖垫上，并按照第 6 节的说明对已转化的红色 Dendra2 进行成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. 转化后的 Dendra2 图像分析
注意：Dendra2 的降解分析使用 Fiji/ImageJ 软件进行20。
<ol>
	<li>打开 Fiji，将 .lsm 文件拖放到 Fiji 工具栏中。打开转化后立即采集的 T0 图像，以及同一条线虫在选定时间点（T2 或 T24 小时）采集的图像。 
	注意：若要追踪与 Dendra2 融合的目标蛋白的降解情况，仅需分析红色通道图像。</li>
	<li>从菜单中设置测量参数：分析 | 设置测量值。选择 面积 和 积分密度 功能。</li>
	<li>选择红色通道获取的图像。从 Fiji 工具栏中选择 多边形选区工具。</li>
	<li>在 T0 图像上识别已转化的神经元，并使用选区工具在其周围绘制一个感兴趣区域（ROI）。
	<ol>
		<li>为准确识别神经元的轮廓，可通过菜单 图像 | 调整 | 阈值 高亮显示强度阈值。拖动滑块光标以划定阈值范围，并使用多边形工具沿此区域进行勾画。为生成精确的 ROI，也可参考绿色通道中同一神经元的轮廓。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在红色通道窗口完成选区后，点击 分析 | 测量。将弹出名为 结果 的窗口，其中包含该 ROI 的 面积、IntDen 和 RawIntDen 数值。</li>
	<li>对第二个时间点（T2 或 T24 小时）的图像重复相同的选区与测量过程。</li>
	<li>将获得的数值复制到电子表格软件中，注意准确记录转化后 T0 时刻以及 T2 或 T24 小时的测量值。</li>
</ol>
9. 计算 Dendra2 降解比率
<ol>
	<li>为计算降解比率，首先将时间零点（即转化后立即测定，此时所有红色 Dendra2 转化产物仍完整存在）的降解值设为 1（或 100%）。该数值由 T0 的 IntRawDen 值除以其自身得到。</li>
	<li>为计算红色 Dendra2 荧光信号随时间的减弱程度及降解情况，将第二个时间点（例如 T2 或 T24 h）的 RawIntDen 值除以 T0 的 RawIntDen 值。所得数值应小于 1。这些数值也可表示为百分比形式，将 T0 定义为 100%。</li>
	<li>对每条完成转化的线虫重复第 7 节操作。为直观展示 Dendra2 的降解情况，可绘制散点图或柱状图，以荧光强度降低的百分比或比值作为纵坐标。根据需要进行统计学分析，并在图中加以呈现。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

要理解蛋白质的功能，必须了解其合成、定位和降解过程。随着新型、稳定且高亮度的荧光蛋白（FPs）的发展，对目标蛋白（POIs）的可视化和监测已变得更加简便和高效。基因编码表达的光转化荧光蛋白（PAFPs）如Dendra2，特别适用于研究目标蛋白的稳定性。当暴露于紫蓝色光时，Dendra2会在一段保守的三联氨基酸序列内的特定位置发生断裂，其发色团随之发生微小的结构变化，导致荧光光谱从绿色完全转变为红色23。这一光谱转变使得与Dendra2融合的任何目标蛋白均可被检测和追踪。事实上，这类融合构建体最初被用于构建秀丽隐杆线虫（C. elegans）报告品系，以在活体中研究泛素-蛋白酶体系统16。Dendra2还被用于探究特定神经元亚型的易损性及其应对扩展型多聚谷氨酰胺蛋白的能力24，或在运动神经元疾病模型中监测自噬的诱导过程25。
本文介绍了一种非侵入性监测亨廷顿蛋白（hunting...

