并行高通量单分子动力学分析用于位点特异性DNA切割

该方案可应用于任何导致双链DNA断裂并产生详细定量动力学数据的过程。尽管该方法具有单分子分辨率，但一次实验可检测多达1000条DNA分子，从而提供良好的统计学结果。该方法的主要应用是研究DNA结合与修饰过程中涉及的机制。

例如，我们感兴趣的是研究与所有DNA结合蛋白相关的DNA靶标搜寻过程。初次尝试该技术时，请记住单分子拴系结构较为脆弱，一旦形成就必须小心处理。功能化表面的适当比例至关重要。

要实现顺畅的操作流程，有一些技巧可供参考。除了在数据采集过程中更换样品管外，直观的演示也有助于初次操作此步骤的人员掌握要领。清洗盖玻片时，将其放入染色缸中，并用乙醇超声处理30分钟。

用去离子蒸馏水彻底冲洗，然后将其浸入1摩尔的氢氧化钾中，超声处理30分钟。重复洗涤步骤，每次洗涤后务必用水冲洗盖玻片。将清洗干净的盖玻片保存在盛有水的染色缸中。

使用洁净的刀片切割八厘米长的上样管和出口管，并将其插入洁净的载玻片孔中。用环氧树脂固定管路，室温静置五分钟使其固化。将预先按通道图案切割好的双面胶带贴到载玻片上，并用塑料镊子压平，以确保密封良好。

撕下胶带的背衬，盖上一片干净的盖玻片，用镊子将其抚平。然后用环氧树脂密封盖玻片边缘以封闭流动池，并使其固化。按照文稿中的说明进行PCR，制备用于固定的标记DNA。

然后使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。配制10毫升缓冲液A，并在真空干燥器中脱气至少一小时。为功能化流动池，用移液枪配合凝胶上样枪头将25微升含抗地高辛和Fab片段的PBS溶液注入流动通道，枪头需插入PE60管中。

将流动池在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，用注射器将 0.5 毫升缓冲液 A 通过通道，注意避免将空气引入通道。然后，将流动池安装到倒置显微镜上。

将出口管连接至注射泵，并将进口管插入含有缓冲液A的微量离心管中。手动抽取至少0.5毫升缓冲液A，以冲洗系统并启动泵。然后让泵以10 µL/min的速度运行至少5分钟，使系统达到平衡。涡旋混匀珠子的储存瓶，取1.6 µL珠子加入50 µL缓冲液A中，再次涡旋混匀。

将磁珠置于磁力架上，用移液器吸除缓冲液。用50微升缓冲液A重悬磁珠，并涡旋混匀。最后一次洗涤后，将磁珠重悬于100微升缓冲液A中，终浓度为160微克/毫升。

在缓冲液A中配制480微升0.5皮摩尔的标记DNA底物，将20微升珠悬浮液加入稀释后的DNA中。将混合物置于旋转仪上旋转3分钟。3分钟后，立即以每分钟10微升的流速将样品加载到通道中，持续15分钟，或直至观察到足够的珠子固定。

通过将进样管切换至装有新鲜缓冲液A的新离心管，并以每分钟50微升的速度持续流过至少10分钟，或直至观察不到游离的微珠，从而清洗通道中的所有游离微珠。使用在线阀门切断流路并切换管路会有所帮助。切换管路时应以一个流畅动作为准，并确保新旧样品管中的液面高度一致，以避免反流。

在采集数据之前，配制适当浓度的DNA切割酶，并将进样管插入样品中。将磁铁置于流动池上方。设置泵以每分钟150微升的速度注入80微升样品，并开始数据采集。

数据收集开始一分钟后，启动泵。图中显示了反应前后拴系小球的代表性图像。通过数据分析，定量测定在整个切割反应过程中仍保持拴系状态的小球数量。

该技术用于测量 Nde1 在 0.25 至 4 单位/毫升蛋白浓度范围以及两种不同镁离子浓度下的特定位点 DNA 切割速率。每种条件至少重复两次，每次实验包含数百至一千条拴系的 DNA 分子。在足够低的蛋白浓度下，切割速率与蛋白浓度成正比，且与镁离子浓度无关。

对于高蛋白浓度，反应速率依赖于镁离子，但与蛋白浓度无关。在进行该方案时需注意，管路和流动通道中的气泡可能影响实验结果。更换管路时务必避免将空气引入系统，并在使用前对所有缓冲液进行脱气处理。

通过拴系方法，可以研究DNA上的张力对反应的影响。这可以通过改变磁铁强度或在数据采集期间施加流体来实现。