Name: 使用 24 个井组织培养板 （EAgaL 板） 改进 了伊蚊 的丰度和生育率测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 了解使用24孔组织培养板（EAgaL板）快速评估伊蚊繁殖力的方法。该技术可显著减少时间、空间和人力成本，适用于个体水平的产卵量与孵化率测定，为媒介生物学研究提供高效工具。

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我们感谢德克萨斯A&M大学&amp;感谢#38;M 农业生命研究昆虫传播疾病资助计划的经费支持。我们还感谢Adelman实验室成员在本方法开发及论文撰写过程中提供的帮助和建议，以及Kevin Myles实验室成员的支持。同时，我们感谢审稿人和编辑为提升本文质量所提供的帮助。

1. 培养板制备
<ol>
	<li>在24孔组织培养板盖子上钻孔（每孔4−6个孔），使用家用钻孔机和直径约1.6 mm（1/16英寸）的钻头图2). 
	注意：这些孔可防止琼脂糖产生的冷凝水积聚在盖子上，避免蚊子在其中产卵。雌性成虫的标准尺寸 埃及伊蚊 (&#34;利物浦&#34; 品系）的翅展约为3.11 mm。当使用体型较小的蚊子时，建议减小孔径，以避免蚊子从孔板中逃逸。</li>
	<li>在产卵实验前一天，将培养皿彻底清洗并用蒸馏水冲洗，然后在室温下浸泡于1−5%的次氯酸钠溶液中30−60分钟。随后在流动的去离子水中充分冲洗，并将其干燥。 
	注意：此步骤可降低真菌和细菌在琼脂糖上生长的可能性。</li>
	<li>在去离子水中配制2%琼脂糖溶液并加热融化，随后立即使用1,000 μL移液器将500 μL熔融琼脂糖加入24孔板的每个孔中（图3A,B当琼脂糖开始冷却并堵塞移液器吸头时，重新加热琼脂糖并更换新的移液器吸头。 
	注意：避免移液器吸头接触孔壁，因为这可能会在孔壁上留下琼脂糖碎片，导致雌性果蝇在该处产卵，从而干扰成像和计数过程。</li>
	<li>使用前，将孔板置于实验台面上过夜，使孔壁上的冷凝水干燥。图3C,D). 
	注意：从血液饲喂到幼虫成像，EAgaL平板实验的时间线如图所示 图4，用于菌落蚊虫（埃及伊蚊 “Liverpool”品系在昆虫饲养室条件下饲养，光照周期为14小时光照：10小时黑暗，温度27 °C，相对湿度80%，每只49.5 cm × 29.2 cm × 9.5 cm的托盘中加入2 L水，饲养500只幼虫。建议各实验室在使用EAgaL板时，针对所用蚊虫进行测试，尤其是在使用不同品系、不同蚊种或不同饲养方案时。</li>
</ol>
2. 蚊虫饲喂
注意：所有处理组和对照组必须使用在相同条件下饲养的蚊子，因为幼虫期的营养状况会影响蚊子的适合度参数10,11。幼虫饲养时应保证空间宽松并提供充足食物。雌蚊羽化时需与雄蚊共处，以确保交配成功，并使其成熟至少3天。
<ol>
	<li>在血液喂养前至少16小时，移除雌性蚊虫的所有水源和/或糖源，以增强其吸血行为。</li>
	<li>将人工喂养用的水循环装置预热至37 °C，并使用含有脊椎动物血液的人工喂食器对雌性蚊虫喂血15−30分钟（图5A）。</li>
	<li>用CO2或冰对蚊虫进行麻醉，将其转移至置于冰上的玻璃培养皿中，挑选出已吸饱血液的个体（图5B），放入容器中，并提供30%蔗糖水饲养超过72小时，直至雌虫完成排泄和卵子发育。 
	注意：若雌虫所饲喂的蔗糖水浓度较低，应在48小时后移除蔗糖水及任何湿润表面，以防雌虫产卵。</li>
</ol>
3. 产卵
<ol>
	<li>在将蚊子转移至孔板前约1小时，使用移液管向每个孔板孔中加入2−3滴（约80−120 μL）水。</li>
	<li>在血液饲喂后至少72小时，用CO2或冰块使蚊子麻醉，将其转移至置于冰上的玻璃培养皿中，并将每只蚊子单独放置在置于冰上的24孔板倒置的盖子上（图6A）。 
	注意：本步骤参考自Ioshino等人的方法9。</li>
	<li>当所有24只蚊子均放置完毕后，用一个倒置的孔板底座盖住盖子，用一条全新的橡胶圈固定盖子与底座，并将其放入环境培养箱（或饲养室）中（图6B），直至蚊子恢复活动（约10−15分钟），然后将孔板正置（图6C）（图6D）。</li>
	<li>让雌蚊产卵24−48小时，随后将雌蚊从孔板中释放至大型笼中以移除。 
