Name: 纳米材料和其他难物质藻类毒性试验的小型装置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 了解LEVITATT平台用于藻类毒性测试的方法，该平台采用LED照明技术解决传统方法中的热量和光照均匀性问题，特别适用于纳米材料和有色物质等难测物质的生态毒性评估。

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本研究由 PATROLS——纳米安全性测试先进工具项目资助，资助协议号为 760813，隶属于“地平线 2020”研究与创新计划。

1. LEVITATT 装置的描述
<ol>
	<li>使用20 mL的闪烁玻璃瓶（图1，插图1），确保光线能够穿透。也可使用可透光的塑料瓶。使用光度计量化光照强度。</li>
	<li>测试开始时至少使用4 mL的测试悬浮液，以便在孵育期间及结束后对生物量以及纳米材料进行定量和表征/定量（图1，插图2）。</li>
	<li>为20 mL闪烁瓶配备瓶盖（图1，插图3），并在盖上钻一个直径约1 mm的小孔，以允许与大气进行CO2交换。此交换对于在测试期间维持稳定的pH值和CO2水平至关重要。</li>
	<li>对于挥发性物质，使用带聚四氟乙烯（Teflon）涂层的密封瓶盖，可通过注射器向顶空充入CO29；或使用完全封闭、无气相的烧瓶，通过富含碳酸氢钠（NaHCO3）的缓冲体系将CO2维持在溶液中10。</li>
	<li>使用安装在外壳上的夹具固定瓶体（图1，插图4）。</li>
	<li>在测试瓶下方设置LED光源（图1，插图5），提供均匀的“冷白光”或“日光”型荧光照明，光强范围为60–120 µE∙m-2∙s-1，测量波长范围为光合作用有效波段400 nm至700 nm。该装置通过在光源上安装调光器，可调节光强范围为5–160 µE∙m-2∙s-1，从而支持在更高或更低光照强度下进行测试。</li>
	<li>将装置置于轨道摇床上，在整个测试过程中持续振荡样品，以保持细胞处于自由悬浮状态，并促进CO2从空气向水中的传质（图1，插图6）。</li>
	<li>将装置置于温度可控的房间或恒温柜中，以在整个测试期间维持稳定的温度（图1，插图7）。</li>
</ol>
<img alt="反应室、LED 光源和温度控制组成的光合作用实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于藻类毒性测试的 LED 垂直照射台（LEVITATT）示意图。1) 用于培养的 20 mL 玻璃闪烁瓶，2) 用于分析的 4 mL 样品，3) 带有钻孔以实现 CO2 交换的瓶盖，4) 用于提供特定光照条件的外壳，5) 位于外壳中央的 LED 光源，6) 实验过程中用于振荡的轨道摇床，以及 7) 恒温柜。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
2. 藻类培养基的制备
<ol>
	<li>ISO 8692 藻类生长培养基由四种不同的储备液组成。根据表1称取适量盐类，并用超纯水稀释。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>储备液</td>
			<td>营养物质</td>
			<td>储备液中的浓度</td>
			<td>测试溶液中的浓度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">1：宏量营养素</td>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>1.5 g/L</td>
			<td>15 mg/L（N：3.9 mg/L）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2·6H2O</td>
			<td>1.2 g/L</td>
			<td>12 mg/L（Mg：2.9 mg/L）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2∙2H2O</td>
			<td>1.8 g/L</td>
			<td>18 mg/L（Ca：4.9 mg/L）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO₄4∙7H2O</td>
			<td>1.5 g/L</td>
			<td>15 mg/L（S：1.95 mg/L）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>0.16 g/L</td>
			<td>1.6 mg/L（P：0.36 mg/L）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">2: Fe-EDTA</td>
			<td>FeCl3·6H2O</td>
			<td>64 mg/L</td>
			<td>64 µg/L (Fe: 13 µg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2EDTA∙2H2O</td>
			<td>100 mg/L</td>
			<td>100 µg/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">3：微量元素</td>
			<td>H3BO3a</td>
			<td>185 mg/L</td>
			<td>185 µg/L （B： 32 µg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2∙4H2O</td>
			<td>415 mg/L</td>
			<td>415 µg/L （Mn： 115 µg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>3 mg/L</td>
			<td>3 µg/L (Zn: 1.4 µg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoCl2·6H2O</td>
			<td>1.5 mg/L</td>
