Name: 甲基化RNA免疫沉淀分析研究m5C在阿拉伯的修改 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 了解甲基化RNA免疫沉淀分析（MeRIP）技术，用于在拟南芥中研究m⁵C修饰。该方法结合深度测序，可有效富集甲基化RNA片段并鉴定转录本修饰位点。

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本工作获得了向 E.S. 提供的 IMPRS 博士奖学金、向 V.P. 提供的 EMBO 长期博士后奖学金，以及向 F.K. 提供的马克斯·普朗克分子植物生理研究所（MPI-MPP）内部资金的支持。部分工作还通过 PLAMORF 项目获得资助，该项目由欧洲研究理事会（ERC）根据欧洲联盟“地平线 2020”研究与创新计划（资助协议编号：810131）提供资金支持。作者谨此感谢 Federico Apelt 在生物信息学分析及稿件审阅方面提供的帮助，以及 Mathieu Bahin 和 Amira Kramdi 在生物信息学分析方面的贡献。&#160;Colot 实验室的工作得到了“未来投资计划”（Investissements d’Avenir）ANR-10-LABX-54 MEMO LIFE 和 ANR-11-IDEX-0001-02 PSL* 研究型大学项目的支持。

1. RNA 的制备
<ol>
	<li>在液氮中将200 mg植物组织研磨成粉末，确保整个操作过程中组织始终保持冷冻状态。</li>
	<li>按照酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法从目标植物组织中提取RNA。为降低相分离过程中DNA污染RNA的可能性，使用1-溴-3-氯丙烷代替氯仿。
	<ol>
		<li>向研磨后的植物组织中加入1 mL含有硫氰酸胍和酸性苯酚的RNA提取试剂（每100 mg组织加500 µL），通过反复倒置充分混匀，确保所有组织均被浸润。室温孵育10分钟，以解离核糖核蛋白复合物。</li>
		<li>在4 °C、12,000 × g条件下离心10分钟，将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>加入200 µL 1-溴-3-氯丙烷（每500 µL RNA提取试剂加100 µL），剧烈涡旋振荡。</li>
		<li>在4 °C、12,000 × g条件下离心15分钟，将上层水相（约500 µL）转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>加入等体积异丙醇（500 µL）和0.1体积3 M乙酸钠（pH 5.5）（50 µL），通过反复倒置充分混匀，并在-20 °C沉淀10分钟。 
		注：建议使用乙酸钠（NaOAc）以增强RNA沉淀效果。可在本步骤暂停实验，延长RNA沉淀时间数小时甚至过夜。</li>
		<li>在4 °C、12,000 × g条件下离心30分钟，弃去上清液。</li>
		<li>用500 µL 80%乙醇洗涤沉淀两次，每次在4 °C、12,000 × g条件下离心5分钟，弃去乙醇。</li>
		<li>用500 µL 99%乙醇洗涤沉淀一次，在4 °C、12,000 × g条件下离心5分钟，弃去乙醇。</li>
		<li>将沉淀干燥5–10分钟，溶于30 µL无RNase的H2O中。 
		注：也可选用其他RNA提取方法（例如基于柱纯化的系统）。如果所选方案中包含DNase消化步骤，则跳过后续步骤（步骤1.3）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测定RNA浓度（例如使用分光光度计），并对20 µg RNA进行DNase消化。 
	注：DNA富含m5C，而抗体无法区分DNA与RNA。
	<ol>
		<li>在典型的DNase反应中，将10 µg RNA加入50 µL反应体系。混合以下组分，并在37 °C孵育30分钟： 
		RNA 10 µg x µL 
		10× DNase缓冲液 5 µL 
		DNase 1 µL（2单位） 
		无RNase的H2O 补足至50 µL</li>
		<li>通过加入适量的DNase失活试剂（如试剂盒中提供并按制造商说明操作），或通过纯化步骤（例如柱纯化或苯酚/氯仿提取）去除酶活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过毛细管电泳检测所分离RNA的质量与纯度，若RNA完整性数值（RIN）高于7，则继续实验，以确保样品质量良好。</li>
