Name: 单细胞基因组应用的脂肪组织核分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习从成熟脂肪细胞中有效分离单细胞核的方法，用于脂肪组织单细胞转录组分析。该方案通过荧光激活分选获得高纯度细胞核，最小化核聚集体和细胞碎片，适用于研究脂肪组织异质性和基因功能。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢阿尔伯特·爱因斯坦基因组学核心的 David Reynolds 和流式细胞术核心的 Jinghang Zhang 提供的技术支持。本研究获得了美国国立卫生研究院（NIH）（DK110426）以及爱因斯坦-西奈山糖尿病研究中心（DK020541）和纽约肥胖研究中心（DK026687）的试点与可行性资助（以上项目均由 K.S. 负责）。我们还感谢阿尔伯特·爱因斯坦癌症中心（CA013330）提供的核心设施支持。

动物护理和实验操作均按照阿尔伯特·爱因斯坦医学院机构动物护理与使用委员会批准的程序进行。
1. 组织消化和裂解缓冲液的配制
<ol>
	<li>配制组织消化缓冲液。
	<ol>
		<li>每克脂肪组织配制约 1 mL 消化缓冲液。</li>
		<li>称取 1.5 U/mL 胶原酶 D 和 2.4 U/mL 中性蛋白酶 II，加入磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制细胞核制备缓冲液（NPB）。
	<ol>
		<li>在无核酸酶水中配制含 10 mM HEPES、1.5 mM 氯化镁、10 mM 氯化钾、250 mM 蔗糖和 0.1% NP-40 的溶液，充分混匀。蔗糖溶解所需时间可能长于其他组分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）溶液。
	<ol>
		<li>在含 EDTA 的 PBS 中配制 0.5% BSA 溶液。建议使用经无菌过滤的细胞培养级 PBS（见材料表）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 脂肪组织的酶消化
<ol>
	<li>根据 Aune 等人的方法解剖小鼠以提取脂肪组织13。将分离的组织收集到含有 PBS 的培养皿中。将组织转移至滤纸上吸干，然后放入洁净的培养皿中。</li>
	<li>向消化缓冲液中加入氯化钙，使其终浓度为 10 mM。加入少量消化缓冲液至培养皿中，充分剪碎脂肪组织。所需消化缓冲液的体积取决于所获取组织的量，通常使用约 1 mL 或更少。</li>
	<li>向剪碎的组织中加入约一半体积的预配消化缓冲液（例如，五只小鼠约 10 mL）。使用血清移液管将样品转移至 50 mL 锥形离心管中。用剩余的缓冲液冲洗培养皿，并将洗液一并转移至含有样品的 50 mL 离心管中。反复吹打数次，然后在 37 °C、200–210 rpm 条件下振荡孵育 12–15 分钟。</li>
</ol>
3. 脂肪细胞的分离
<ol>
	<li>孵育后，按1:1比例向样品中加入0.5% BSA，通过反复吹打混匀。在室温（RT）下以300 × g 离心5分钟，使基质血管组分（SVF）沉淀至管底，脂肪细胞组分将保留在样品的上层。</li>