			<td>1.5 µg/L （Co: 0.37 µg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuCl2∙2H2O</td>
			<td>0.01 mg/L</td>
			<td>0.01 µg/L (Cu: 3.7 ng/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2MoO4∙2H2O</td>
			<td>7 mg/L</td>
			<td>7 µg/L （Mo： 2.8 µg/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4: NaHCO₃</td>
			<td>NaHCO₃3</td>
			<td>50 g/L</td>
			<td>50 mg/L（C：7.14 mg/L）</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：藻类生长培养基中储备液的营养成分浓度
注意：H3BO3 可通过添加 0.1 M NaOH 溶解。检测金属时应去除 EDTA，以避免与金属离子形成络合物。通过膜过滤（平均孔径 0.2 µm）或高压灭菌（120 °C，15 分钟）对储备液进行灭菌。储备液 2 和 4 不可高压灭菌，需通过膜过滤灭菌。将溶液避光保存于 4 °C 环境中。
<ol start="2">
	<li>制备 1 L 藻类培养基时，将 500 mL 灭菌超纯水转移至 1 L 灭菌容量瓶中，加入 10 mL 储备液 1：大量营养元素、1 mL 储备液 2：Fe-EDTA、1 mL 储备液 3：微量元素和 1 mL 储备液 4：NaHCO3。</li>
	<li>用灭菌超纯水定容至 1 L，塞紧瓶塞并充分振荡，使藻类培养基均匀混合。</li>
	<li>使用前将溶液与空气接触过夜，或通入无菌过滤空气 30 分钟进行平衡。平衡后，如有必要，用 1 M HCl 或 1 M NaOH 将 pH 调整至 8.1 ± 0.2。</li>
</ol>
3. 设置藻类测试
注意：藻类测试程序的流程图见图2。
<img alt="微生物生长测定示意图；烧瓶设置、对照组、不同浓度处理；生物量测量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig2v6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：藻类测试设置的流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61209/61209fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol>
	<li>根据步骤2制备的藻类生长培养基，配制供试化合物在最高测试浓度下的储备溶液。配制储备溶液/悬浮液时，应遵循OECD 201（适用于可溶性化合物）或OECD 318（适用于纳米材料）指南。</li>
	<li>测定储备溶液的pH值。若其与藻类生长培养基的pH值偏差超过1个单位，则使用1 M HCl或1 M NaOH将pH调节至8。</li>
	<li>计算在25 mL测试溶液中达到最终细胞浓度为1 × 104 个细胞/mL所需的接种液体积。 
	注意：接种液应来自使用LEVITATT装置培养的、无污染且处于指数生长期的Raphidocelis subcapitata培养物。</li>
	<li>计算向每个25 mL容量瓶中添加的储备溶液量，以获得所需的测试浓度。各浓度之间的倍数不应超过3.2。</li>
	<li>为每个选定的浓度标记一个25 mL容量瓶，并额外标记一个25 mL容量瓶作为对照。</li>
	<li>向各个25 mL容量瓶中加入相应体积的供试化合物储备溶液，以达到目标测试浓度。对照组容量瓶中不得加入储备溶液。</li>
	<li>向每个25 mL容量瓶中加入培养基，使液体体积达到约20 mL。</li>
	<li>向每个25 mL容量瓶中加入步骤3.3中计算出的接种液体积，然后用培养基定容至总体积为25 mL。</li>
	<li>塞紧瓶塞，通过将容量瓶垂直翻转两次的方式充分混匀。</li>
	<li>从每个容量瓶中转移0.4 mL至单独的螺口小瓶中，并加入1.6 mL丙酮（用MgCO3饱和）。每个测试浓度和对照组各取一个样品。盖紧瓶盖，避光室温保存，直至进行荧光测定（第4节）。</li>
	<li>将每种测试溶液各4 mL移入20 mL闪烁瓶中（每个浓度设3个重复，对照组设5个重复）。拧紧闪烁瓶瓶盖。注意，瓶盖必须带有钻孔（直径约1 mm），以允许CO2交换。</li>
	<li>在24 h、48 h和72 h时，分别从每个闪烁瓶中移取0.4 mL至螺口小瓶中，并加入1.6 mL丙酮（用MgCO3饱和）。盖紧瓶盖，避光室温保存，直至进行荧光测定（第4节）。</li>
	<li>在72 h取完最后一个样品后，将同一浓度下的三个重复样品轻轻混合于一个瓶中，并测定pH值。对所有浓度及对照组重复此操作。所测样品的pH值与初始pH值的偏差不得超过1.5个单位。</li>
	<li>根据所在机构的规定和规程，将剩余液体排入废液容器中。</li>
</ol>
4. 分析藻类测试样品
<ol>
	<li>使用荧光分光光度计测量藻类生物量（此处以叶绿素A表示）。叶绿素A的激发波长峰值为420 nm，发射波长峰值为671 nm。</li>
	<li>对每个样品的荧光值重复测量三次，并计算每个样品的平均值。</li>
	<li>使用公式1计算生长速率。所测得的荧光值（相对单位）可直接作为公式1中的生物量参数。 
	公式1：µ = (ln Nt – ln N0) / t 
	其中，µ为生长速率（d-1），N0为初始生物量，Nt为时间t时的生物量，t为试验持续时间（d）。注意，N0和Nt应使用相同的单位表示。</li>
	<li>使用统计软件对生长速率数据拟合非线性回归曲线（例如，对数-逻辑斯蒂函数或威布尔函数），以获得10%、20%和50%抑制率下的有效浓度值。补充信息中提供了在统计软件R中使用DRC包进行拟合的代码示例11。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

