Name: 用于微CT成像的成人和早期产后小鼠肺的血管铸造 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 了解小鼠肺动脉血管铸造技术，用于微CT成像和血管形态学研究。该方法适用于成年及早期产后小鼠，可完整保留软组织结构，为肺血管网络可视化提供可靠方案。

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本研究部分得到了美国国家心肺血液研究所（NHLBI）院内研究计划（DIR HL-006247）的支持。我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）小鼠影像设施在图像采集与分析方面提供的指导。

本文所述所有方法均已获得国家心肺血液研究所机构动物护理和使用委员会（ACUC）的批准。
1. 准备
<ol>
	<li>按每克小鼠体重1单位的剂量，对小鼠进行腹腔注射肝素，并让其自由活动2分钟。</li>
	<li>将动物置于CO2麻醉箱中实施安乐死。</li>
	<li>将小鼠仰卧位固定于手术板上，用胶带固定四肢。精细解剖时使用放大设备。</li>
</ol>
2. 暴露肺和气管
<ol>
	<li>用70%乙醇喷洒小鼠腹侧，以减少毛发干扰。</li>
	<li>用镊子夹住腹部皮肤，在脐部区域用剪刀做一小切口。将剪刀尖滑入腹肌与皮肤之间的筋膜层，开始分离这两层组织。向头侧方向操作，将皮肤从腹部、肋笼和颈部逐步剥离。</li>
	<li>用剪刀切开腹壁肌肉，并向两侧横向剪开，直至暴露膈肌。</li>
	<li>轻轻夹住剑突并略微抬起肋笼，以通过薄而半透明的膈肌获得尾侧肺叶的最佳视野。在剑突正下方小心地于膈肌上做一小切口。肺将随之塌陷并从膈肌分离。将膈肌从肋笼上仔细解剖分离，注意避免损伤肺实质。</li>
	<li>定位并切断下腔静脉（IVC）和食管穿过膈肌的部位。用纱布清理胸腔内积血，避免接触肺组织。</li>
	<li>再次夹住剑突并轻轻抬起。在两侧沿腋中线附近剪开肋骨，避免接触肺组织。完全移除前部肋笼，最后沿胸骨角在胸骨柄前方做终末切割。</li>
	<li>使用预装好的注射器，用磷酸盐缓冲液（PBS, pH 7.4）充分润湿肺组织，防止干燥。在整个操作过程中持续重复此步骤。</li>
	<li>用镊子夹住胸骨柄并轻轻抬离身体。用剪刀在胸骨柄外侧1-2 mm处剪断锁骨并移除，从而暴露其下方的胸腺。</li>
	<li>夹住胸腺的每一叶，轻轻拉开并移除。随后以相同方式处理下颌下腺。最后，移除覆盖在气管表面的肌肉组织。 
	注意：解剖完成后，心脏、升主动脉（AA）、肺动脉干（PAT）和气管应清晰可见。确保从主干发出的主要动脉分支未被切断或损伤。</li>
</ol>
3. 肺动脉导管插入术与血液灌注
<ol>
	<li>组装单元1时，将一段15 cm的PE-10导管穿入30 G针头的针座，并连接至预先装有10-4 M PBS配制的硝普钠（SNP）的1 mL注射器。推动注射器活塞，排出该单元内所有空气，以完成导管的预充（图1）。 
	警告：若吞食，硝普钠具有毒性。避免与皮肤和眼睛接触。操作后应彻底清洗皮肤。佩戴适当个人防护装备。
	<ol>
		<li>也可选择组装单元2。对于出生后第7天（P7）及更小的幼鼠，使用止血钳将另一根30 G针头从其针座上拆下，并将该针头穿至单元1导管的开放端（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>不用针头，改用弯头锐利镊子夹住一段10 cm长的7-0丝线一端。从心脏一侧穿刺心尖部位，使镊子尖端穿过心肌并从另一侧穿出。用另一把镊子夹住丝线，将约2 cm长度拉出并打结固定。将剩余约8 cm的缝线末端向尾侧牵拉心脏，并将线头用胶带固定于手术板上。 
	注意：此举可产生张力，进一步暴露大血管，并将心脏固定于原位，便于导管更顺利地插入肺动脉。</li>
	<li>将弯头镊子的尖端钩住主动脉（AA）和肺动脉干（PAT）的根部。将一段3 cm长的7-0丝线从开口处向后拉出，打一个单结松缝线。</li>
	<li>使用剪刀在靠近心尖处做1–2 mm切口，穿透右心室（RV）薄壁，以便插入导管（单元1）。插入前，确认系统内无残留空气。将已预充的导管插入右心室，并轻柔推进至半透明的薄壁肺动脉干（PAT）内。
	<ol>
		<li>目视确认导管未进入左或右肺动脉分支，且未抵住肺动脉分叉处。使用胶带将导管远端固定于手术板上。 
		注意：识别右心室时，可用镊子夹捏心脏右侧。与左心室不同，右心室游离壁相对较薄，易于夹持。</li>
		<li>对于小于P7的幼鼠，将单元2连接至显微操作仪，并通过操作仪将该单元的针头端按上述方法插入肺动脉干（PAT）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻柔收紧围绕两条大血管的松缝线，并剪除第3.2步中预留的8 cm缝线，使心脏恢复自然静息位置。此时导管已牢固固定于肺动脉干（PAT）内。</li>
	<li>剪开左心耳，以允许灌注液从系统中流出。</li>
	<li>将含SNP的注射器（单元1或单元2，根据尺寸选择）固定于注射泵上，以0.05 mL/min的速度灌注溶液，以冲洗血液并最大程度扩张血管系统。灌注液/血液将通过剪开的心耳流出。持续灌注直至流出液澄清（成年小鼠约需200 µL，幼龄动物用量更少）。 
	注意：在灌注低黏度的PBS/SNP溶液时，为节省时间采用相对较高的输注速率。而黏度更高的聚合物溶液则需以较慢速率输注，以防止过度充盈、血管破裂，并更好地控制远端灌注终点。</li>
</ol>
4. 气管切开与肺部膨胀
<ol>
	<li>构建肺膨胀装置（图2）。
	<ol>
		<li>将一根柔性的塑料24 G静脉（IV）导管（针头已移除）/蝶形输液套件连接至一个三通阀，并将该三通阀连接至一个打开的50 mL注射器（无活塞）。将注射器悬挂在铁架台上。</li>