	<li>将40 µm细胞滤膜置于50 mL锥形离心管上方，过滤样品，收集上层液体，使SVF留在管底。将滤膜翻转倒扣在另一新管上，用0.5% BSA反向冲洗滤膜，收集上层液体（脂肪细胞组分）至新管中。</li>
	<li>根据样品体积，用0.5% BSA将总体积调至10–15 mL，使用血清移液管反复吹打或短暂上下振荡以混匀样品。再次在室温下以300 × g 离心5分钟。</li>
</ol>
4. 细胞核分离
<ol>
	<li>使用宽孔径的移液器吸头，小心地将样品的上层转移至放置在预冷新离心管（置于冰上）顶部的100 µm细胞滤膜上，留下任何残留的基质血管组分（SVF）。</li>
	<li>用足量的NPB冲洗/洗涤滤膜，并弃去滤膜。从本步骤开始，尽可能将样品保持在冰上，并快速操作，以避免细胞核出现渗漏或状态不佳。建议将后续步骤中将使用的微量离心管预先在冰上预冷。</li>
	<li>将样品置于冰上不超过2分钟，并间歇性轻柔颠倒混匀。冰上孵育时间应根据样品量和脂肪细胞类型进行优化。在4 °C下以1,000 x g离心10分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL NPB中。将样品转移至洁净的微量离心管中。转移时避免接触管壁，以免带入碎片和脂质。向样品中加入0.6 U/µL RNase抑制剂并混匀。再次在4 °C下以1,000 x g离心10分钟。 
	注意：对于较小的样品，此步骤的离心速度和时间应适当降低。</li>
	<li>弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL细胞核洗涤缓冲液（2% BSA/PBS + 0.6 U/µL RNase抑制剂）中。</li>
	<li>使用可堆叠的30 µm滤膜将样品经双重过滤转入洁净离心管中。用少量（约300 µL）细胞核洗涤缓冲液冲洗滤膜。或者，对于较小样品，可使用适配微量离心管的30 µm滤膜，直接过滤至管中。</li>
	<li>确认成功分离出健康的细胞核。
	<ol>
		<li>取少量样品 aliquot 用台盼蓝染色，并使用自动细胞计数仪评估平均死亡细胞大小及死亡细胞百分比。主要含细胞核的样品其平均死亡细胞大小应在7–10 µm之间。细胞核大小通常约为8 µm。</li>
		<li>取少量样品 aliquot 用DAPI染色，并在显微镜下使用20倍或更高倍物镜观察。核膜应完整，细胞核应呈圆形。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. FACS 纯化及细胞核浓度调整步骤
<ol>
	<li>立即进行流式细胞分选（FACS）步骤，以纯化细胞核并去除多余的碎片。收集缓冲液应含有细胞核洗涤缓冲液。在FACS过程中缓冲液会被稀释，因此建议配制较高浓度的BSA和RNase抑制剂，以补偿分选过程中的稀释效应。FACS收集模块应设置为冷却模式。</li>
	<li>分选完成后，于4 °C下以500 × g 离心5分钟，以浓缩样品。用适量的细胞核洗涤缓冲液重悬，使细胞核浓度达到500–1,500 个/µL。切勿完全吸除上清液，否则会导致细胞核丢失。</li>
	<li>使用血细胞计数板并对一份样品进行DAPI染色，以完成最终计数并观察细胞核形态。随后应立即按照试剂盒生产商的说明书开展单细胞核RNA测序（snRNA-seq）实验。</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