	<li>可选：使用rRNA去除试剂盒并按照制造商说明书操作，去除核糖体RNA，以富集样品中的mRNA含量。
	<ol>
		<li>使用前一步经DNase处理的RNA进行rRNA去除反应。若总RNA量超过反应建议的最大量，应分多次进行反应。</li>
		<li>注意，rRNA去除后仅能回收输入量的5–10%。后续实验应使用等量的rRNA去除后RNA（所有样品间等量），并忽略后续步骤中提及的RNA量，因其均指总RNA量。 
		注：有关现有rRNA去除方法的比较与描述，请参见参考文献38,39,40。rRNA是总RNA的主要组成部分，并在多种生物中存在m5C甲基化修饰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>预先制备体外转录本（IVT），作为对照RNA序列加入样品中。
	<ol>
		<li>使用体外转录试剂盒制备两种不同的IVT，一种使用非甲基化的核苷酸，另一种将rCTP替换为5-甲基-rCTP，分别作为MeRIP实验的阴性对照和阳性对照。所制备的转录本为EGFP和Renilla荧光素酶的转录本。 
		注：IVT不应存在于待分析生物的转录组中。若两种IVT来源于同一模板（例如均为EGFP），则应将阳性和阴性对照分别加入不同样品中；若其序列不同（例如EGFP与Renilla），则可加入同一样品中。</li>
		<li>每3 µg RNA中加入0.1 ng IVT作为对照。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将RNA超声处理至约100 nt的片段。 
	注：RNA打断的条件需预先优化，不同超声仪的条件有所不同。本实验所用仪器的超声条件为：峰值功率174，占空比10，每脉冲循环数200，持续17分钟。
	<ol>
		<li>所有样品使用相同量的RNA进行超声处理，每份样品至少12 µg RNA，总体积为80 µL（最小60 µL，最大100 µL），用无RNase的H2O补足。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过毛细管电泳确认超声处理的效率及RNA样品的浓度。片段化RNA的平均长度应约为100 nt。</li>
</ol>
2. 甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）
<ol>
	<li>在低吸附离心管中加入 9 µg 超声处理的 RNA，并用无 RNase 的 H2O 定容至 60 µL（或根据浓度调整为更多体积）。</li>
	<li>将 RNA 在 70 °C 水浴中加热 10 分钟以解开二级结构，随后在冰水混合物中冷却 10 分钟。</li>
	<li>将样品分为三部分：取其中三分之一（若第 2.1 步中为 60 µL，则此处为 20 µL）作为 Input 样品，单独保存于 -80 °C 的离心管中；将剩余的 40 µL 用无 RNase 的 H2O 定容至 860 µL，再均分至两个低吸附离心管中，每管 430 µL，分别用于免疫沉淀（IP）和模拟对照（Mock control）。</li>
	<li>向两个管中分别加入： 
	50 µL 10x MeRIP 缓冲液 
	10 µL RNase 抑制剂 
	在 IP 样品中加入 10 µL α-m5C 抗体（10 µg），在 Mock 样品中加入 10 µL 无抗体的 H2O 
	注：此前使用的抗体克隆已不再商业化供应。然而，任何抗 5-甲基胞嘧啶的单克隆抗体均应具有类似效果。在用于 MeRIP 实验前，应先验证抗体的特异性11,23。</li>
	<li>用封口膜密封离心管，在 4 °C 条件下以旋转仪孵育 12–14 小时。</li>
	<li>次日，准备用于结合的蛋白 G 磁珠。
	<ol>
		<li>为每个管（IP 或 Mock 对照）准备 40 µL 磁珠。将所需总量的磁珠（管数 × 40 µL，例如 2 个 IP 和 2 个 Mock 样品共需 160 µL）加入一个 15 mL 离心管中，每份样品用 800 µL 1x MeRIP 缓冲液洗涤三次（缓冲液体积为管数 × 800 µL，例如 2 个 IP 和 2 个 Mock 样品共需 3.2 mL）。</li>
		<li>室温下以旋转仪孵育 5 分钟进行洗涤，使用磁力架收集磁珠并弃去洗涤液。第三次洗涤后，将磁珠重悬于与初始磁珠体积相等的 1x MeRIP 缓冲液中（管数 × 40 µL，例如 2 个 IP 和 2 个 Mock 样品使用 160 µL 1x MeRIP 缓冲液）。 