生物体的蛋白质组处于持续自我更新的状态。蛋白质会根据细胞的生理需求不断被降解和合成。某些蛋白质会被迅速清除，而另一些则具有较长的寿命。利用基因编码的荧光蛋白（FPs）来监测蛋白质动态是一种更简单、更准确且侵入性更小的方法。荧光蛋白可自发催化形成，并能与任何目标蛋白（POI）融合，其折叠过程无需酶参与，仅需氧气作为辅因子1。最近，新一代荧光蛋白被设计为在特定波长的光脉冲照射下发生颜色转换。这类光激活荧光蛋白（PAFPs）可用于标记并追踪目标蛋白，或其所在的细胞器或细胞，进而分析其定量和/或定性参数2。利用荧光蛋白，可以追踪任意目标蛋白的运动、方向性、移动速率、扩散系数、可移动与不可移动组分的比例、在某一细胞区室中的停留时间，以及其周转速率。对于特定细胞器，可确定其运动与运输过程，或分裂与融合事件。对于特定类型的细胞，可确定其位置、分裂速率、体积和形态。关键的是，使用光激活荧光蛋白可在无需持续成像的情况下进行追踪，且不会受到新合成探针的干扰。已有研究在细胞和完整生物体中成功应用光激活荧光蛋白，在活体条件下解答了多种生物学问题，例如癌症的发生与转移、细胞骨架的组装与解聚，以及RNA-DNA/蛋白质相互作用3。在本研究中，采用光学显微镜结合光激活荧光蛋白，旨在揭示在神经退行性疾病线虫模型 C. elegans 中，易聚集蛋白亨廷顿蛋白（HTT）在体内的周转速率。
本文所述方案用于定量分析融合蛋白亨廷顿蛋白-Dendra2（HTT-D2）的稳定性和降解情况。Dendra2是一种第二代单体式光转化荧光蛋白（PAFP）4 在紫外光或可见蓝光照射下，其发射/激发光谱会不可逆地从绿色转变为红色，同时荧光强度最高可增强至原来的4,000倍5,6亨廷顿蛋白是导致亨廷顿病（HD）的致病蛋白，该病是一种致命的遗传性神经退行性疾病。亨廷顿蛋白的第1个外显子包含一段谷氨酰胺重复序列（CAG，Q）。当该蛋白表达的谷氨酰胺重复数超过39个（>39Q）时，蛋白会发生错误折叠，形成突变型、有毒且具有致病性的蛋白。突变型HTT易于聚集，可导致神经元细胞死亡和退化，其形式可以是&#160;短寡聚体物种或更大且高度结构化的淀粉样蛋白7.
线虫因其易于操作、遗传背景均一、寿命短以及光学透明等特性，成为研究衰老和神经退行性疾病的理想模型系统8。为了研究HTT在体内的稳定性，研究人员在秀丽隐杆线虫（C. elegans）的神经系统中表达了一种融合构建体。该构建体包含一个HTT-D2转基因，其携带25个谷氨酰胺重复序列（HTTQ25-D2，生理性长度）或97个谷氨酰胺重复序列（HTTQ97-D2，病理性长度），并在整个线虫生命周期中于所有神经元中泛神经元过表达9。通过对活体C. elegans施加短暂且聚焦的光照，可实现单个神经元中HTT-D2蛋白的光转换，并随时间追踪其转化后的信号。为确定HTT-D2的降解量，将新转换的HTT-D2产生的红色信号与经过特定时间后残留的红色信号进行比较。因此，该方法使得研究人员能够探究：与生理性形式相比，突变扩展且具有毒性的亨廷顿蛋白（huntingtin）如何被降解；前部或后部神经元对Q97与Q25的存在是否表现出不同的响应，尤其是在长时间观察下；以及在衰老过程中蛋白质稳态网络（PN）的崩溃如何影响降解速率的差异。这些结果仅描述了HTT-D2周转过程中的一小部分观察现象，但通过这一活体实验技术，还可进一步解答大量与蛋白质聚集和蛋白质稳态领域相关的生物学问题。

<table><tbody><tr><td>琼脂-琼脂 Kobe I</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>5210.2</td><td>NGM 组分</td></tr><tr><td>琼脂糖，通用级</td><td>生物 &amp;amp; Sell GmbH</td><td>BS20.46.500</td><td>安装载玻片组件</td></tr><tr><td>BD Bacto 蛋白胨</td><td>BD生物科学</td><td>211677</td><td>NGM 组分</td></tr><tr><td>Deckgl&amp;auml;ser-18x18mm</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0657.2</td><td>盖玻片</td></tr><tr><td>EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>目标</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ 1.52p</td><td>美国国立卫生研究院</td><td></td><td>分析软件</td></tr><tr><td>盐酸左旋咪唑</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4341</td><td>麻醉剂</td></tr><tr><td>LSM710-ConfoCor3</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>激光扫描共聚焦显微镜</td></tr><tr><td>体视显微镜安装</td><td>徕卡相机股份公司</td><td></td><td>显微镜安装</td></tr><tr><td>神经元-HTTQ25-Dendra2</td><td>本文</td><td></td><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>神经元-HTTQ97-Dendra2</td><td>本文</td><td></td><td>&lt;em&gt;秀丽隐杆线虫&lt;/em&gt; 菌株</td></tr><tr><td>OP50 大肠杆菌</td><td>秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）</td><td>OP50</td><td>线虫食物来源</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3957.2</td><td>NGM 组分</td></tr><tr><td>标准物镜&amp;auml;ger</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>0656.1</td><td>载玻片</td></tr><tr><td>ZEN2010 B SP1</td><td>卡尔·蔡司股份公司</td><td></td><td>共聚焦采集软件</td></tr></tbody></table>