	注意：若需追踪个体雌蚊，可通过冷却孔板使其麻醉，并在冰上逐个移除。若在血液饲喂后不足72小时即转移雌蚊至孔板，将观察到产卵延迟以及深色排泄物干扰卵计数的现象（图7D）。</li>
</ol>
4. 卵计数
<ol>
	<li>检查24孔板的每个孔，因为有时蚊子会将卵产在孔壁以及琼脂糖/塑料表面的边缘处，这些位置的卵在照片中难以分辨。使用湿润的画笔将产在孔壁和琼脂糖边缘的卵转移至琼脂糖的平坦表面，使所有卵处于同一平面上且互不重叠。 
	注意：由于琼脂糖溶液的表面张力，琼脂糖的边缘通常位于相机焦平面之外。</li>
	<li>使用镊子移除孔中可能干扰卵成像的断腿、断翅及其他颗粒物图7C).</li>
	<li>将白纸置于培养皿下方，以增强深色蚊卵在体视显微镜照明成像前的对比度图7A).</li>
	<li>使用小型数码相机的显微模式拍摄每孔的图像，该模式可使用户聚焦于近至1 cm的物体。此功能允许将相机直接放置在培养板上拍摄卵子图像，无需使用三脚架或支架。图7A）。为了区分成团产下的单个卵，应使用精细或超精细模式拍摄高分辨率图像，以便观察近距离的细节。 
	注意：使用前请清空相机存储卡，以避免新旧图像混淆。</li>
	<li>拍摄完每孔后，对整块板进行成像，并附上带有成像顺序标签的图像，以便后续区分每块板图7E).</li>
	<li>用移液管向每个孔中加入约5滴水（约200 μL）形成一层薄水层，以防止琼脂糖凝胶塞和卵干燥，并促进胚胎发育和孵化。在最初几小时内需注意观察水位，并每天检查，因为琼脂糖可能吸水或水分可能发生蒸发而导致水位下降。当水位过低影响幼虫孵化时，应及时补充水分。 
	注意：水分蒸发在单个培养板内以及多层叠放的培养板之间均不均匀。观察发现干燥顺序如下：1）角上的孔（A1、A6、D1、D6）干燥最快；其次为 2）位于板外缘的孔（A2–A5、B1、B6、C1、C6、D2–D5）；最后为 3）内部的孔。当培养板叠放时，最上层的板干燥最快。</li>
	<li>将图像转移至装有 ImageJ（Fiji）的计算机，并将文件重命名为更易于管理的格式，例如“[plate ID]_[well ID].jpg”图8A,B).</li>
	<li>创建一个电子表格文件，用于记录卵的数量（即繁殖力）和幼虫数量，并计算孵化率（即受精率）图9E).</li>
	<li>使用 ImageJ（Fiji）打开图像12 并使用“多点” 工具标记每个卵（图9A−C）；使用“+” 或 “–”用于计数卵子的关键&#160;团块。标记完所有卵后，双击 多点图标 以增加标记的数量（图9D）。将结果记录在电子表格中。</li>
</ol>
5. 生育力评估
注意：2天后，一龄幼虫可能开始从孔中孵化。为确保所有可存活的卵均已孵化，需再等待3−5天后再进行成像或计数。
<ol>
	<li>通过将 1/16 茶匙（约 168 mg）的鱼饲料粉（即蚊幼虫常规食物）与 20 mL 水混合，并静置至大颗粒沉淀，制备幼虫食物（图 10A−D）。一旦幼虫孵化出现，立即向含有幼虫的孔中加入食物（上清液），因为幼虫在无食物条件下存活时间很短。 
	注意：添加过多食物颗粒可能干扰幼虫成像和计数。</li>
	<li>在向孔中加水后约 5–8 天，用碎冰覆盖培养板 15−20 分钟，使培养板冷却以麻醉幼虫。</li>
	<li>保持培养板置于冰上，对每一孔进行成像，操作方式与对卵成像时相同。为获得幼虫图像，可在培养板下方插入黑色材料以提供深色背景，增强对比度。拍摄完每块板的所有孔后，再对整块板拍摄一张包含成像顺序标签的图像，以便后续区分各培养板。 
	注意：成像时保持培养板在冰上，因为幼虫活动可能影响计数准确性。培养板可重复使用；使用后将蚊虫和琼脂糖冷冻并清除，以便下次使用。EAgaL 板不适合用于将幼虫培养至较晚期阶段。</li>
	<li>使用 ImageJ（Fiji）软件打开图像，并利用“多点”工具通过点击每个幼虫进行计数。在 3−5 天期间，部分幼虫可能已蜕皮，尤其是在幼虫数量较少的孔中。因此，计数时应排除蜕下的表皮（即蜕壳），这些结构外观类似仅有头部并带少量身体的幼虫，或呈皱缩状的幼虫（图 10E）。将结果记录在电子表格中。</li>
</ol>
6. 执行分析
<ol>
	<li>在收集完用于繁殖力和生育力分析的全部必要数据后，使用偏好的软件进行适当的统计分析并绘制图表。</li>
</ol>