		<li>向注射器中加入10%缓冲福尔马林溶液。打开三通阀，使福尔马林流入导管，排出系统中的所有空气。关闭三通阀，并将注射器抬高，直至液面弯月面位于气管上方20 cm处8。 
		警告：福尔马林具有可燃性，属于致癌物，经口摄入时具有急性毒性，可引起皮肤刺激、严重眼损伤、皮肤致敏以及生殖细胞致突变性。避免摄入及与皮肤和眼睛接触。避免吸入其蒸气或雾滴。远离点火源。穿戴适当个人防护装备。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在环状软骨下方放置两条相距2–4 mm的松缝线。</li>
	<li>使用剪刀，在缝线上方的环甲膜处做一个小切口。</li>
	<li>将静脉导管插入切口，并将导管尖端推进至超过两条松缝线的位置。</li>
	<li>收紧环绕气管的缝线并打开三通阀。通过重力使福尔马林进入肺部，等待5分钟，使肺充分膨胀。若肺在膨胀过程中粘附于胸壁，可用钝头镊子夹住肋骨外侧，向各个方向移动，以帮助分离肺叶。切勿直接接触肺组织。</li>
	<li>5分钟后，将静脉导管后撤至第一条缝线后方并结扎。对第二条缝线重复此操作。此时肺已处于封闭加压膨胀状态。</li>
</ol>
5. 血管铸型
<ol>
	<li>&#160;在1.5 mL离心管中，配制1 mL的8:1:1聚合物-稀释剂-固化剂溶液8，轻轻颠倒混匀数次，确保充分混合。</li>
	<li>从1 mL注射器中取出活塞，用戴手套的手指堵住另一端，将聚合物化合物倒入注射器中。小心地重新插入活塞，倒置注射器并推动活塞，以排出所有空气，并在注射器尖端形成弯月面。</li>
	<li>将SNP/PBS注射器从针头连接座上取下，在连接座内滴加额外的PBS以形成弯月面。仔细检查连接座内是否有气泡滞留，必要时将其震出，并重新形成弯月面。将连接座与装有聚合物化合物的注射器连接。 
	注意：在两端均形成弯月面可显著降低空气进入系统的可能性。</li>
	<li>将装有聚合物化合物的注射器连接至注射泵，以0.02 mL/min的速度灌注。 
	注意：对于较小的肺组织，较慢的流速有助于防止过度灌注，但并非必需。</li>
	<li>观察化合物在PE导管中的流动情况，并在进入PAT时记录注射器内的体积。持续灌注直至所有肺叶完全填充至毛细血管水平，然后停止注射泵。再次检查注射器内的剩余体积。 
	注意：经过多次操作后，可根据经验估算终点体积（成年小鼠约为35 μL，P1幼鼠约为5 μL）。停止泵送后，系统内残余压力仍会继续推动聚合物化合物进入肺动脉。所有肺叶应以相近的速度完成填充。</li>
	<li>用光纤清洁布覆盖肺组织，大量加入PBS，并将尸体在室温下静置30–40分钟。在此期间，聚合物化合物将固化并变硬。</li>
	<li>移除导管，剪除小鼠的前肢和下半身，将头部和胸腔部分放入盛有50 mL 10%缓冲福尔马林的锥形管中，固定过夜。</li>
	<li>固定完成后，夹住气管，轻轻将心肺组织从残留的肋骨和胸腔中分离出来。将心肺组织块放入盛有福尔马林的闪烁计数瓶中。其余组织丢弃。</li>
</ol>
6. 用于灌注的替代血管床（表1）
注意：每个目标血管床可能需要不同的导管放置位置、灌注速率和最佳充盈时间。因此，需要使用多只动物来制备多个器官的铸型。
<ol>
	<li>对于膈肌上方或下方的全身血管床，请按照上述步骤 1.1–2.5 操作。参见有关门脉系统和膈肌的附加说明（表 1）。</li>
	<li>用止血钳夹住剑突，并在双侧肋骨（大致位于腋中线处）靠近胸廓内动脉前切断肋骨。</li>
	<li>将仍相连的肋骨向上翻折，使其贴附于动物颈部或头部，充分暴露胸腔。</li>
	<li>执行上述步骤 3.1，随后移除肺脏。当胸主动脉（TA）暴露后，将弯头镊子的尖端插入其下方，位置约在膈肌上方 10 mm 处。取一段 3 cm 长的 7-0 丝线，从 TA 下方穿入并拉出，打一个单结松缝线。在距膈肌约 8 mm 的上方重复此操作。</li>
	<li>对于膈肌上方的结构，在 TA 的腹侧部分制造一个小孔（约占总周长的 30%），位置约在步骤 6.4 所置松缝线下方 2 mm 处。
	<ol>
		<li>对于膈肌下方的结构，则在松缝线上方约 2 mm 处制造小孔。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据动物体型，将 Unit 1 或 Unit 2 插入血管，推进至越过松缝线位置，并轻柔地结扎血管。</li>
	<li>执行步骤 3.7，将注射泵设置为 1.0 mL/min 的流速，灌注至少 5 mL 灌注液。灌注液将通过下腔静脉（IVC）流出。</li>
	<li>执行步骤 5.1–5.4，调整输注速率为 0.05 mL/min，并实时肉眼观察目标组织。 
	注意：输注体积因器官和动物年龄而异。可通过结扎通向非目标血管床（如脑、肝、肾、肠）的动脉分支进一步限制灌注体积。</li>
	<li>执行步骤 5.6，随后取出目标组织并置于福尔马林中。</li>
</ol>
7. 微型计算机断层扫描的样本安装、扫描与重建
<ol>
	<li>使用石蜡膜在扫描床上创建一个平整的表面，并将湿润的样本置于该表面中央（图3A）。 
	注意：如果检测到运动伪影，样本可能需要进一步固定。</li>
	<li>用额外的石蜡膜轻轻覆盖样本，以防止脱水。需特别注意不要让石蜡膜直接接触样本，以免造成组织变形（图3B）。</li>
	<li>使用 表2 中列出的设置对样本进行扫描，并在同一次实验中保持这些参数一致。 
	注意：具体设置取决于实验目的和终点指标。为便于样本间的比较，应统一所选参数。</li>
	<li>将重建后的扫描数据转移至后续处理与分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露