浮游植物将太阳能和二氧化碳转化为有机物，因此在水生生态系统中具有关键作用。正因如此，藻类生长抑制试验被列为化学品监管风险评估所需的三项强制性水生毒性试验之一。在这一背景下，能够开展可靠且可重复的藻类毒性试验至关重要。使用锥形瓶进行测试会引入多种变异性与操作不便，如引言部分所述。为解决这一问题，已有研究提出采用微孔板3。尽管微孔板可显著减少测试所需的体积和空间，但文献中已对这类装置是否符合测试指南中的有效性判据提出了质疑6。例如，Birch 等人最近的研究表明，在37 °C条件下，使用细胞培养基（DMEM GluteMAX、Opti-MEM 和 Hams F12 GlutaMAX）时，微孔板中半挥发性化学物质会发生显著损失，并出现向其他孔的交叉污染12。对于挥发性物质的测试，可采用LEVITATT装置实现有效测试：1）使用含CO2富集顶空的密闭小瓶9；2）通过顶空直接投加挥发性化合物13</s...

藻类毒性试验是欧洲及国际法规（如REACH1和美国TSCA）在化学品上市前和上市后注册过程中，用于生成生态毒性数据的三项强制性试验之一。为此，国际组织（如ISO和OECD）已制定了标准化的藻类试验指南。这些测试标准和指南对pH、温度、二氧化碳水平和光照强度等方面规定了理想的试验条件。然而，在实际操作中，维持稳定的试验条件十分困难，导致多种化学物质和纳米材料（常被称为“难测物质”）的试验结果在重现性和可靠性方面存在问题2。目前大多数藻类毒性测试系统采用相对较大的体积（100–250 mL），将样品置于培养箱内的旋转摇床上进行培养。此类系统限制了可实现的测试浓度数量和重复次数，且需要大量藻类培养物和测试物质。此外，这些系统通常缺乏均匀的光照场，而在大体积锥形瓶中获得可靠的光照条件尤为困难：一方面是因为光照强度随传播距离呈指数衰减，另一方面也与锥形瓶的几何形状有关。其他替代方案采用塑料微孔板3，其样品体积较小，无法提供足够的取样量用于pH测定、额外的生物量测量、色素提取或其他需要破坏性取样的分析。在利用现有系统对纳米材料及可形成有色悬浮液的物质进行藻类毒性测试时，一个特别挑战是测试物质对藻细胞可利用光的干扰或遮挡，通常称为“遮光效应”4,5。遮光可能发生在样品瓶内部，由测试物质本身和/或其与藻细胞之间的相互作用引起；也可能发生在样品瓶之间，由样品瓶相对于彼此及光源的位置所导致。
该方法基于Arensberg等人6提出的微型藻类毒性测试装置，可满足OECD 2017和ISO 86928等标准的测试要求。为进一步克服上述局限性，本方法进行了以下优化：1）采用LED光照技术，确保光照条件均匀且产热极低；2）提供足够的样品体积用于化学或生物学分析，同时维持恒定的pH和CO2水平；3）支持使用多种测试容器材料，适用于挥发性物质或具有高吸附潜力的物质的测试。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V179124</td><td></td></tr><tr><td>氯化铵</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254134</td><td></td></tr><tr><td>BlueCap 瓶子（1L）</td><td>Buch &amp;amp; Holm A/S</td><td>&amp;nbsp;9072335</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0394</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208290</td><td></td></tr><tr><td>透明亚克力板（40x40 cm）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化钴(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255599</td><td></td></tr><tr><td>二水合氯化铜(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307483</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠盐二水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&amp;nbsp;E5134</td><td></td></tr><tr><td>荧光分光光度计 F-7000</td><td>Hitachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化铁(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>LED 