活体纵向成像与定量分析人胰岛移植物及前房眼内微环境宿主细胞的贡献

ACE 是一种理想的成像窗口，支持长期重复进行活体胰岛细胞成像，以研究移植情况下胰岛细胞的功能和存活能力。它还可扩展用于实时研究生理和病理条件下的其他方面。

ACE 技术的优势在于，能够以亚细胞分辨率对同一个体的人胰岛进行长时间的无创追踪观察。β细胞替代疗法的成功率正在不断提高，然而，评估胰岛移植后的体内存活效率仍然具有挑战性。

该方法有助于评估和优化胰岛移植的效果。该方法不仅限于胰岛，也适用于研究受影响的组织。

例如，在糖尿病并发症中，如肾小球或肝组织等，仅举几例。开始时，将小鼠置于温暖的加热垫上，固定在头部固定装置中，并戴上鼻罩。用拇指和食指轻轻抬起头部。

用两侧的金属部件固定，确保耳杆将头部固定在耳朵正下方。将丁丙诺啡溶液皮下注射至小鼠背部。

使用钝头镊子轻轻牵拉待移植眼睛的眼睑。将眼球推出，并用一对包裹聚乙烯管的镊子松散固定。将眼睑转移至含有PBS的培养皿后，从眼囊管中拾取约20至30个胰岛。

使用25号针头，针尖向上，小心地插入角膜并做一次侧向切口。用预装有胰岛的套管针轻轻抬起角膜，缓慢将胰岛释放入眼内。缓慢撤出套管针，并在眼部涂抹眼用凝胶。

10分钟后，取下镊子，松开眼睑，并将眼球复位至正常位置。若需使用双光子显微镜对移植的人胰岛进行成像，请将头部固定平台置于显微镜下，并在眼球表面滴加眼用凝胶，作为角膜与物镜之间的浸没液。将眼球置于物镜下，按照文本稿件中的描述对移植的人胰岛进行成像。

为了消除自发荧光，请转到图像处理选项卡，选择通道运算，并输入通道一减去通道二。这将创建一个新的通道四。将其重命名为血管结构。

重复此过程，输入通道三减去通道二以创建新的通道五，并将其重命名为 tomato all。要手动定义胰岛，请创建新的表面，并在向导中选择手动编辑。将指针保持在选择模式，并处于 3D 视图中。

然后点击体积以可视化切片。在绘图选项卡中选择轮廓，点击“绘制”以开始在胰岛边界的周围绘制轮廓，从第一层切片位置开始。接着移动到新的切片位置，并重复绘制轮廓。

以胰岛顶部的最后一层切片结束，并点击“创建表面”标签完成操作。下一个步骤为使用胰岛掩模分析胰岛血管系统及胰岛番茄荧光。选择先前定义的胰岛掩模对象，进入编辑标签页，点击“全部掩模”标签，此时将打开一个新窗口。

在通道选择下拉菜单中选择血管通道，并启用“应用掩膜前复制通道”选项。内部和外部设为常量，并将表面外部的体素设为 0.000，从而创建新通道六。将此通道重命名为胰岛血管系统。

重复之前的步骤，在通道选择下拉菜单中选择番茄（tomato）通道，以创建新通道，并将其重命名为“islet tomato”。然后在场景菜单中创建一个新的表面（surface），并在向导中选择自动创建。将源通道设置为先前创建的 islet vasculature，并选择背景扣除（background subtraction）。

可选择使用滤镜。例如，选择体积并调整窗口中的滤镜，以移除选定的服务对象。完成向导操作，并将新的表面对象命名为胰岛血管系统。

在胰岛血管系统服务对象中，转到编辑选项卡并点击“掩膜全部”选项卡，这将打开一个新窗口。在通道选择下拉菜单中选择胰岛番茄通道，并将表面外的体素设置为 10.000，从而创建一个新通道。将此通道重命名为胰岛番茄血管系统。

为了分割番茄囊膜的荧光信号，请在图像处理选项卡中选择通道算术功能，并输入第七通道减去第八通道以创建新通道。将其重命名为“番茄囊膜”。按照之前所述方法创建新的表面，在向导中选择源通道为“胰岛番茄脉管系统”或“番茄囊膜”。

然后进行背景扣除。打开胰岛背向散射文件并创建一个新的表面。在向导中选择自动创建，并定义感兴趣区域。

如有需要，可调整绝对强度的阈值。可点击开启或关闭表面对象，以与相应通道的强度进行交叉核对。完成操作后，关闭向导。

最后，进行定量分析：在场景菜单中选择一个已创建的表面对象，然后进入统计选项卡。要获取详细的体积数据，请选择详细选项卡，并从下拉菜单中选取特定值和体积。要获取总体积值，请进入详细选项卡并选择平均值。

本方案用于将未标记的人胰岛移植到八周龄雌性红色荧光受体小鼠的眼内腔。随后使用交互式成像软件从图像中提取定量数据。在活体荧光成像中，人胰岛移植物受到组织自发荧光的严重干扰，而小鼠胰岛移植物则未观察到此现象。

为了提高信噪比，去除了自发荧光通道。然后手动定义胰岛边界（称为胰岛掩膜）及相应的通道。最后，通过将番茄信号分割为眼睑血管和眼睑囊，并进行最终的表面渲染，以提取定量数据。

以下为同一人源胰岛移植物在移植后两周、两个月、五个月和八个月时的代表性纵向成像过程。图中展示了原始记录数据的最大强度投影（MIP）图像、去除胰岛自发荧光后的处理图像以及分割出的胰岛结构。进行眼睑注射时，务必先将胰岛预装于小体积溶液中，并在体视显微镜上使用灵活的双光源臂，以清晰显示眼前房空间，从而成功将胰岛注入眼前房（ACE）。

在进行活体成像后，可将眼睛固定，进一步进行抗体染色和常规组织学分析。该技术对于在生理条件下实时研究单个人胰岛的功能非常有用，特别是在血管化、存活率和代谢研究方面。