本文介绍了一种简单且稳健的分离单细胞核并研究脂肪组织异质性的方法。与全组织RNA测序相比，该实验流程能够无偏倚地揭示细胞异质性及特定细胞群体的标志物。该方法对脂肪细胞生物学、分子代谢以及肥胖研究的发展具有重要意义和创新性。
该方案特别针对snRNA-seq的下游应用进行了优化。 &#34;纯化&#34; 使用MoFlo XDP高速分选仪实现健康细胞核分离的步骤可完全去除粗悬液中的碎片和聚集体，同时保持核膜完整性。因此，该方法提高了液滴生成过程中的捕获效率，单次运行即可获得数千个单核转录组，且不影响检测到的基因数量。除了基于液滴的单细胞平台外，基于分选仪的微孔板平台和Fluidigm C1平台15 也可用于获得转录组更高分辨率和更全面的覆盖16由于该工作流程可获得高质量的细胞核，因此只需对现有的单细胞ATAC测序（scATAC-seq）方案进行最小修改，即可开展基于测序的转座酶可及性染色质分析（即ATAC-测序）。17.
<p cla...

研究表明，棕色脂肪组织（BAT）具有显著的能量消耗能力。在啮齿类动物和人类中均存在两种具有不同发育特征的产热型脂肪细胞：米色脂肪细胞和经典的棕色脂肪细胞。经典的棕色脂肪细胞主要位于肩胛间BAT储存部位，而米色脂肪细胞则在某些生理信号（如长期寒冷暴露）刺激下，零星出现在白色脂肪组织（WAT）中，这一过程被称为&#34;褐变&#34;或&#34;米色化&#34;。借助先进的成像技术，现已明确成人含有大量UCP1+ BAT，尤其在锁骨上区域1,2,3,4。成人BAT的含量与脂肪含量呈负相关，并可通过外界刺激（如长期寒冷暴露5,6或β3-肾上腺素能受体激动剂7）而增加。BAT介导的能量消耗可能为对抗肥胖提供一种可行的策略。
直到最近，产热型脂肪细胞一直被视为一个同质性的细胞群体。然而，研究发现存在多种在发育起源、底物利用和转录组方面各不相同的亚型或亚群8,9,10。例如，最近描述了一种优先利用葡萄糖进行产热的米色脂肪细胞，即葡萄糖偏好型米色脂肪细胞（g-beige adipocyte）10。由于对棕色和米色脂肪组织中细胞类型的认知尚不完善，且缺乏特异性标记物，这构成了研究其生物学功能的关键障碍。
传统的细胞亚群分离方法主要基于少数已知标记基因的表达。近年来单细胞基因组学的进步使得利用单个细胞的全基因表达数据，能够无偏倚地估计组织中细胞亚群的数量。本实验方案的最终目标是在单细胞分辨率下确定不同产热刺激条件下所有脂肪组织亚型。与其他组织和细胞类型相比，由于充满脂滴的脂肪细胞结构脆弱，鉴定脂肪组织的细胞亚型具有较大挑战性。本文介绍了一种从脂肪组织中分离单个细胞核的稳健方案，可用于后续的单核RNA测序（snRNA-seq）分析。重要的是，近期有研究对比了匹配良好的单核RNA测序（snRNA-seq）与单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据集，结果表明snRNA-seq在细胞类型识别方面与scRNA-seq相当，而在复杂组织（如脑组织）的细胞覆盖度方面更具优势11。本方案结合了Rosen等人优化的适用于脂肪组织的密度梯度离心法12，以及使用MoFlo XDP高速分选仪进行细胞核&#34;纯化&#34;的步骤。如代表性结果所示，对小鼠肩胛间棕色脂肪组织中7,500个单核的分析，在看似均一的棕色脂肪细胞中鉴定出多种不同的细胞类型。总体而言，这一简单且稳健的实验方案可用于研究脂肪细胞及脂肪组织驻留细胞的组织层次结构、鉴定特定亚型的标记基因，以及分析脂肪组织特异性基因敲除或转基因小鼠的发育表型。

<table><tbody><tr><td>autoMACS 冲洗液</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>含EDTA的PBS；经无菌过滤</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤器 100 &amp;mu;m</td><td>康宁</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤器 40&amp;mu;m</td><td>康宁</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &amp;mu;m)</td><td>希森美康</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>罗氏</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>罗氏</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainer（30 &amp;micro;m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>可堆叠滤光片</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP 细胞分选仪</td><td>贝克曼库尔特</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase抑制剂</td><td>罗氏</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

棕色脂肪和米色脂肪是特殊的脂肪组织，可通过依赖解偶联蛋白1（UCP1）和非依赖UCP1的途径以耗散能量的方式进行产热。直到最近，产热型脂肪细胞一直被视为一个同质的细胞群体。然而，近期研究表明，存在多种在发育起源、底物利用和转录组特征上各不相同的亚型或细胞亚群。尽管单细胞基因组学已取得进展，但由于充满脂质的脂肪细胞结构脆弱，将脂肪组织无偏地分解为不同细胞亚型仍具挑战性。本方案旨在通过高效地从脂肪组织中分离单个细胞核，用于包括RNA测序在内的下游应用，从而克服上述困难。随后可利用RNA测序及生物信息学分析来研究细胞异质性。

未经分选的脂肪细胞核中含有碎片和双核体，会在后续的单细胞RNA测序中产生噪声和高背景信号。图1展示了典型的流式细胞分选门控策略。首先根据前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）选择细胞核（A）；接着，仅根据SSC的宽度和高度组合筛选出单细胞核（B）；最后，仅选择DAPI阳性事件并分选至收集缓冲液中（C）。该流程可获得高纯度的单核，显著减少核聚集体和细胞碎片（图2）。
为确认分选后细胞核的完整性，取少量样品经DAPI染色后在显微镜下观察。细胞核膜应保持完整，且细胞核呈圆形（图2B）。为验证纯化效果，还建议在离心后收集上清液（即收集缓冲液），并...