若操作得当，该方法可获得清晰的小鼠肺动脉网络图像，适用于在啮齿类动物模型中进行比较与实验研究。整个过程中有几个关键步骤对成功至关重要。首先，研究人员必须在准备阶段对动物进行肝素化处理，以防止血液在肺血管及心脏腔室内形成凝块，从而确保聚合物化合物能够完全通过动脉系统。其次，在穿刺膈肌并移除肋骨时，需注意保护肺组织，避免意外损伤、切割或创伤。呼吸道的任何泄漏都将导致肺无法充分膨胀，从而使样本间的比较失去准确性。第三，将心脏心尖部固定有助于导管的准确定位。第四，使用强效血管扩张剂（如硝普钠，SNP）有助于清除血液，并促进小动脉和毛细血管的完全充填5,8。第五，在将导管插入肺动脉干（PAT）时，应注意避免将导管尖端插入分叉处，否则会导致血流分布不均，使聚合物偏向左侧或右侧，产生不均衡的压力梯度。第六，使用注射泵可使操作者精确控制注射速率，并根据小鼠品系和年龄调整注射体积。最后，应将心脏和肺组织保留在胸腔其余结构中，固定过夜，次日再行取出。这样可确保肺组织充分固定，并最大限度减少分离过程中因意外划伤导致的塌陷风险。
<p ...