利用光转化蛋白 dendra2 在活体中定量分析衰老期间 c. elegans 的蛋白质周转

In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2

蛋白质在细胞内不断合成与降解，以维持稳态。能够监测目标蛋白质的降解过程，对于理解其生命周期以及揭示蛋白质稳态网络中的失衡至关重要。本方法展示了如何追踪致病蛋白亨廷顿蛋白（huntingtin）的降解。将两种不同形式的亨廷顿蛋白与Dendra2融合后在细胞中表达 秀丽隐杆线虫 神经系统：一种为生理状态版本，另一种为含有扩展且具有病理性的谷氨酰胺重复序列的版本。Dendra2 是一种可光转换的荧光蛋白；在短暂的紫外光（UV）脉冲照射后，Dendra2 的激发/发射光谱会从绿色转变为红色。类似于脉冲-追踪实验，可以对转换后的红色 Dendra2 的降解进行监测和定量，且不受新合成的绿色 Dendra2 的干扰。利用共聚焦显微镜并基于样本的光学透明性 秀丽隐杆线虫可以监测并量化活体衰老生物体内亨廷顿蛋白-Dendra2的降解过程。神经元中的亨廷顿蛋白-Dendra2在转化后不久即发生部分降解，并随时间推移进一步被清除。在突变型亨廷顿蛋白存在的情况下，调控降解的系统功能缺陷，且随着衰老进一步恶化。同一神经系统内的不同神经元亚型对亨廷顿蛋白-Dendra2的 turnover 能力存在差异。总体而言，监测任何与 Dendra2 融合的目标蛋白，不仅可提供有关其降解过程及参与蛋白质稳态网络的因子的重要信息，还可揭示其定位、转运与运输情况。

通过显微注射获得了两种在线虫中表达亨廷顿蛋白外显子1片段与光转换蛋白 Dendra2 融合的线虫品系，质粒以染色体外阵列形式保留。该融合构建体在整个 C. elegans 神经系统中表达，从发育阶段持续至衰老过程。其中，HTT-D2 包含生理性的 25 个聚谷氨酰胺重复序列（HTTQ25-D2，图 1A），或包含完全外显且具有致病性的 97 个谷氨酰胺重复序列（HTTQ97-D2，图 1B）。最初对融合蛋白进行测试，以确认其在紫外光照射后能否从绿色荧光谱成功转换为红色荧光谱。HTT-D2 在光照区域实现了从绿色到红色的特异性转换，且仅限于被照射区域。根据紫外脉冲的功率和重复次数，以及激光束穿过线虫角质层时在不同 z 层面的穿透能力，仅有部分 HTT-D2 被转换，而非全部。在光转换的神经元中出现红色信号，并与未转换的绿色 HTT-D2 信号共定位（<strong cla...