		注：所用蛋白 G 磁珠的量取决于磁珠对特定抗体类型的结合能力以及所用抗体的量。本实验中，磁珠对小鼠 IgG 的结合能力约为每毫克磁珠结合 8 µg，磁珠浓度为 30 mg/mL。因此，40 µL 磁珠足以结合约 9.6 µg 抗体。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向每个 IP 和 Mock 样品中加入 40 µL 重悬的磁珠，在 4 °C 条件下继续以旋转仪孵育 2 小时。</li>
	<li>将离心管置于磁力架上静置 1 分钟，弃去上清液，或将其保留作为对照（非结合 RNA 样品）。</li>
	<li>用含 0.01% Tween 20 的 700 µL 1x MeRIP 缓冲液重悬磁珠，室温下以旋转仪孵育 10 分钟，重复此洗涤步骤共 5 次。</li>
	<li>将洗涤后的磁珠重悬于 200 µL 蛋白酶 K 消化缓冲液中，加入 3.5 µL 蛋白酶 K，在 50 °C 条件下以 800 rpm 振荡孵育 3 小时。若孵育过程中磁珠出现沉淀，可偶尔手动轻弹管底以混匀。</li>
	<li>通过加入 800 µL RNA 提取试剂，按照酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法提取 RNA，并继续执行第 1.2 步操作。为提高 RNA 沉淀的可见性，可在异丙醇沉淀步骤中加入有色共沉淀剂。将沉淀重悬于 20 µL 无 RNase 的 H2O 中（或与第 2.3 步中保留的 Input 样品体积相等）。</li>
</ol>
3. 下游分析
<ol>
	<li>将 Input 和 IP 样本提交进行单端测序，读长为 50 个碱基（SE50）。</li>
	<li>使用 cutadapt41 去除 3’端接头序列，并剔除长度短于 48 nt 的读段。</li>
	<li>使用 STAR42 将修剪后的读段比对至拟南芥基因组（TAIR10 注释），允许最大 6% 的错配率和最大 10 kb 的内含子长度。保留唯一比对的读段用于后续分析。</li>
	<li>采用两种不同方法识别 IP 样本相对于 Input 样本显著富集的 RNA 片段，并仅保留被两种方法均鉴定为显著富集的片段。
	<ol>
		<li>首先，使用 MACS2 峰值识别工具43 对合并的 IP 样本与 Input 样本进行 MeRIP-seq 峰值检测。</li>
		<li>其次，按照 Meyer 等人22 和 Yang 等人17 描述的方法进行 MeRIP-seq 峰值识别分析。
		<ol>
			<li>使用自定义 R 脚本，将基因组划分为连续的 25 nt 窗口，并根据每个读段最后一个比对核苷酸的位置统计每个窗口中唯一比对读段的数量（因为读段来源于 100 nt 的 RNA 片段）。</li>
			<li>使用 Fisher 精确检验计算 IP 样本相对于 Input 样本中显著富集的窗口。采用 Benjamini-Hochberg 方法&#160;对多重检验进行校正。</li>
			<li>保留跨越至少两个连续窗口的显著富集峰，剔除仅覆盖一个窗口的峰。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>识别由上述两种方法共同鉴定出的、在基因组注释区域（转录本）中显著富集的峰。</li>
	<li>可选或补充地，对特定 RNA 目标序列在 IP 样本中的富集情况进行验证。
	<ol>
		<li>使用随机六聚体引物对 RNA（Input、IP 和 Mock 样本取相同体积）进行逆转录。</li>
		<li>对选定的目标序列进行定量实时 PCR，通过 ΔΔCt 法比较 Input、IP 和 Mock 样本。 
		注意：扩增产物长度不应超过 100 bp，因为这是 RNA 片段的平均大小。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Linder, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleotide-resolution+mapping+of+m6A+and+m6Am+throughout+the+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome.</a> Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