该技术的重点是利用基于聚合物的化合物在小鼠中可视化肺动脉结构。尽管针对脑、心脏和肾脏等全身血管床的研究已十分广泛1,2,3,4,5，但关于肺动脉网络的制备与灌注方法的信息仍较为有限。因此，本研究旨在拓展以往的研究工作6,7,8，并提供一份详细的图文参考，以便研究人员能够轻松遵循，从而获得高分辨率的肺动脉树图像。
尽管目前已存在多种用于标记和成像肺血管的方法，例如磁共振成像、超声心动图或CT血管造影9,10，但这些成像方式中的许多都无法充分灌注和/或清晰捕捉到微小血管，从而限制了可研究的范围。诸如连续切片与三维重建等方法虽能提供高分辨率图像，但耗时且劳动强度大11,12,13。传统的腐蚀铸型技术会破坏周围软组织的完整性10,13,14,15,16。在尝试插入导管时，动物的年龄和体型也会成为影响因素，或导致分辨率不足。相比之下，聚合物注射技术可将动脉灌注至毛细血管水平，结合µCT成像后，可实现无与伦比的分辨率5。已有成功对出生后第14天小鼠肺组织进行铸型8并在数小时内完成处理的案例。这些样本可无限次重复扫描，甚至可用于组织学制备或电子显微镜（EM）分析，而不会破坏原有的软组织结构17。该方法的主要局限性在于CT设备和软件的前期成本较高、难以精确监测血管内压力，以及无法在同一动物体内进行纵向数据采集。
本文在已有研究基础上进一步优化了肺动脉注射技术，将适用的年龄/体型范围下推至出生后第1天（P1），取得了显著成果。该技术对希望研究动脉血管网络的研究团队尤为有用。因此，我们提供了导管放置与固定的新型指导方案，增强了对灌注速率和体积的控制，并指出了若干关键性技术陷阱，以提高血管铸型的成功率。所获得的血管铸型可进一步用于后续的表征与形态学分析。或许更为重要的是，据我们所知，这是首次以可视化方式完整演示并逐步指导用户完成这一复杂操作的技术流程。