光源</td><td>Helmholt Elektronik A/S</td><td>H35161</td><td>中性白光，6500K</td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>七水合硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化锰(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221279</td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床</td><td>IKA</td><td>2980200</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Raphidocelis subcapitata</td><td>NORCCA</td><td></td><td>NIVA-CHL1 菌株</td></tr><tr><td>闪烁小瓶（20 mL）</td><td>Fisherscientific</td><td>11526325</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td></td></tr><tr><td>二水合钼酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331058&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>弹簧夹</td><td>Frederiksen Scientific A/S</td><td>472002</td><td></td></tr><tr><td>恒温箱</td><td>VWR</td><td>WTWA208450</td><td>替代方案：温控室</td></tr><tr><td>通风管（&amp;Oslash;125 mm）</td><td>Silvan</td><td>22605630165</td><td></td></tr><tr><td>容量瓶（25 mL）</td><td>DWK Life Sciences</td><td>246781455</td><td></td></tr><tr><td>氯化锌</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于纳米材料及其他难处理物质藻类毒性测试的小规模装置

A Small-Scale Setup for Algal Toxicity Testing of Nanomaterials and Other Difficult Substances

根据欧洲及国际法规（例如REACH法规），生态毒性数据是化学品上市前和上市后注册的必要要求。藻类毒性试验常用于化学品的监管风险评估。为了实现高可靠性和可重复性，制定标准化指南至关重要。对于藻类毒性测试，指南要求pH、温度、二氧化碳水平和光照强度等参数保持稳定且均匀。纳米材料及其他所谓的难测试物质可能干扰光照，导致结果出现较大变异，从而阻碍其在监管中的接受度。为应对这些挑战，我们开发了LEVITATT（用于藻类毒性测试的LED垂直照射台）。该装置采用底部LED照明，可实现均匀的光照分布和温度控制，同时最大限度减少样品内部的遮蔽效应。该设计优化了用于生物量定量的样品体积，同时确保有足够的CO2输入以支持藻类的指数生长。此外，测试容器的材料可根据需要定制，以最小化吸附和挥发作用。在测试有色物质或颗粒悬浮液时，使用LED光源还可在不产生额外热量的情况下提高光照强度。其紧凑的设计和最低限度的设备需求，增加了LEVITATT在各类实验室中推广应用的可能性。在符合标准化的ISO和OECD藻类毒性测试指南的同时，LEVITATT在两种标准物质（3,5-二氯苯酚和K2Cr2O7）以及三种纳米材料（ZnO、CeO2和BaSO4）的测试中，相较于锥形瓶和微孔板，表现出更低的样品间变异性。

首先使用参考物质进行初步测试，以确定藻株的敏感性。R. subcapitata 常用的参考物质包括重铬酸钾和3,5-二氯苯酚7,8。图3 和 表2 展示了应用R语言中的DRC软件包对生长速率数据进行分析时，藻类毒性试验的典型结果，包括曲线拟合和统计输出结果。
<img alt="剂量-反应曲线；生长速率与浓度关系；统计分析；置信区间图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61209/61209fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：化学物质对藻类（R. subcapitata）暴露72小时的典型浓度-反应曲线。</str...