RNA 含有超过一百种不同的碱基修饰4，这些修饰构成了表观转录组44。这些修饰为翻译和信号传导的调控增添了额外层次（综述见5,6,8,20,45,46）。早期研究能够检测到 RNA 上转录后修饰的存在28,47，但要理解表观转录组学的作用，必须明确具体是哪些 RNA 被修饰。MeRIP 被设计为一种可在转录组范围内定位 RNA 甲基化位点的方法21,22。只要存在特异性抗体，该方法即可适用于任何类型的修饰。
本方案的主要优势在于其相对简单、对RNA和操作者安全（例如，5-azaC对植物和人类具有高度毒性），且无需序列信息或修饰酶的相关信息。此外，通过免疫沉淀（IP）富集甲基化RNA可提高检测低丰度mRNA的可能性，而亚硫酸氢盐测序则缺乏富集步骤。当进行两轮连续的MeRIP时，含有甲基化位点的RNA片段富集程度会进一步增加22。MeRIP的一个局限性在于，尤其是在用于mRNA甲基化研究时，实验需要输入大量RNA。核糖体RNA去除（ribodepletion）或poly(A)富集步骤虽可降低因高度修饰的核糖体RNA造成的背景信号，但同时会去除超过90%的总RNA。此外，DNA必须被完全去除，因其富含5-甲基胞嘧啶。另一个缺点是难以精确定位甲基化位点的具体位置。在与抗体孵育前对RNA进行超声处理有助于缩小修饰区域至100–200个核苷酸范围内。当MeRIP与深度测序结合时，由于测序读段在潜在甲基化位点周围呈现高斯分布，m5C位点预测的分辨率得以提高。此外，在实验前需验证抗体的特异性（例如，使用含修饰核苷酸合成的寡核苷酸进行RNA点印迹实验），然而，抗体在多大程度上能够区分结构相近的修饰（如m6A与m6Am）仍是领域内争议的问题48,49。此外，高度结构化的RNA可能干扰抗体与抗原的结合，这一限制主要通过在IP前对RNA进行片段化和变性处理来解决。相反，亚硫酸氢盐测序虽也受RNA二级结构影响，但不包含片段化步骤，这可能是导致由亚硫酸氢盐测序16和MeRIP-seq11,17所预测的m5C位点及mRNA存在差异的原因之一。其他胞嘧啶修饰（如hm5C）同样对亚硫酸氢盐介导的脱氨作用具有抗性35。
MeRIP-seq 的改进方法包括引入交联步骤，例如添加光活化核糖核苷（光交联辅助m6A测序，PA-m6A-seq 50），或在免疫沉淀（IP）后使用紫外光在抗体与RNA之间形成交联（miCLIP49，此方法不同于引言中描述的miCLIP30，但同样具有单核苷酸分辨率）。随着对RNA甲基化知识的不断积累，未来可能更倾向于采用基于修饰酶和/或甲基化发生位点的共有序列的靶向性更强的方法。识别“阅读器”蛋白对于理解转录后修饰的分子机制和信号功能至关重要。纳米孔测序技术已能够无需对RNA进行预处理即可直接识别修饰核苷酸17，但在测序深度和生物信息学分析方面仍有改进空间。总体而言，MeRIP-seq 目前仍是一种成熟、可靠且无偏倚的鉴定甲基化RNA转录本的方法。

