用于单细胞基因组学应用的脂肪组织细胞核分离

由于脂肪细胞结构脆弱，将脂肪组织分解为亚型一直具有挑战性。本方案通过高效分离单个细胞核来克服这一难题。该工作流程可获得高纯度的单细胞核，同时最大限度减少细胞核聚集体和细胞碎片。

这对于数千个细胞的单细胞转录组分析具有优势。该简单且稳健的实验方案可用于研究脂肪细胞及其脂肪组织驻留细胞在组织水平上的结构，特别是用于发育表型分析、脂肪组织特异性基因敲除以及转基因小鼠的研究。

本方案的可视化演示至关重要，可使缺乏脂肪细胞操作经验的研究人员能够重复实验并深入了解脂肪组织的异质性。从小鼠体内采集脂肪组织后，用纸巾轻轻吸干，置于洁净的培养皿中。向消化缓冲液中加入氯化钙，使其终浓度为 10 mM。

然后，向组织中加入少量液体并充分剪碎。向剪碎的组织中加入约等量的一半体积的预配消化缓冲液。使用刻度移液管将样品转移至50 mL离心管中。

用剩余的缓冲液洗涤培养皿，并将其加入50 mL离心管中。用移液器将样品上下吹打数次。然后，在37摄氏度下振荡孵育12至15分钟，转速为200至210 rpm。

孵育后，按1:1的体积比向样品中加入0.5% BSA，并用移液器充分混匀。在室温下以300 ×g离心5分钟，使基质血管组分沉淀，脂肪细胞组分保留在上层。将上层组分通过400 µm细胞滤器过滤至50 mL离心管中。

然后，将滤膜翻转倒置于离心管上方，使用0.5% BSA反向冲洗滤膜，将脂肪细胞转移至新的离心管中。用0.5% BSA将总体积调整至10至15 mL，用血清移液管反复吹打混匀样品。随后，在室温下以300 ×g离心5分钟。

离心后，使用宽口移液器吸头小心地将样品的上层转移至置于冰上新预冷管顶部的100 m细胞滤膜上。用足量的细胞核制备缓冲液冲洗滤膜，然后将其丢弃。从这一步开始，始终将样品置于冰上并快速操作。

将样品置于冰上，间歇颠倒离心管以混匀，静置最多两分钟。然后在4°C条件下以1000 ×g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于1 mL细胞核制备缓冲液中。

将样品转移至洁净的微量离心管中，注意避免接触旧管的管壁。加入每升0.6单位的RNase抑制剂并混匀。然后，将样品再离心10分钟。

弃去上清液，将沉淀重悬于1 mL细胞核洗涤缓冲液中。使用可堆叠的30 µm滤器将样品过滤至洁净离心管中。然后，用约300 µL细胞核洗涤缓冲液洗涤滤器。

为确认成功分离出健康的细胞核，取少量样品用台盼蓝染色，并使用自动细胞计数仪评估平均死亡细胞大小及死细胞百分比。另取少量样品用DAPI染色，在显微镜下使用20倍或更高倍数的物镜进行观察。细胞核应呈圆形，且具有完整的核膜。

白色箭头指示核膜不完整的细胞核。使用流式细胞术纯化细胞核后，于 4 摄氏度下以 500 ×g 离心 5 分钟，浓缩该样品。随后，将其重悬于适当体积的细胞核洗涤缓冲液中。

为了达到每升50至1500个细胞核的浓度，并进行单细胞核RNA测序。为去除细胞碎片和双细胞核，根据细胞核的大小和颗粒度对脂肪细胞核进行分选，以排除细胞核聚集体和多重体，最后筛选DAPI阳性的事件。

这种梯度分离策略可获得高纯度的单核，且聚集体和碎片极少。通过显微镜观察，分选后的细胞核应呈圆形，并具有完整的膜结构。还可使用针对新生Ucp1 mRNA（棕色脂肪细胞的标志基因）的引物，通过实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）来验证细胞核纯化的成功程度。

铬平台测定了小鼠肩胛间棕色脂肪组织中7500个细胞核的转录组。通过t-SNE降维和k-means聚类分析揭示了七种不同的细胞类型。所有簇均表达Fabp4（一种泛脂肪细胞基因），其中一部分簇表达高水平的Ucp1 mRNA。

通过本方案分离并确认的细胞核，可适用于几乎所有单细胞水平的基因表达分析平台，包括10x Genomics的Chromium系统。