本文介绍了一种从成熟脂肪细胞中分离细胞核、通过荧光激活分选进行纯化以及在单细胞水平上进行转录组学分析的实验方案。

棕色和米色脂肪是特殊的脂肪组织，可通过依赖解偶联蛋白1（UCP1）和非依赖UCP1的机制耗散能量以实现产热……

由于脂肪细胞结构脆弱，将脂肪组织分解为亚型一直具有挑战性。本方案通过高效分离单个细胞核来克服这一难题。该工作流程可获得高纯度的单细胞核，同时最大限度减少细胞核聚集体和细胞碎片。这对于数千个细胞的单细胞转录组分析具有优势。该简单且稳健的实验方案可用于研究脂肪细胞及其脂肪组织驻留细胞在组织水平上的结构，特别是用于发育表型分析、脂肪组织特异性基因敲除以及转基因小鼠的研究。本方案的可视化演示至关重要，可使缺乏脂肪细胞操作经验的研究人员能够重复实验并深入了解脂肪组织的异质性。从小鼠体内采集脂肪组织后，用纸巾轻轻吸干，置于洁净的培养皿中。向消化缓冲液中加入氯化钙，使其终浓度为 10 mM。然后，向组织中加入少量液体并充分剪碎。向剪碎的组织中加入约等量的一半体积的预配消化缓冲液。使用刻度移液管将样品转移至50 mL离心管中。用剩余的缓冲液洗涤培养皿，并将其加入50 mL离心管中。用移液器将样品上下吹打数次。然后，在37摄氏度下振荡孵育12至15分钟，转速为200至210 rpm。孵育后，按1:1的体积比向样品中加入0.5% BSA，并用移液器充分混匀。在室温下以300 ×g离心5分钟，使基质血管组分沉淀，脂肪细胞组分保留在上层。将上层组分通过400 µm细胞滤器过滤至50 mL离心管中。然后，将滤膜翻转倒置于离心管上方，使用0.5% BSA反向冲洗滤膜，将脂肪细胞转移至新的离心管中。用0.5% BSA将总体积调整至10至15 mL，用血清移液管反复吹打混匀样品。随后，在室温下以300 ×g离心5分钟。离心后，使用宽口移液器吸头小心地将样品的上层转移至置于冰上新预冷管顶部的100 m细胞滤膜上。用足量的细胞核制备缓冲液冲洗滤膜，然后将其丢弃。从这一步开始，始终将样品置于冰上并快速操作。将样品置于冰上，间歇颠倒离心管以混匀，静置最多两分钟。然后在4°C条件下以1000 ×g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL细胞核制备缓冲液中。将样品转移至洁净的微量离心管中，注意避免接触旧管的管壁。加入每升0.6单位的RNase抑制剂并混匀。然后，将样品再离心10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL细胞核洗涤缓冲液中。使用可堆叠的30 µm滤器将样品过滤至洁净离心管中。然后，用约300 µL细胞核洗涤缓冲液洗涤滤器。为确认成功分离出健康的细胞核，取少量样品用台盼蓝染色，并使用自动细胞计数仪评估平均死亡细胞大小及死细胞百分比。另取少量样品用DAPI染色，在显微镜下使用20倍或更高倍数的物镜进行观察。细胞核应呈圆形，且具有完整的核膜。白色箭头指示核膜不完整的细胞核。使用流式细胞术纯化细胞核后，于 4 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟，浓缩该样品。随后，将其重悬于适当体积的细胞核洗涤缓冲液中。为了达到每升50至1500个细胞核的浓度，并进行单细胞核RNA测序。为去除细胞碎片和双细胞核，根据细胞核的大小和颗粒度对脂肪细胞核进行分选，以排除细胞核聚集体和多重体，最后筛选DAPI阳性的事件。这种梯度分离策略可获得高纯度的单核，且聚集体和碎片极少。通过显微镜观察，分选后的细胞核应呈圆形，并具有完整的膜结构。还可使用针对新生Ucp1 mRNA（棕色脂肪细胞的标志基因）的引物，通过实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）来验证细胞核纯化的成功程度。铬平台测定了小鼠肩胛间棕色脂肪组织中7500个细胞核的转录组。通过t-SNE降维和k-means聚类分析揭示了七种不同的细胞类型。所有簇均表达Fabp4（一种泛脂肪细胞基因），其中一部分簇表达高水平的Ucp1 mRNA。通过本方案分离并确认的细胞核，可适用于几乎所有单细胞水平的基因表达分析平台，包括10x Genomics的Chromium系统。