<ol><li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li>
<li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+%28Cinnamosma+sp.%29+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373(2019).</li>
<li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+transgenesis%3A+what+is+the+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li>
<li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217(2019).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement%2C+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP%2FZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviplate%3A+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103(2018).</li>
<li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mosquitoes%2C+large+implications%3A+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites & Vectors. 8, 252(2015).</li>
<li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+vector+arthropod+culture%3A+an+example+using+the+African+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
</ol>

作者声明本研究无任何利益冲突。

EAgaL 平板极大地减少了进行个体繁殖力和生育力测定所需的人力、时间和空间 伊蚊 aegypti 与FT方法相比，FT方法与EAgaL板的初步比较结果显示，所有步骤的时间均更短（成像技术已应用于FT方法）表1）。作为参考，可估算启动和&#160;每次检测（一块24孔EAgaL板对比24个FTs）的成本如下所示 表 2.
使用EAgaL板时需考虑几个要点。最初人们担心将蚊子置于如此狭小的空间内，可能因活动受限而无法产下全部卵。为了验证是否存在这种情况，在蚊子于EAgaL板中放置48小时后，将其集体转移到一个更大的笼子中，并提供一个内衬浸水滤纸的产卵杯，继续产卵48小时。结果表明，蚊子确实会继续产卵，但每只雌蚊平均仅额外产下2.1枚卵，这一数量在大多数（即使不是全部）情况下不会对任何统计分析结果产生显著影响。这些数据来自超过500只蚊子的测试（数据未显示）。然而，该结论可能仅适用于在所述条件下培养的埃及伊蚊（Ae. aegypti）“利物浦”品系。各个实验室可能需...