<table><tbody><tr><td>1cc 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>20ml 玻璃闪烁瓶</td><td>Fisher</td><td>03-340-25P</td><td></td></tr><tr><td>30G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>50mL 锥形管</td><td>Cornin</td><td>352098</td><td>用于样品储存和扫描</td></tr><tr><td>60cc 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>7-0 丝线缝合线</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 12.0 软件</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>主要软件</td></tr><tr><td>Amira 6.7 软件</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td>替代软件</td></tr><tr><td>CeramaCut 剪刀 9cm</td><td>Fine Science tools</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>陶瓷涂层弯头镊子</td><td>Fine Science tools</td><td>11272-50</td><td></td></tr><tr><td>CO2 气罐</td><td>Robert's Oxygen Co.</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>双通道注射泵</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-74900-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 微型镊子</td><td>Fine Science tools</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>福尔马林</td><td>Sigma - Life Sciences</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Covidien</td><td>441215</td><td></td></tr><tr><td>止血钳</td><td>Fine Science tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>肝素（1000USP 单位/ml）</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2720-01</td><td></td></tr><tr><td>Horos 软件</td><td>Horos Project</td><td>N/A</td><td>替代软件</td></tr><tr><td>诱导室</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe 擦拭纸</td><td>Fisher</td><td>06-666</td><td>光纤清洁擦拭纸</td></tr><tr><td>标签胶带</td><td>Fisher</td><td>15966</td><td></td></tr><tr><td>磁力底座</td><td>Kanetec</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT 系统</td><td>PerkinElmer</td><td>Quantum GX</td><td></td></tr><tr><td>Microfil（聚合物化合物）</td><td>Flowech Inc.</td><td>Kit B - MV-122</td><td>8 盎司 MV 化合物；8 盎司稀释剂；MV 固化剂</td></tr><tr><td>显微操作器</td><td>Stoelting</td><td>56131</td><td></td></tr><tr><td>Monoject 1/2 ml 胰岛素注射器</td><td>Covidien</td><td>1188528012</td><td></td></tr><tr><td>Octagon 直齿镊子</td><td>Fine Science tools</td><td>11042-08</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis company, Inc.</td><td>#PM999</td><td></td></tr><tr><td>PE-10 管路</td><td>Instech</td><td>BTPE-10</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>BioRad</td><td>#161-0780</td><td></td></tr><tr><td>铁架台</td><td>Fisher</td><td>S13747</td><td>高度 24 英寸</td></tr><tr><td>硝普钠</td><td>sigma</td><td>71778-25G</td><td></td></tr><tr><td>钢板</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>16 x 16 英寸面积，厚 1/16 英寸</td></tr><tr><td>直头弹簧剪刀</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>SURFLO 24G 聚四氟乙烯静脉导管</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>360103</td><td></td></tr><tr><td>手术板</td><td>Fisher</td><td>12-587-20</td><td>由载玻片架改装而成</td></tr><tr><td>通用三爪夹</td><td>Fisher</td><td>S24280</td><td></td></tr><tr><td>带翼输液器 25X3/4，12&quot; 管路</td><td>Nipro</td><td>PR25G19</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Stemi-508 解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

成年及早期出生后小鼠肺组织的血管铸型用于显微ct成像

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

血管在三维空间中形成复杂的网络。因此，仅通过观察组织表面难以直观理解血管网络之间的相互作用与行为。该方法提供了一种可视化肺部复杂三维血管结构的手段。
为实现这一目标，将导管插入肺动脉，同时冲洗血管中的血液并进行化学扩张，以降低阻力。然后通过气管在标准压力下使肺膨胀，并以标准流速将聚合物化合物注入血管床。待整个动脉网络被填充并充分固化后，可直接观察肺血管结构，或在微型计算机断层扫描（µCT）设备上进行成像。
若操作成功，可清晰观察到从小鼠出生早期至成年期的肺动脉网络。此外，尽管本方法以肺动脉床为例进行演示，但通过优化导管放置位置和终点，该技术可应用于其他任何血管床。

成功的灌注应表现出整个肺动脉网络的均匀填充。我们在不同年龄的 C57Bl/6J 小鼠中展示了这一点：出生后第 90 天（图 4A）、第 30 天（图 4B）、第 7 天（图 4C）和第 1 天（图 4D）。通过控制灌注流速并实时肉眼监测填充过程，可稳定地达到最远端血管的灌注终点（图 5A）。
常见挑战包括肺部损伤、灌注不完全、灌注不足或过度灌注、导管嵌顿以及动物体型等因素。
如果肺/气道受损，微小的泄漏将导致肺无法维持压力（<strong...