我们采用垂直LED光照装置，演示针对难测试物质（如着色物质或纳米材料）的藻类毒性测试。

生态毒性数据是欧洲及国际法规（如REACH）对化学品在上市前和上市后注册所要求的内容。藻类……

当化工企业希望将一种新化学品或其他材料投放市场时，需要提供一系列生态毒性测试的数据。藻类测试是必须进行的三项强制性测试之一。然而，藻类测试存在操作难度较大的问题。基于此原因，我们开发了 LEVITATT 检测平台。LEVITATT 采用 LED 光源，以避免因产生过多热量而带来的问题。此外，它还能确保光照场的均匀性。其体积紧凑，意味着进行藻类测试时无需占用大量空间，但同时又能提供足够的样品体积，以便在测试前、测试中和测试后进行化学分析和表征。这一点在测试纳米材料时尤为重要。本视频将演示如何使用LEVITATT进行纳米材料及其他难处理物质的藻类毒性测试。该演示包含以下四个步骤。第一步，描述LEVITATT的各个组成部分。第二步是配制藻类生长培养基的溶液。第三步是概述进行藻类毒性试验的操作流程。最后一步是使用荧光计测量藻类生物量的增加。LEVITATT 可放置在室内的温控柜中。这可确保暴露过程中温度稳定。将实验装置置于旋转摇床中，以便在测试期间使样品旋转。测试在含有4毫升暴露介质的20毫升闪烁瓶中进行。带有钻孔的螺旋盖可在暴露期间实现与空气的 CO2 交换。LED 光源夹在两片塑料片之间，并位于每个外壳的中心位置。这种布置方式可产生均匀的光照场，并最大限度地减少样品之间的遮蔽效应。每个外壳均配有夹具，最多可容纳五个样品。紧凑的尺寸最大限度地减少了实验所需的空间。配制储备溶液时，称取适量的每种化合物。储备液由多种对藻类生长至关重要的盐类组成。称取适量的盐后，用超纯水稀释。储备液可通过过滤或高压灭菌进行灭菌。灭菌后，储备液可在 4 摄氏度避光保存。配制一系列暴露浓度，相邻暴露浓度之间的倍数不应超过 3.2。将适当体积的指数生长期藻类加入到每个测试浓度中。最终细胞密度应约为每毫升10,000个藻细胞。关键是要确保预培养物处于指数生长期，以满足测试的有效性标准。将测量管混合，以确保藻类和化合物在取样前均匀分布。将样品倒入烧杯中，用移液器吸取4毫升至20毫升闪烁瓶中。闪烁瓶现已被盖上盖子。从每种浓度中移取 0.4 毫升。加入 1.6 毫升丙酮以破坏细胞壁，使叶绿素释放到液相中。每个玻璃小瓶现需盖紧，以防止储存过程中丙酮挥发。将已加帽的闪烁瓶随机放入LEVITATT中，并在其中孵育72小时。在孵育开始和结束时测量光强和温度，以确保符合预期的指导要求。每隔24小时进行一次取样，用移液器从每个闪烁瓶中吸取0.4毫升样品至玻璃瓶中。加入1.6百万份丙酮以破坏细胞壁，使叶绿素释放到液相中。加入丙酮后，将瓶盖拧紧，并将样品避光保存至分析前。使用荧光计定量测试期间所采集样品中的生物量。荧光计的设置应为激发波长420纳米，发射波长671纳米。每个样品重复测量三次，并记录相对值。荧光计测得的相对值用于计算生长速率，该速率将用于后续数据处理。使用统计软件对计算出的生长速率数据拟合非线性回归曲线。非线性回归曲线的一个示例是活性函数的对数-逻辑模型。模型拟合结果同时显示了相应的 95% 置信区间。常规有效的浓度值，如10%、20%和50%无效浓度，常用于报告生态毒性试验的结果。综上所述，LEVITATT提供了一个紧凑的平台，可用于符合国际标准化指南的常规化学品藻类毒性测试。此外，该装置还为测试那些会干扰光线到达藻类的难测物质（如纳米材料或有色物质）提供了可靠的平台。

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一种用于纳米材料及其他难处理物质藻类毒性测试的小规模装置

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