控制蚊虫以保护人类免受虫媒病原体感染是一项重要的公共卫生目标，这主要归因于目前针对蚊媒携带的大多数病原体尚无有效的疫苗。许多研究致力于降低蚊虫适应性，并结合可在野外应用的种群控制策略以减少蚊虫数量。1,2,3这包括创建转基因蚊子和/或CRISPR/Cas9基因敲除品系的大量研究。此类种群改造策略需要对个体适合度参数进行详细评估。4评估雌蚊适应性的常规实验室技术包括将交配后并吸血的雌蚊个体分别置于100 mL容器中饲养5，经改造的50 mL锥形管，或试管 果蝇 通过使用湿润的棉絮和滤纸片提供潮湿表面，以改良饲养条件，供产卵（即卵纸）使用1,2,6,7. 这类方法需要相对较大的空间（例如，最多可容纳100个时为30 cm × 30 cm × 10 cm：宽 × 长 × 高） 果蝇 管) (图1），以及对单个产卵纸进行操作以计数卵和孵化幼虫，这些步骤可能非常耗时费力。本文提供了一种利用24孔板和琼脂糖作为产卵基质来计数蚊卵并测定孵化率的方法，以克服上述问题8.
同时，Ioshino 等人9描述了一种使用12孔板和24孔板对单只雌虫所产卵进行计数的详细方法。该方案相较于传统方法在节省时间和空间方面具有显著改进9。然而，他们所描述的方案仍采用湿润的滤纸作为产卵表面，这需要逐张展开滤纸才能进行计数，因为卵通常位于滤纸下方或褶皱中。此外，该方案未包含成像技术的应用，也未提供幼虫计数的方法。
本文介绍了一种改进的埃及伊蚊（Ae. aegypti）产卵数（即繁殖力）和孵化率（即生育力）适合度测定方法，该方法采用琼脂糖作为产卵基质，并在24孔组织培养板中进行，适用于在湿润表面产卵的蚊虫。这些培养板被命名为“EAgaL”板，名称来源于Egg（卵）、Agarose（琼脂糖）和Larva（幼虫）。这种24孔板为每只蚊子提供了最小化的产卵面积，从而简化并极大减少了计数以及维持卵和孵化后数天内幼虫所需的时间与工作量。EAgaL板使用半透明的琼脂糖作为产卵表面，避免了传统方法中需操作产卵纸以及寻找卵和孵化后幼虫的步骤；通过对每个孔进行拍照，可建立实验结果的长期存档记录，并将计数过程在时间和空间上与饲养/操作过程分离，解决了实验操作时间紧张的问题。

<table><tbody><tr><td>1.6 mm &amp;Phi; 钻头</td><td></td><td></td><td>也可使用加热的金属钉</td></tr><tr><td>1000 &amp;mu;L型移液器吸头（长）</td><td>奥林巴斯塑料制品</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>930186</td><td>透明平底带环形盖板</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>紧凑型数码相机</td><td>Olympus</td><td>TG-5/TG-6</td><td></td></tr><tr><td>计算机（Windows、Mac 或 Linux）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji（ImageJ）软件</td><td></td><td></td><td>下载地址：https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Dumont</td><td></td><td>锐利的镊子可能会破坏蚊虫的躯体</td></tr><tr><td>玻璃培养皿</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>家用漂白剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>家用电动钻孔机</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜照明灯（鹅颈管）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 移液器</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>橡皮筋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD卡</td><td></td><td></td><td>使用数码相机拍摄图像（建议使用 DSHC、SDXC 格式）</td></tr><tr><td>电子表格软件（Microsoft Excel）</td><td>微软</td><td></td><td>任何电子表格软件均可使用</td></tr><tr><td>TetraMin 鱼饲料</td><td>四面体</td><td></td><td>使用咖啡研磨机、搅拌机或研钵研磨 &amp;研钵和研杵</td></tr><tr><td>移液管</td><td>VWR</td><td>16011-188</td><td></td></tr></tbody></table>

改良的生殖力与生育力检测方法 埃及伊蚊 使用24孔组织培养板（eagal板）

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

蚊子作为多种病原体的传播媒介，对公共卫生构成重大威胁。在需要评估蚊子适合度参数（特别是个体水平的产卵量和孵化率）的研究中，传统方法由于劳动强度高且需要大量实验室空间，给研究人员带来了巨大负担。本文介绍一种简便的方法，利用每个孔中含琼脂糖的24孔细胞培养板，结合对每个孔的数字成像，以在个体水平上测定产卵数和孵化率，显著减少了所需的时间和空间。