该技术旨在通过肺动脉灌注一种基于聚合物的射线不透性化合物，并结合肺组织膨胀，实现对出生后早期及成年小鼠肺动脉网络的离体可视化。本文还讨论了所制备血管铸型组织的潜在应用。

成年及早期出生后小鼠肺组织的血管铸型用于显微CT成像

血管在三维空间中形成复杂的网络。因此，很难直观地理解血管网络之间的相互作用及其……

本方案为成年及出生后早期小鼠的肺动脉血管铸型提供了精确的逐步操作指导。该技术可完整灌注整个血管网络，便于通过多种方法（包括显微CT）进行可视化观察，同时保持软组织的完整性。该技术特别适用于研究肺血管的形态与结构，也可轻松调整用于其他血管床的靶向灌注。与许多手术和解剖操作一样，实际观察整个操作过程是无可替代的，观看者通过观察一些较具挑战性的操作步骤可能会获益良多。暴露剑突后，轻柔地抓握并抬起肋骨 cage。在现已暴露的半透明膈肌上小心地做一切口。肺部会明显塌陷，并从膈膜处回缩。暴露肺和气管后，将15厘米长的PE10导管套入30号针头的接头处，并将此装置连接到一个含有10⁻⁴摩尔浓度PBS溶液的亚硝普钠的一毫升注射器上。推进活塞以预充管路，直至排尽所有空气。作为文本方法的有效替代，从心脏一侧的心尖处刺入，将弯钳的钳尖穿过心肌组织，并从另一侧穿出。夹住一段10厘米长的7-0丝线的一端，将约2厘米长度拉过组织。结扎缝线后，利用剩余的8厘米缝线将心脏向尾侧牵拉，并将缝线末端用胶带固定在手术板上。将弯镊的尖端钩住升主动脉和肺动脉干的两侧。将一段3厘米长的7-0丝线从开口处向后拉出，形成一个单结的松散缝线。使用剪刀朝心脏心尖方向做一长度为1至2毫米的切口，穿透薄壁的右心室。将预充好的导管插入右心室，并轻柔地推进导管，进入半透明、薄壁的肺动脉主干。目视确认导管未进入左或右肺动脉分支，且未抵住肺动脉分叉处。将导管远端固定于手术板上，并轻轻收紧环绕两大血管的松散缝线。剪断八厘米长的缝线，使心脏恢复至自然静息位置。剪开心脏左侧心耳，使灌注液能够从血管系统流出。然后使用注射泵，以每分钟0.5 ml的流速灌注硝普钠溶液，以冲洗血液并最大程度地扩张血管，直至灌注液变得澄清。为构建肺膨胀装置，从输液管上截取一段柔性的24号塑料静脉导管，并将其连接至蝶形输液器的针头上。将此装置连接至三通阀，并将三通 阀连接至一个开口的 50 毫升注射器。用福尔马林充满注射器并冲洗导管后，关闭三通阀，将注射器固定在铁架台上，使弯月面位于气管上方 20 厘米处。在环状软骨下方放置两条相距 2 至 4 毫米的松散缝线，并用剪刀在缝线上方的环甲膜处做一个小切口。将导管插入开口处，并将导管尖端推进至穿过两根松散的缝线。收紧气管周围的缝线，打开旋塞阀，使福尔马林依靠重力进入肺部。等待五分钟，直至肺部完全膨胀。如果肺部在充气过程中与胸壁粘连，可使用钝头镊子夹住胸壁外侧，向各个方向移动肋骨，以帮助分离肺叶，同时避免直接接触肺组织。五分钟后，将导管回撤至第一道缝线后方并结扎；随后将导管回撤至第二道缝线后方并再次结扎。此时肺脏应处于封闭加压的膨胀状态。为了灌注血管系统，将1毫升8-1-1比例的聚合物稀释剂固化剂溶液装入1毫升注射器中，并小心插入活塞。将注射器倒置，推动活塞以排出空气，并使注射器尖端形成弯月面。将硝普钠注射器从针头连接处取下，向连接处滴加磷酸盐缓冲液（PBS），形成弯月面。将聚合物-化合物注射器连接至连接处，并以0.02毫米/分钟的速率开始输注。观察化合物在管路中自由移动的情况，记录其进入肺动脉主干时的注射器体积。持续灌注，直至所有肺叶完全充满，直至最小的血管。停止泵送，再次记录注射器体积。用光纤清洁布覆盖肺组织，并充分加入 PBS。将标本在室温下静置 30 至 40 分钟。待聚合物化合物固化变硬后，切断小鼠的四肢和下半部分。将头部和胸部放入盛有10%缓冲福尔马林的50毫升锥形管中，固定过夜。次日早晨，抓住气管，轻柔地将心脏和肺组织整体从剩余的肋骨和胸腔中分离出来。将获取的组织块置于装有福尔马林的闪烁计数小瓶中。成功的灌注将实现整个肺动脉网络的均匀填充。如果肺组织或肺气道受损，微小的泄漏将导致肺无法维持压力。若在灌注过程中通过导管向血管系统引入空气，可能形成气锁，阻碍灌注液向远端流动，从而导致填充不均匀或不完全。灌注不足是指注入血管的化合物过少。相反，灌注过度，即过快地注入过多聚合物化合物，可能导致动脉破裂，或更常见地引起静脉通过。将导管插入肺动脉干过深，可能导致导管尖端嵌入一侧肺动脉分支，造成血流不平衡，使一侧充填速度比另一侧更快。按照演示仔细操作该技术，结合对远端血管终末点的适当直接监测以及标准输注速率，可实现肺血管系统的最佳灌注。此外，将该技术应用于全身血管系统，也可在其他血管床中获得同样理想的效果。灌注成模后，样本可进行显微计算机断层扫描（micro-computed tomography）检测。进行后期处理时，可使用商业软件包生成肺血管树的三维体积渲染图像。初次尝试该技术时，需特别小心脆弱的肺组织和肺动脉。最重要的是，避免将空气引入血管循环系统。成功制备铸型后，可使用显微CT扫描样本，进而探讨涉及血管形态计量学与结构的问题。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