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Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua
to:
Eleftheria Saplaoura1, Valentina Perrera2, Vincent Colot3, Friedrich Kragler1 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology 
2Department of Molecular Medicine, Medical School, University of Padua 
3Biologie de l&#39;Ecole Normale Sup&#233;rieure (IBENS),&#160;Paris, France

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Erratum: Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

在生命三界中，RNA分子都会经历转录后修饰，针对这些具有功能意义的生化修饰的研究被称为“表观转录组学”。表观转录组学是一个快速发展的领域，目前已有多种方法被开发用于研究和绘制RNA分子上的修饰图谱（综述见1,2）。目前已发现超过一百种RNA修饰，这些修饰存在于rRNA、tRNA、其他非编码RNA以及mRNA中3,4。尽管tRNA和rRNA中化学多样性丰富的转录后修饰的存在形式与功能已被广泛研究5,6,7,8，但mRNA修饰的系统性表征直到近期才得以开展。在植物中，迄今已鉴定出多种mRNA修饰，包括帽子结构上的m7G9、m1A10、hm5C11,12以及尿苷酸化修饰13。然而，在拟南芥中，仅有m6A10,14,15、m5C11,16,17和假尿苷（pseudouridine）18实现了全转录组水平的定位。转录后mRNA碱基修饰参与调控多个发育过程19,20。
表观转录组学中最常用的方法之一是甲基化RNA免疫沉淀结合深度测序（MeRIP-seq）。MeRIP-seq于2012年开发，用于研究哺乳动物细胞中的m6A修饰21,22。该方法需要使用针对目标修饰的特异性抗体，旨在富集携带修饰核苷酸的RNA片段。随后通常进行深度测序以鉴定和定位富集的RNA片段，或通过定量PCR验证特定的RNA靶标。MeRIP的准确性依赖于抗体对目标修饰核苷酸的特异性识别能力，以区别于其他相似的修饰（例如m5C和hm5C11,23）。除了m6A，MeRIP-seq还已被应用于多种生物中m1A和m5C RNA甲基化的研究11,17,23,24,25。
胞嘧啶在第五位碳原子上的甲基化（m5C）是最常见的DNA修饰26,27，同时也是最常见的RNA修饰之一3,4。尽管m5C早在1975年就在真核生物mRNA中被发现28，但直到最近，研究才开始聚焦于在编码RNA和非编码RNA中全转录组水平地绘制这种修饰图谱11,16,17,23,29,30,31,32,33,34。
在m5C RNA研究中使用的替代方法包括将未甲基化的胞嘧啶通过化学转化变为尿嘧啶（亚硫酸氢盐测序）以及基于已知RNA胞嘧啶甲基转移酶与其RNA靶标不可逆结合的免疫沉淀实验（miCLIP、aza-IP）。简而言之，亚硫酸氢盐测序利用了5-甲基胞嘧啶对亚硫酸氢钠处理具有抗性，而未修饰的胞嘧啶则会被脱氨转化为尿嘧啶的特性。该方法最初为DNA设计，后也被应用于RNA，许多研究已采用此方法检测RNA中的m5C位点16,23,29,32,34,35。miCLIP和aza-IP均需事先了解特定的RNA胞嘧啶甲基转移酶，并使用相应的抗体。在miCLIP（甲基化单核苷酸分辨率交联免疫沉淀）方法中，甲基转移酶携带单个氨基酸突变，使其能够结合RNA底物但无法解离30。而在aza-IP（5-氮杂胞苷介导的RNA免疫沉淀）中，当外源提供的5-氮杂胞苷（5-azaC）被RNA聚合酶掺入目标RNA分子后，5-azaC核苷与RNA胞嘧啶甲基转移酶之间会形成不可逆结合31。
这三种方法的主要优势在于能够实现m5C的单核苷酸分辨率定位。此外，miCLIP和aza-IP可提供特定RNA胞嘧啶甲基转移酶作用靶点的信息，从而更深入地解析转录后RNA修饰的机制与功能。然而，MeRIP-seq方法能够在无需先验知识的情况下识别全转录组范围内的m5C区域，并避免使用亚硫酸氢盐处理或5-azaC孵育等剧烈的化学和温度条件。MeRIP和亚硫酸氢盐测序均可能受到RNA二级结构的抑制36。MeRIP实验在免疫沉淀前包含的RNA片段化步骤，旨在促进抗体结合，并提高m5C识别的分辨率。