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

单细胞基因组应用的脂肪组织核分离

由于肥胖与其他共病之间存在显著且负面的关联，研究脂肪组织在疾病和整体健康中的作用具有重要意义。本文介绍了一种分离和切除脂肪组织库的实验方案，可用于通过原位（in situ）和体外（in...

小鼠脂肪组织的定位、鉴定与切除

单个细胞核的分离依赖于细胞膜的解离和基于去垢剂的透化处理，这些步骤需要优化，且容易引入技术性假象。我们展示了一种无需去垢剂和酶的快速分离完整细胞核的方案，可直接从完整组织中获取适用于单细胞核RNA测序（snRNA-Seq）或ATAC-seq的细胞核。...

使用去污剂和酶解-free方法从完整组织中分离细胞核

本实验方案描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离技术，从小鼠腹腔内白色脂肪组织（WAT）储存部位中分离脂肪生成性及纤维炎症性基质细胞亚群的技术方法。...

从小鼠腹腔内脂肪组织库中分离脂肪生成性与纤维-炎症性基质细胞亚群

本研究介绍了一种分离小鼠棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析的新方法。...

从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析

本文介绍一种从冻存小鼠肾脏中分离高质量细胞核的实验方案，该方法可提高肾髓质细胞类型的代表性，并避免酶解组织解离导致的基因表达异常。...

从成年小鼠肾脏中分离细胞核用于单细胞核RNA测序

本文介绍一种从速冻保存的存档肝组织中分离细胞核的方案，用于单细胞核RNA测序（RNA-seq）、ATAC-seq以及联合多组学分析（RNA-seq和ATAC-seq）。...

从速冻肝组织中分离细胞核用于单细胞多组学分析

我们介绍一种针对脂肪细胞的高通量测序转座酶可及染色质分析（ATAC-seq）方案，该方法专门利用携带核荧光标记的转基因报告小鼠分离的脂肪组织，通过细胞核分选实现。...

使用荧光激活细胞核分选技术对脂肪组织进行脂肪细胞特异性ATAC-Seq

本文介绍了一种细胞核制备的实验方案。在将心脏组织经显微解剖和酶解离为单个细胞后，祖细胞被冷冻保存，随后分离出纯度高且具有活性的细胞，用于单核RNA测序以及基于高通量测序的单核转座酶可及性染色质分析。...

从小鼠心脏前体细胞中分离细胞核用于单细胞分辨率下的表观基因组和基因表达谱分析

本研究介绍了一种简单、快速且部分自动化的方案，用于从冷冻的哺乳动物组织中分离高质量的细胞核，以用于后续的单细胞核RNA测序。...

一种简单、快速且部分自动化的从冷冻哺乳动物组织中分离单核用于单核测序的方案

由于人体组织获取受限，肌间脂肪组织（IMAT）的生物学特性在很大程度上尚未被探索。本文介绍了一种从冷冻的人类IMAT样本中分离细胞核并构建文库的详细方案，用于单细胞核RNA测序，以鉴定这一独特脂肪储存库的细胞组成。...

从人间质脂肪组织中分离细胞核及后续单细胞核RNA测序

学习从成熟脂肪细胞中有效分离单细胞核的方法，用于脂肪组织单细胞转录组分析。该方案通过荧光激活分选获得高纯度细胞核，最小化核聚集体和细胞碎片，适用于研究脂肪组织异质性和基因功能。

用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

探索更多视频