本文介绍了一种监测与光转换荧光蛋白Dendra2融合的亨廷顿蛋白降解的实验方案。

利用光转化蛋白 Dendra2 在活体中定量分析衰老期间 C. Elegans 的蛋白质周转

蛋白质在细胞内持续合成与降解，以维持稳态。能够监测目的蛋白的降解过程对于……

该方案可用于在活体且衰老的秀丽隐杆线虫（C. elegans）中追踪并定量目标蛋白的降解过程。这种体内、非侵入性技术仅需简单的显微镜装置，即可可靠地将 Dendra2 转变为明亮且稳定的荧光蛋白。该方法可适用于哺乳动物系统以及斑马鱼。为了研究蛋白质稳态网络中的周转以及运输和转运过程，需注意在使用蓝光激光扫描时避免意外激活 Dendra2，并针对每个系统和融合蛋白测试及优化成像参数和光转化条件。首先，在 20 摄氏度下培养年龄一致的线虫，使其生长至实验所需的龄期。成像实验当天，将普通级琼脂糖以3%的浓度溶于双蒸水中并融化。琼脂糖冷却期间，剪去1毫升移液枪头的尖端，以便吸取约400微升融化的琼脂糖。将少量琼脂糖滴加到洁净的玻璃载片上，立即在液滴上方覆盖另一张载片，使两张玻璃片之间形成一层薄薄的琼脂糖垫。琼脂糖干燥后，小心移除顶部载玻片。准备好足够数量的载玻片后，打开共聚焦显微镜软件并设置激发和发射光路。对于绿色 Dendra2，设置激发波长为 486 至 553 纳米，对于红色 Dendra2，设置激发波长为 580 至 740 纳米。根据荧光染料的强度调整两个通道的激光功率和增益，并将针孔设为完全打开。选择顺序通道模式，并设置每帧切换一次轨道。将扫描模式设为帧扫描，帧尺寸设为1024×1024，线步进为1。将平均次数设置为2，采用均值法对单向扫描线模式进行平均。将位深度设置为8位。定义Dendra2转换的多维采集参数。进行转化和漂白时，使用设定为60%能量功率的405纳米二极管激光器。选择包含两个循环的时间序列，循环间间隔为0.0毫秒，起始和终止方式设为正常。设置漂白在第二次扫描开始后启动，重复30次迭代，并在荧光强度降至50%时停止。然后，将采集时的像素驻留速度设为“快速”以进行转化，设为“中速”以捕获快照图像。为了将线虫固定在载玻片上，使用永久性记号笔在每张载玻片的琼脂糖垫相对面绘制一个包含四个方格的窗口，并进行编号。在琼脂糖垫中央加入15 µL 左旋咪唑，然后在体视显微镜下用金属丝挑取器将年龄匹配的线虫转移至液滴中。使用睫毛挑取器轻轻地将每条线虫移入方格中的一个窗口内。当所有线虫被重新定位后，需等待线虫完全停止移动，再将盖玻片盖在液滴上，以在成像过程中固定线虫。随后，将载玻片置于共聚焦显微镜载物台上。进行绿色Dendra2转化时，使用20倍物镜的目镜，在绿色荧光下找到第一条线虫，并聚焦于其头部或尾部。切换至共聚焦模式，并调节增益和激光功率，以获得饱和但不过曝的图像。在选定的神经元周围绘制一个兴趣区域，并在尾部周围绘制第二个更大的兴趣区域，使其包含第一个兴趣区域。设置第一个区域用于采集、漂白和分析。设置第二个待采集和分析的感兴趣区域，但不进行漂白。将扫描速度设为最大，开始扫描以转化所选的 Dendra2 神经元。转化后立即使用绿色 561 纳米激光进行活体扫描，以在红色通道中观察 Dendra2，并找到已转化神经元的焦点及相应的最大投影。迅速将扫描速率设置为较低的像素驻留速度，并以更高分辨率采集两个通道的快照图像。该图像被视为转换后的时间零点图像。然后，使用可识别的名称或编号保存扫描，并加上“时间零点”标签。为了追踪 Dendra2 随时间的降解情况，打开相应线虫神经元的时间零点图像。使用相同的图像设置，在红色通道中开始实时扫描，并将已光转化的红色神经元调至清晰对焦。随后，在不改变任何采集参数的情况下，以与第一幅图像相同的速度获取一幅快照。务必仔细设定转化条件，以高效且充分地转化 Dendra2，并在不同时间点保持相同的采集参数。为分析已转化的 Dendra2 图像，需在 Fiji 中打开时间零点和后续时间点的图像，随后打开“分析”菜单并选择“设置测量”。勾选“面积”和“积分密度”选项，并选择使用红色通道获取的图像。使用多边形选择工具，在时间零点转化的神经元周围绘制一个感兴趣区域。为了准确识别神经元的轮廓，选择“图像”、“调整”、“阈值”以突出显示强度阈值。定义选区后，点击“分析”和“测量”。将弹出一个结果窗口，其中包含所选感兴趣区域的面积、积分密度和原始积分密度值。对第二个时间点的图像执行相同的选区与测量过程，然后将数值复制到电子表格中。在此代表性分析中，转换前当样本在红色通道激发时，未观察到红色信号。经照射后，随着HTT-D2的转化，绿色信号逐渐减弱，随后出现红色信号。HTT-D2的表达随时间推移而降解，导致红色HTT-D2信号水平下降，同时随着更多融合蛋白的重新合成，绿色HTT-D2信号可能有所增加。值得注意的是，尾部区域的神经元活性显著高于头部神经元。此外，在转化后24小时，对照组HTTQ25-D2在头部和尾部神经元中的降解程度均显著高于转化后2小时。然而，在致病型HTTQ97-D2中未观察到这种差异，表明蛋白质稳态网络无法清除在整个神经系统中含较长谷氨酰胺序列的HTT-D2。在非常年老的线虫中，HTTQ97-D2 的降解效率低于 HTTQ25-D2，表明蛋白质稳态网络在老年动物中无法有效清除亨廷顿蛋白的聚集性且可能具有毒性的形式。重要的是，在年轻的线虫中，尾部神经元能够应对有毒的 HTTQ97-D2，提示可能存在多种协同的蛋白质稳态网络机制共同作用以清除 HTT-D2。对于每个样本，应在转化后立即获取未过曝且未饱和的图像，并在后续时间点对同一样本始终重复使用相同的成像设置。通过本方案，可以检测蛋白质稳态网络的变化，并借助超分辨率显微镜追踪与疾病相关蛋白的扩散过程。