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我们介绍一种利用X射线成像技术评估新生小鼠肺部肺泡液体清除率或肺水肿程度的实验方案。...

活体小鼠幼崽肺部液体容量的实时X射线成像

我们描述了一种利用微型计算机断层扫描（micro-computed...

利用微型计算机断层扫描评估肺癌小鼠模型中肿瘤的发展及治疗反应的随访

我们介绍一种基于显微CT和荧光分子断层成像的非侵入性多模态成像方法，用于对通过两次气管内滴注博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型进行纵向评估。...

一种基于显微CT与荧光分子断层成像的多模态成像方法用于小鼠博来霉素诱导肺纤维化的纵向评估

本文介绍了一种成年小鼠末节指骨截肢的实验方案，用于研究哺乳动物芽基形成及膜内成骨过程，通过荧光免疫组织化学和连续活体显微计算机断层扫描进行分析。...

成年小鼠指端截肢与再生：研究哺乳动物芽基形成和膜内成骨的简易模型

本文介绍了一种用于小鼠胸腔的永久性植入式光学窗口的外科手术植入方案，该窗口可实现肺部的高分辨率活体成像。由于该窗口具有长期稳定性，因此特别适用于研究肺部动态的细胞过程，尤其是肿瘤细胞播散后缓慢发展的转移进程等生物学事件。...

用于研究癌细胞肺转移的永久性窗口

双重树脂铸型微计算机断层扫描，即 DUCT，可实现对两种管状系统的同步可视化、数字化和分割，从而促进器官结构的三维分析。DUCT 结合了 离体 注射两种造影树脂，随后进行显微计算机断层扫描及断层数据的分割。...

DUCT：双重树脂铸型结合显微计算机断层扫描用于肝脏三维分析

本文介绍了一种利用显微计算机断层扫描（micro-CT）通过气管内滴注在病灶侧建立单侧博来霉素诱导的肺纤维化模型，以定量分析通气区域的实验方案。...

利用微型CT进行单侧肺容积分析以加强临床前模型中肺纤维化的评估

了解小鼠肺动脉血管铸造技术，用于微CT成像和血管形态学研究。该方法适用于成年及早期产后小鼠，可完整保留软组织结构，为肺血管网络可视化提供可靠方案。

成年及早期出生后小鼠肺组织的血管铸型用于显微CT成像

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