循环介制的对热放大，用于在动物食品中筛查沙门氏菌，并确认来自文化隔离的沙门氏菌
2020年5月20日
循环介质异热放大 （LAMP） 是一种同热核酸放大测试 （iNAAT），已引起病原体检测领域的广泛兴趣。在这里，我们提出了一个多实验室验证的 沙门氏菌 LAM协议，作为一种快速、可靠和可靠的方法，用于在动物食品中筛查 沙门氏菌 ，并确认 假定的沙门氏菌 来自培养隔离。
这种沙门氏菌 LAMP 方法已被纳入 FDA 的细菌学分析手册，既可以作为动物食品中的筛查方法，也可以作为任何推定沙门氏菌分离株的确认方法。该方法快速、可靠且稳健。与 PCR 相比，它的主要优势包括快速检测、仪器简单、假阴性率低和工作流程灵活。
沙门氏菌等病原体的快速筛查在快速检测可能受污染的产品方面起着重要作用，可以防止人类和动物的疾病或爆发。首先为 LAMP 检测准备 DNA 模板。有两种类型的样品用于制备 DNA 模板。
要从动物食品样品制备模板，请在无菌情况下称取 25 克食品样品放入无菌过滤袋中。向袋子中加入 225 毫升无菌缓冲蛋白胨水，并在 35 摄氏度下孵育 24 小时。孵育后，将 1 毫升从袋子的过滤侧转移到微量离心管中。
将试管以 900 倍 G 离心 1 分钟。然后将上清液转移到新的微量离心管中。将样品以 16， 000 倍 G 离心 2 分钟。
要丢弃上清液，请将沉淀重悬于 100 μL 样品制备试剂中，并在 100 摄氏度下在干热块中加热 10 分钟。然后，将样品冷却至室温并储存在零下 20 摄氏度。该 LAMP 检测的第二种样品直接来自推定的沙门氏菌培养物。
要制备 DNA 模板，请将 500 μL 过夜沙门氏菌培养物转移到微量离心管中，并在 100 摄氏度的加热块中加热 10 分钟。然后，将样品冷却至室温并储存在零下 20 摄氏度。为防止交叉污染，请物理分离用于制备 LAMP 预混液和添加 DNA 模板的区域。
用异丙醇和 DNA 和 DNA 的降解溶液清洁工作表面。然后，清洁移液器和联管架。在室温下解冻等温预混液、10X 引物混合物、分子级水、阳性对照 DNA 和 DNA 模板。
打开 LAMP 仪器，然后输入相关的样品信息。根据手稿说明准备 LAMP 预混液，涡旋并短暂离心，然后将 23 微升预混液分配到试管联管的每个孔中。涡旋所有 DNA 模板并短暂离心。
然后，将 2 μL DNA 模板加入适当的孔中，并盖紧孔。从支架上取下联排管，然后轻弹以确保所有试剂都聚集在试管底部。将联管装入 LAMP 仪器中，然后开始 LAMP 运行。
在 LAMP 反应过程中，点按 温度、扩增 和 退火 选项卡，以查看 LAMP 运行期间各种参数的动态变化。可以在 LAMP 仪表板上实时查看 LAMP 结果，也可以使用 LAMP 软件查看。要解释仪表板上的结果，请打开感兴趣的 LAMP 运行。
观察与每个运行关联的 5 个选项卡。Profile （曲线） 和 Temperature （温度） 选项卡显示 LAMP 反应进行时样品孔中的编程温度和实际温度。Amplification 和 Anneal 选项卡分别显示扩增和退火阶段的荧光读数和荧光变化。
"结果"选项卡显示 LAMP 结果的表格视图，可以根据手稿说明进行解释。查看 LAMP 结果的第二种方法是使用 LAMP 软件。要使用软件解释结果，请单击左侧面板上的 Computer 图标并导航到文件位置以加载感兴趣的 LAMP 运行。
观察与每个运行关联的 7 个选项卡。Profile （曲线） 和 Temperature （温度） 选项卡显示 LAMP 反应进行时样品孔中的编程温度和实际温度。Amplification 和 Amplification Rate 选项卡显示扩增阶段的荧光读数和荧光变化。
Anneal （退火） 和 Anneal Derivative （退火衍生物） 选项卡显示退火阶段的荧光读数和荧光变化。Results （结果） 选项卡显示 LAMP 结果的表格视图。有四列，标题为 Graph Name、Well Number、Well Name 和 Peak Value。
显示了所有八个采样的 Amp Time 和 Anneal Derivatives。结果可以根据手稿说明进行解释。LAMP 仪表板和 LAMP 软件可用于显示检测结果。
在此 LAMP 运行中，样品 S1 至 S6 是婴儿沙门氏菌血清型 ATCC 51741 的 10 倍连续稀释液，每个反应的菌落形成单位范围为 110 万至 11 个。阳性对照或 PC 是肠道沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌 LT2，每个反应 17， 000 个菌落形成单位，无模板对照或 NTC 是分子级水。NTC 孔在 LAMP 仪表板上具有空白 Tmax 和大约 81 摄氏度的无菌温度，在 LAMP 软件中具有空白 Tmax 和空白退火温度。
阳性对照孔在两个平台上的 Tmax 为 7 分 45 秒，退火温度约为 90 摄氏度。样品 S1 至 S6 的 Tmax 在 6 分 30 秒和 12 分 15 秒之间，退火温度约为 90 摄氏度，均表明检测呈阳性。LAMP 非常有效，可产生大量 DNA。
因此，采用最佳实验室规范来防止交叉污染至关重要。在制作 DNA 模板时，请使用类似的做法，因为从受污染的动物性食物中富集的沙门氏菌含量可能很高。LAMP 筛查呈阳性的动物食品样品应按照 FDA 细菌学分析手册中的程序通过培养分离来确认。
阴性样本可以这样报告。将这种 LAMP 方法纳入 FDA 的细菌学分析手册，为这种快速、可靠且用户友好的技术在食品安全检测中的更广泛应用铺平了道路。
概述
本研究提出了一种经过验证的环介导等温扩增（LAMP）协议，用于动物食品中沙门氏菌的快速检测。该方法比传统PCR有优势，包括更快的结果和更低的假阴性率，使其成为识别潜在污染的可靠工具。
关键研究组成部分
研究领域
- 病原体检测
- 核酸扩增
- 食品安全
背景
- 食品产品中快速病原体检测的重要性
- 对沙门氏菌可靠筛选方法的需求
- 传统PCR方法的局限性
使用的方法
- 环介导等温扩增（LAMP）
- 沙门氏菌属
- 使用特定的DNA准备协议
主要结果
- 证明了LAMP在沙门氏菌检测中的有效性
- 强调了该方法的低假阴性率
- 通过多实验室比较进行验证
结论
- 研究确立LAMP作为筛选和确认食品中沙门氏菌的可行方法。