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用光可转换的登德拉2，在老化的蛋白质周转量中，在体内C.Elegans

骨骼肌对于运动至关重要，也是机体主要的蛋白质储存组织。本文描述了秀丽隐杆线虫（C.

评估 C. elegans 肌肉中亚细胞区室的方法

细胞和组织中的蛋白质水平通常由蛋白质的生成与清除之间的平衡进行严格调控。利用光转化后荧光衰减（Fluorescence Decay After Photoconversion, FDAP）技术，可对蛋白质的清除动力学进行实验测定 体内.

利用光转化后荧光衰减法（FDAP）测量活体斑马鱼胚胎中的蛋白质稳定性

本文介绍了一个将大范围饮食限制与基因表达及寿命关联起来的研究框架。我们描述了实施大范围饮食限制的实验方案，以及在此条件下对基因表达进行定量成像的技术流程。此外，我们还概述了用于揭示参与食物感知的遗传回路中潜在信息处理特征的计算分析方法。...

在 C. elegans 中通过基因表达水平编码的信息量化：广泛范围饮食限制下寿命调控过程中的研究

本文所介绍方法的目的是研究模式生物 C. elegans...

研究固有蛋白质聚集随年龄变化的方法 秀丽隐杆线虫

荧光寿命成像可监测、量化并区分活体、衰老及应激状态下的秀丽隐杆线虫（C.

使用荧光寿命成像对衰老期间 C. Elegans 中的淀粉样蛋白结构进行表征

蛋白质稳态的衰退是衰老的一个标志，会促进神经退行性疾病的发生。我们提出了一种实验方案，通过异源表达与荧光报告蛋白融合的多聚谷氨酰胺重复序列，定量测量两种不同组织中秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

量化组织特异性蛋白质稳态衰退在 Caenorhabditis elegans 中的变化

本文介绍并描述了一种非放射性、非侵入性的方法，用于在体内评估新生蛋白质的合成，该方法利用线虫Caenorhabditis...

Caenorhabditis elegans 中新生蛋白质合成速率的评估

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通过实验教学可以使生物学课程对学生更具吸引力。本文介绍了两种不同但互补的实验方案，可在课堂教学中用于鼓励学生提出并验证与高热量饮食、饥饿和衰老相关的假设。...

使用低成本染料可视化糖原积累和肠道完整性 秀丽隐杆线虫

本方案提供了一种标准化的方法，用于在秀丽隐杆线虫（C.

在衰老过程中对C. elegans线粒体形态进行成像与定量分析

了解利用光可转换荧光蛋白Dendra2在活体秀丽隐杆线虫中追踪亨廷顿蛋白降解的方法。该技术可定量分析蛋白质周转动态，适用于研究蛋白质稳态网络及神经退行性疾病机制。

利用光转化蛋白 Dendra2 在活体中定量分析衰老期间 C. Elegans 的蛋白质周转

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