通过显微注射将靶向候选铁转运蛋白（FeT）或对照基因（EGFP）的dsRNA注入蚊子体内，随后提供血液饲喂，并采用上述步骤所述的EAgaL板法测定其繁殖力和生育力输出。
注射dsRNA后FeT表达被沉默的蚊虫，其产卵数量和孵化率均显著降低（图11A−C）。所有对照组和处理组蚊虫在吸血后72小时被放置于EAgaL板中。FeT沉默的蚊虫还表现出排泄延迟，以及卵体积较小、颜色较浅（图12A，B）。相关示例结果亦见于Tsujimoto等人的研究8。
<img alt="果蝇采集装置；带泡沫塞的列管；遗传学研究的实验装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61232/61232fig01.jp...

本文介绍了一种节省时间和空间的方法，利用24孔组织培养板对单只蚊虫的产卵量和孵化率进行计数，该方法可显著提高繁殖力和生育力检测的规模和速度。

改良的生殖力与生育力检测方法 埃及伊蚊 使用24孔组织培养板（EAgaL板）

蚊虫作为多种病原体的传播媒介，对公共卫生构成重大威胁。对于需要评估蚊虫适应性的研究……

该实验步骤使蚊虫研究人员能够轻松评估单只蚊虫的繁殖适应性。与传统方法相比，本方案显著减少了在个体水平上检测蚊虫产卵量和生育力所需的时间、空间和人力。首先准备产卵实验用的培养皿。使用家用钻孔机和1.6毫米钻头，在24孔培养板的盖子上每孔钻4至6个孔。实验前一天，用1%至5%的漂白剂在室温下清洗并浸泡培养板30至60分钟。随后，在流动的去离子水中彻底冲洗培养板，并将其晾干。将2%琼脂糖溶于去离子水中，立即取500微升熔融琼脂糖加入24孔板的每个孔中。将培养板置于实验台上过夜，以蒸发掉任何冷凝水。在血液喂养前至少16小时，移除雌性蚊子的所有水源和糖源。在喂食当天，将水浴循环仪加热至37摄氏度，使用人工饲喂器为蚊子提供脊椎动物血液，饲喂15至30分钟。随后，将蚊子转移至置于冰上的玻璃培养皿中。挑选吸血饱满的个体，放入含有30%蔗糖水的容器中。让雌蚊至少有 72 小时完成排泄和卵子发育。在将蚊子转移到 24 孔板前约一小时，使用移液管向每个孔中加入两到三滴水。用二氧化碳击倒蚊子，然后将其转移到置于冰上的玻璃培养皿中。然后，将每只蚊子单独放置在24孔板的倒置盖子上。待全部24只蚊子放置完毕后，用一个倒置的板底盖住盖子，用一条全新的橡皮筋固定，并将其放入环境培养箱中，直至蚊子恢复活动。随后，将板子翻转至正面朝上。让雌蚊产卵 24 至 48 小时。然后将雌蚊从培养板中释放到大型饲养笼中以去除。在计数卵之前，需检查每个孔的孔壁以及琼脂糖与塑料表面交界边缘处是否有卵，这些位置的卵在照片中难以分辨。使用湿润的画笔将这些卵转移到平面上，使所有卵处于同一均匀平面且互不重叠。用镊子移除孔中可能干扰卵成像的断裂的腿、翅膀及其他颗粒。将紧凑型数码相机设置为显微镜模式，该模式允许用户对距离仅一厘米的物体进行聚焦，并拍摄每个孔的图像。拍摄完每孔板的每个孔后，再拍摄整块板的图像。使用成像顺序标签以便后续区分每块板。向每个孔中加入约五滴水，以防止琼脂糖塞和卵干燥，并促进胚胎发育和孵化。将图像转移至计算机，并使用培养板和孔的编号重命名文件，以便于管理。使用 ImageJ 打开图像，利用多点工具标记每个卵，通过放大或缩小来计数卵团。标记完所有卵后，双击多点工具图标以显示标记数量，并将结果记录在电子表格中。一旦孵化的幼虫出现，立即开始向含有幼虫的孔中添加食物。大约五到八天后，将碎冰覆盖在培养板上15至20分钟，以麻醉幼虫。在培养板下方插入黑色材料以增强对比度，并在保持培养板处于冰上的同时，拍摄每个孔的图像。拍摄每个孔后，用成像顺序标签拍摄整块板的图像。使用 ImageJ 打开图像，并利用多点工具计数幼虫。幼虫的形态、角度和焦距可能各不相同。排除蜕下的角质层，它们看起来像是仅有头部并带有一点身体的幼虫，或萎缩的幼虫。将结果记录在电子表格中。通过注射针对候选铁转运蛋白 FeT 或对照基因 EGFP 的双链