另一种值得提及的方法是RNA核苷的质谱分析法（MS）。质谱法能够检测并区分DNA和RNA上的各种修饰类型。简而言之，首先提取RNA，经DNase消化后去盐，并将其降解为单个核苷。随后通过质谱仪分析这些RNA核苷。该方法可用于定量每种修饰的水平，且无需依赖抗体或化学转化。然而，其主要缺点在于仅能提供有关RNA修饰存在的整体信息。为了定位修饰位点，需要将质谱法与RNase消化及特定RNA分子的测序信息相结合，例如在人类tRNALeu(CAA)37中的应用情况。
本文介绍并讨论了MeRIP实验方法在研究拟南芥m5C RNA甲基化中的应用17。

<table><tbody><tr><td>抗-m&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt;C 抗体</td><td>ZymoResearch</td><td>A3001（已停产），A3002 可用</td><td>克隆 10G4（已停产），7D21 可用</td></tr><tr><td>毛细管电泳芯片及试剂</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td>RNA 6000 Nano 试剂盒</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td>TURBO DNA-free 试剂盒</td></tr><tr><td>核酸共沉淀剂</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td>甘油蓝（Glycoblue），15 mg/mL</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;体外&lt;/em&gt;转录试剂盒</td><td>Promega</td><td>P1300</td><td>T7 RiboMAX 大规模 RNA 合成系统</td></tr><tr><td>低吸附反应管</td><td>Kisker Biotech</td><td>G017</td><td>1.7 ml 微量离心管</td></tr><tr><td>Protein G 磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>10003D</td><td>Dynabeads Protein G</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td>20 mg/mL 储存液，RNA 级</td></tr><tr><td>RNase 抑制剂</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td>RNasin Plus 40 U/&amp;mu;l</td></tr><tr><td>rRNA 去除试剂盒</td><td>Epicentre</td><td>RZPL11016</td><td>Ribo-Zero rRNA 去除试剂盒（植物叶片）</td></tr><tr><td>超声破碎管</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>microtube AFA Fiber 预切口 snap-cap 6x16 mm</td></tr><tr><td>RNA 提取试剂</td><td>Ambion</td><td>15596018</td><td>TRIzol 试剂</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>毛细管电泳仪</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td>2100 Bioanalyzer 系统</td></tr><tr><td>磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>DynaMag-2</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>已停产</td><td>5417R 型号</td></tr><tr><td>旋转混匀仪</td><td>Benchmark</td><td>R4040</td><td>RotoBot Mini</td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>500217</td><td>S220 聚焦式超声破碎仪</td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td>NanoDrop OneC</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>GFL</td><td>1012</td><td>1012 培养浴</td></tr></tbody></table>