- 它强调了快速测试对于增强食品安全和预防健康风险的重要性。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of Salmonella presence in complex matrices like animal food enrichments.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing of contamination risk without requiring culturing timelines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts for real-time monitoring of amplification kinetics.
- Operational Value: Delivers results in as little as 5 minutes with tolerance to inhibitors commonly found in food or culture samples.
- Strategic Value: Facilitates high-throughput screening readiness due to simple instrumentation and minimal hands-on time.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms presumptive isolates from culture, bridging phenotypic and genotypic detection methods.
- Operational Value: Uses standardized DNA preparation protocols applicable to both food enrichment broths and pure cultures.
Pipeline & Workflow Integration
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.
- Discovery Biology: Enables early detection of Salmonella in pre-enriched animal food samples to inform hazard assessment.
- Screening: Provides inhibitor-resistant amplification suitable for complex food matrices after enrichment.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence data with defined Tmax and annealing temperature thresholds for result interpretation.
- Translational Research: Confirms LAMP-positive results via culture isolation, ensuring continuity between molecular and phenotypic validation.
- Enterprise Reuse: Compatible with existing LAMP instruments and software, allowing reuse across multiple sample types and laboratories.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High specificity via invA gene targeting reduces false positives in pathogen detection.
- Operational Value: Simple workflow with minimal equipment needs (heat block, centrifuge, LAMP instrument) increases accessibility.
- Strategic Value: Low false-negative rate improves confidence in negative results, supporting release decisions.
- Portfolio Impact: Enables risk-based prioritization of samples for further testing, optimizing resource use in safety programs.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic sample preparation and DNA template generation from enrichment broths or cultures.
- Needs access to a LAMP-capable fluorometer or real-time isothermal amplification instrument.
- Demands standardized reagent handling, including primer mixes and master mix preparation per manufacturer guidelines.
- Requires physical separation of master mix preparation and template addition zones to prevent amplicon contamination.
- Relies on proper cold storage (-20°C) of prepared DNA templates to maintain integrity between extraction and amplification.