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Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

使用 24 个井组织培养板 （EAgaL 板） 改进 了伊蚊 的丰度和生育率测定

一旦某个基因被鉴定为可能对登革热病毒具有抗性，就必须评估其在蚊子体内预防病毒感染的作用。本实验方案展示了如何检测蚊子中登革热病毒感染的程度。文中演示了病毒在细胞培养中扩增、通过膜饲法使蚊子吸食人血以及检测蚊子中肠内病毒滴度的技术。...

埃及伊蚊（A. aegypti）登革病毒感染实验方案及感染表型测定

本实验方案提供了克隆细胞系筛选及钙依赖性生物发光检测的方法，用于分析合成节肢动物神经肽与其同源G蛋白偶联受体之间的构效关系。该检测方法可用于受体去孤儿化研究，以及合成类似物设计和肽类/药物先导物发现中的构效关系研究。...

一种用于蚊子（Aedes aegypti）和蜱虫（Rhipicephalus microplus）G蛋白偶联受体功能分析的钙离子生物发光检测法

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大规模生产用于巴西野外释放的基因改造埃及伊蚊（Aedes aegypti）

卵在虫体内（EIW）检测是一种用于量化产卵行为的有效方法。产卵行为的改变可能是模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

使用产卵滞留实验测量细菌对C. Elegans行为的影响

Aedes aegypti 蚊子感染 Wolbachia 后被释放到自然种群中，以抑制节肢动物传播病毒的传播。本文描述了在实验室中培育携带 Wolbachia 感染的 Ae. aegypti...

维持感染 Wolbachia 的 Aedes aegypti 蚊子

一种培养微孢子虫寄生虫Edhazardia aedis的实验方案。该寄生虫通过幼虫阶段的水平传播和成虫阶段的垂直传播，从一代埃及伊蚊（Aedes...

Edhazardia aedis 微孢子虫寄生虫在中国台湾伊蚊（Aedes aegypti）中的传播

昆虫不育技术（SIT）用于控制对化学防治可能具有抗性的特定重要医学蚊虫种群。本文介绍了一种大规模饲养和制备不育雄性蚊虫的方法，以供在针对埃及伊蚊（Aedes...

准备用于绝育昆虫技术项目释放的辐射处理并标记的雄性Aedes aegypti蚊虫

肠道微生物可能对宿主的健康产生正面或负面的影响 通过 特异性或保守性机制 秀丽隐杆线虫 是一种用于筛选此类微生物的便捷平台。本实验方案描述了对48种细菌分离株进行高通量筛选，以评估其对线虫应激抗性的影响，该指标被用作线虫健康状况的替代参数。...

高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康

本文介绍了一种利用模式生物 C. elegans...

测量胚胎活力与子代数量 秀丽隐杆线虫

本实验方案描述了如何测量埃及伊蚊（Aedes...

量化转基因中的适合度代价 埃及伊蚊 蚊子

本研究介绍了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis...

简单且易于操作的卵孵化检测方法 秀丽隐杆线虫可变格式的药物筛选

了解使用24孔组织培养板（EAgaL板）快速评估伊蚊繁殖力的方法。该技术可显著减少时间、空间和人力成本，适用于个体水平的产卵量与孵化率测定，为媒介生物学研究提供高效工具。

改良的生殖力与生育力检测方法埃及伊蚊使用24孔组织培养板（EAgaL板）

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改良的生殖力与生育力检测方法 埃及伊蚊 使用24孔组织培养板（EAgaL板）

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