用于研究拟南芥中 m5c 修饰的甲基化 rna 免疫沉淀实验

Methylated RNA Immunoprecipitation Assay to Study m5C Modification in Arabidopsis

RNA上的二级碱基修饰（如m5C）会影响修饰后RNA分子的结构与功能。甲基化RNA免疫沉淀结合测序（MeRIP-seq）是一种旨在富集甲基化RNA并最终鉴定出修饰转录本的方法。简而言之，将超声处理后的RNA与针对5-甲基胞嘧啶的抗体孵育，并借助蛋白G磁珠进行沉淀。富集得到的RNA片段随后进行测序，通过测序读段的分布情况和峰识别来定位潜在的甲基化位点。MeRIP-seq可应用于任何生物体，因其无需预先了解序列信息或修饰酶的相关知识。此外，除片段化处理外，RNA不经历其他任何化学或温度处理。然而，与其他方法不同，MeRIP-seq无法实现甲基化位点的单核苷酸精度预测，尽管可将甲基化区域缩小至数个核苷酸范围内。通过使用针对不同修饰类型的特异性抗体，MeRIP可被调整以适用于RNA上存在的多种碱基修饰，从而拓展该方法的潜在应用范围。

该方法的示意图见图1。本实验方案的前两个关键步骤是获得高质量的RNA（RIN ≥ 7）并将RNA超声处理成约100个核苷酸长度的片段。这两个步骤的效率均通过基于芯片的毛细管电泳仪进行检测。图2A展示了一个高质量RNA样本的典型检测结果。为使样本浓度处于所用试剂盒的检测范围（5–500 ng/µL），上样前需将样本稀释10倍。同一RNA样本在超声处理后也进行了检测，结果如图2B所示。请注意图中出现一个均匀的单峰，向左偏移，片段大小约为100个核苷酸。浓度降低的原因一方面是RNA在片段化过程中有所损失，另一方面也由于样本体积增加（60–100 µL，步骤1.7.1）。
IP 样本和阴性对照样本的质量可通过定量反转录 PCR（qRT-PCR）进行评估。为此，外源添加的体外转录本（IVT）可作为阳性和阴性对照：其中所有胞嘧啶位点均为 m5C 修饰的甲基化 IVT，预期在 IP 样本中显著富集；相反，非甲基化 IVT 在 IP 与阴性对照样本之间应无显著差异。用于检测两种对照 IVT（EGFP 和 Renilla 荧光素酶）的 qRT-PCR 引物列于 表 1 中。实际上，如 图 3 所示，约 80% 的甲基化 IVT 在 IP 样本中被回收，而在阴性对照样本中仅回收约 2%。对于非甲基化对照，IP 和阴性对照样本中的回收率均低于 1%。这验证了 MeRIP 实验的有效性，表明甲基化的 RNA 片段已被成功沉淀并富集，也说明样本适用于后续分析。此外，非甲基化 IVT 的富集倍数（IP 与 Mock 的比值）可作为阈值，用于评估 qRT-PCR 实验中富集效应的显著性。
将测序读段比对到基因组后（图4），应用步骤3.4.1和3.4.2中描述的峰识别算法，以鉴定在免疫沉淀样本中相对于Input样本显著富集的统计学显著性窗口。这些窗口对应的序列可进一步用于分析，例如搜索保守的与甲基化相关的基序11,17。
<img alt="加入外源性对照RNA、磁珠、消化及qRT-PCR示意图的RNA提取流程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：MeRIP-seq实验流程示意图。 
RNA样本与5-甲基胞嘧啶抗体孵育，然后使用蛋白G磁珠捕获抗体及其结合的RNA复合物。洗脱后的RNA样本通过高通量测序和qRT-PCR进行分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="RNA质量分析，电泳图谱，RNA浓度，RIN值，示意图，实验结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：RNA样品质量分析的代表性结果。 
(A) 合格的植物总RNA样品的代表性图谱。(B) RNA样品经超声处理断裂为约100个核苷酸片段后的代表性图谱。数据由毛细管电泳软件生成的输出文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="甲基化IVT与非甲基化IVT中输入回收率（%）的柱状图；基因表达分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：对照IVT的qRT-PCR分析。 
甲基化和非甲基化的体外转录本（IVT）分别作为MeRIP实验的阳性和阴性对照。免疫沉淀后，甲基化IVT在IP样本（绿色）中显著富集，而在Mock样本（未加抗m5C抗体，紫色）中无富集。非甲基化IVT在IP与Mock样本之间均无富集现象，且无差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="染色质免疫沉淀示意图；DNA测序峰；基因序列分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61231/61231fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：在代表性转录本周围进行MeRIP前后测序读段的比对情况。 
测序读段比对至Input样本（第一行）以及两个IP重复样本（中间和第三行）中的特定转录本。黑色框标示基于MACS243 和MeRIP-seq22 峰识别分析鉴定出的一个富集区域，长度为50 nt。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/61231fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>靶标</td>
			<td colspan="2">引物对</td>
			<td colspan="2">产物序列</td>
			<td>产物长度</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">EGFP</td>
			<td colspan="2">正向引物: 5'- GGCAACTACAAGACCCGCGCC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGCAACTACAAGACCCGCGCCGAG 
			GTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTG 
			GTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGC</td>
			<td rowspan="2">72 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">反向引物: 5'- GCCCTTCAGCTCGATGCGGTT -3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Renilla luciferase</td>
			<td colspan="2">正向引物: 5'- GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAAC -3'</td>
			<td colspan="2" rowspan="2">GGAGAATAACTTCTTCGTGGAAACC 
			ATGTTGCCATCAAAAATCATGAGAA 
			AGTTAGAACCAGAAGAATTTGCAGC</td>
			<td rowspan="2">75 bp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">反向引物: 5'- GCTGCAAATTCTTCTGGTTCTAA -3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：qRT-PCR分析所用引物及扩增产物信息。
缓冲液配方。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61231/Buffer%20Recipes%20MeRIP.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

甲基化RNA免疫沉淀实验是一种基于抗体的方法，用于富集甲基化的RNA片段。结合深度测序技术，可鉴定携带m5C修饰的转录本。

用于研究拟南芥中 m5C 修饰的甲基化 RNA 免疫沉淀实验

RNA上的二级碱基修饰（如m5C）会影响修饰后RNA分子的结构与功能。甲基化RNA免疫沉淀及……

甲基化RNA免疫沉淀，也称为MeRIP，是一种用于鉴定整个转录组中甲基化基团的方法。该方法可适用于多种模式生物的RNA提取物。此技术操作简便，无需任何剧烈的化学处理，只要具备特异性抗体，即可用于绘制任何RNA修饰的图谱。为了提取RNA样品，首先将200毫克目标植物组织样品在液氮中研磨成粉末，注意在整个操作过程中保持组织始终处于冷冻状态。接着，向研磨好的植物组织中加入1毫升含有硫氰酸胍和酸性苯酚的RNA提取试剂，通过倒置充分混匀，确保所有组织均被浸湿。室温静置10分钟后，离心样品并将上清液转移至新的1.5毫升离心管中。向上清液中加入 200 微升 1-溴-3-氯丙烷，并剧烈涡旋混匀样品。通过离心分离各相，然后将约 500 微升上层水相转移至新的 1.5 毫升离心管中。向样品中加入 500 微升异丙醇和 50 微升 3 摩尔醋酸钠溶液，颠倒混匀。将样品在 -20 摄氏度孵育 10 分钟，然后通过离心沉淀 RNA。弃去上清液后，用 500 µL 的 80% 乙醇洗涤沉淀物两次，再用 500 µL 的 99% 乙醇洗涤一次。最后一次洗涤后，将沉淀物干燥 5 至 10 分钟，然后溶解于 30 µL 无 RNase 的水中。使用分光光度计测定RNA浓度，并将20微克RNA样品在DNase水和缓冲液中进行消化。在37摄氏度孵育30分钟后，加入适量的DNase失活试剂以去除酶活性，并根据标准操作流程通过毛细管电泳检测所分离RNA的质量和纯度。若经DNase消化后的样品RNA完整性数值（RIN）高于7，则向新离心管中加入至少12微克的每份RNA样品。在每3微克RNA样本中加入0.1纳克先前制备的体外转录本（一种甲基化，一种非甲基化），并用无RNase的水将每管终体积调至80微升。随后，将各RNA样本的全部体积分别置于超声处理管中进行超声处理，并通过毛细管电泳确认超声处理的效率及RNA样本的浓度。片段化RNA的平均长度应约为100个核苷酸。进行甲基化RNA免疫沉淀时，将每种超声处理后的RNA样品各九微克加入新的单独低吸附离心管中，并加入RNase-free水至总体积达60微升，随后将RNA样品置于70摄氏度水浴中加热10分钟。孵育结束后，将样品在冰水浴中冷却10分钟，然后从每种样品中转移20微升至新的低吸附离心管中，于-80摄氏度保存作为输入样品。向每种样品剩余的40微升中加入RNase-free水，使最终体积达到860微升，并将每份样品均分至两个低吸附离心管中：一份用于免疫沉淀，另一份作为模拟对照样品。向每个样品中加入 50 微升 10X MeRIP 缓冲液和 10 微升 RNase 抑制剂。接下来，向免疫沉淀管中加入 10 微升抗 M5C 抗体，向对照管中加入 10 微升水。用封口膜密封各管，并在 4 摄氏度下以旋转摇床孵育 12 至 14 小时。第二天早晨，每个样本取一个15毫升离心管，加入40微升磁珠。每个样本用800微升MeRIP缓冲液进行三次洗涤，每次洗涤5分钟，并在旋转仪上轻轻旋转混匀；每次洗涤后将离心管置于磁力架上收集磁珠，弃去上清缓冲液。第三次洗涤后，将磁珠重悬于每个样本40微升新鲜的MeRIP缓冲液中，然后向每个免疫沉淀和阴性对照样本管中各加入40微升重悬的磁珠，在4摄氏度下旋转孵育2小时。孵育结束后，将离心管置于磁力架上静置1分钟，然后小心弃去上清液，注意不要扰动磁珠。用700 µL MeRIP缓冲液（含0.01% Tween-20）在室温下以旋转混合方式洗涤磁珠5次，每次洗涤10分钟。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于200 µL蛋白酶K消化缓冲液中，并加入3.5 µL蛋白酶K，在50 °C下以800 ×g振荡孵育3小时。孵育结束后，使用800微升RNA提取试剂，按照所示的酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取法提取RNA。提取完成后，将获得的RNA沉淀恰好重悬于20微升无RNase的水中。本图展示了一个优质RNA样本的代表性电泳结果。在超声处理后的同一样品中，可观察到一个向左偏移、大小约为100个核苷酸的均一峰。浓度降低的原因既包括片段化过程中RNA的损失，也包括样品体积的增加。免疫沉淀样品和阴性对照样品的质量可通过定量反转录PCR进行评估。在此代表性分析中，约 80% 的体外甲基化转录本在免疫沉淀样品中被回收，而模拟样品中仅回收了约 2%。对于非甲基化对照，在免疫沉淀样品和模拟样品中的回收率均低于 1%。在深度测序并将读段比对至基因组后，可应用峰识别算法来鉴定与输入样品相比在免疫沉淀样品中显著富集的统计学显著区域。利用测序数据，我们可以确定RNA甲基化最常发生的基序，该基序可作为诱饵来富集特异性结合蛋白。

methylated-rna-immunoprecipitation-assay-to-study-m5c-modification

Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

甲基化RNA免疫沉淀分析研究m5C在阿拉伯的修改

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拟南芥 胚乳中印记基因DNA甲基化的测定

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了解甲基化RNA免疫沉淀分析（MeRIP）技术，用于在拟南芥中研究m⁵C修饰。该方法结合深度测序，可有效富集甲基化RNA片段并鉴定转录本修饰位点。

用于研究拟南芥中 m⁵C 修饰的甲基化 RNA 免疫沉淀实验

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