Name: 从人体 iPS 细胞中提取的网状工程心脏组织用于活体心肌修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: 学习利用人诱导多能干细胞制备网状工程心脏组织的方法，用于大鼠心肌梗死模型中的心脏再生治疗。该技术具有几何灵活性高、功能可扩展的优势，为心肌修复提供了可靠的实验方案。

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本工作获得了路易斯维尔大学Kosair慈善儿科心脏研究计划和理化学研究所生物系统动力学研究中心类器官项目在资金上的支持。我们已发表方案中使用的人诱导多能干细胞（HiPSCs）由日本京都大学京都iPS细胞研究所提供。

1. 人诱导多能干细胞的维持与心血管分化
<ol>
	<li>在薄层包被的基底膜基质（生长因子减少型，1:60 稀释）上，使用从小鼠胚胎成纤维细胞中提取的条件培养基（MEF-CM）并添加人碱性成纤维细胞生长因子（hbFGF）来扩增和维持 hiPSCs4。 
	注意：我们使用了一种 hiPSCs（四因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和 c-Myc）细胞系：201B6）。针对不同细胞系，需添加适当浓度的 hbFGF。也可使用层粘连蛋白-511 片段替代基底膜基质对培养皿进行包被。市面上可购得的专为无饲养层培养 hiPSCs 设计的培养基可替代 MEF-CM 使用。</li>
	<li>当细胞融合度达到 90‒100% 时，使用 Versene（0.48 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液）使细胞脱离并解离。 
	注意：也可使用其他市售的细胞解离产品。</li>
	<li>将细胞以 10,000 个细胞/mm2 的密度接种于基质包被的细胞培养板中，使用含 hbFGF 的 MEF-CM 培养 2 至 3 天。</li>
	<li>当培养物完全融合后，用基质（以 MEF-CM 1:60 稀释）覆盖细胞一天。</li>
	<li>将 MEF-CM 更换为 RPMI 1640 + B27 培养基，并向其中添加 100 ng/mL Activin A 和 100 ng/mL Wnt3A，继续培养一天。 
	注意：此为分化的第 0 天。为上调经典 Wnt 信号通路，也可使用 GSK3β 抑制剂替代 Wnt3A。</li>
	<li>在分化的第 1 天，更换为新的 RPMI 1640 + B27 培养基，并添加 10 ng/mL BMP4 和 10 ng/mL hbFGF。继续培养 2 天（MC 方案）或 4 天（CM+EC 方案），期间不更换培养基5。 
	注意：CM+EC 方案旨在同时诱导心肌细胞（CMs）和血管内皮细胞（ECs）；MC 方案则优化用于优先诱导血管壁细胞（MCs）。</li>
	<li>用于诱导心肌细胞和内皮细胞的 CM+EC 方案（图 1A）。
	<ol>
		<li>在分化的第 5 天，更换为 RPMI 1640 + B27 培养基，并补充 50 ng/mL VEGF165。</li>
		<li>每 48 小时更换一次培养基，直至分化的第 13‒15 天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于诱导血管壁细胞的 MC 方案（图 1B）
	<ol>
		<li>在分化的第 3 天，更换为 RPMI 1640 + 10% 胎牛血清（FBS）培养基。</li>
		<li>每 48 小时更换一次培养基，直至分化的第 13‒15 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分化第13至15天的细胞收获与谱系分析
<ol>
	<li>用不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞。</li>
	<li>向细胞培养皿中加入细胞解离液（含蛋白酶、胶原酶和DNase），以覆盖培养皿表面。将培养皿在 37 °C 下孵育 5 分钟。</li>
	<li>孵育后，用移液器将细胞收集并用培养基吹打解离。</li>
	<li>取 1 × 106 个细胞用于流式细胞术进行谱系分析。为排除死细胞，使用可固定的活率染料对细胞进行染色。</li>
	<li>在含 5% FBS 的 PBS 中对细胞进行细胞膜表面标志物染色。在荧光激活细胞分选（FACS）染色缓冲液中使用以下抗体稀释比例：抗 PDGFRβ 抗体（1:100）、抗 VE-cadherin 抗体（1:100）、抗 TRA-1-60 抗体（1:20）。</li>
	<li>对于细胞内蛋白，用含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 重悬并固定细胞。</li>
	<li>在含 5% FBS 和 0.75% 皂苷的 PBS 中，使用抗心肌肌钙蛋白 T 同工型（cTnT）抗体对细胞进行染色，随后用 488 标记的鼠 IgG1 抗体（稀释比例 1:50）标记 cTnT 抗体。</li>
	<li>将染色后的细胞重悬于含 5% FBS 的 PBS 中，并通过细胞滤网转移至 FACS 管中。</li>
	<li>通过流式细胞术分析每种分化方案所得染色细胞的细胞组成，以促进生成具有明确谱系分布的细胞悬液。 
	注意：进行此操作时，用于 ECTs 的剩余细胞悬液应保存在 4 °C 冰箱中。</li>
</ol>
3. PDMS 组织模具的制备
<ol>
	<li>将预聚物与交联剂按10:1的比例混合，浇铸一层厚度为0.5 mm、面积超过30 mm × 30 mm的聚二甲基硅氧烷（PDMS）层，随后在80 °C下固化3 h。</li>
	<li>将PDMS片材切割，并使用硅胶粘合剂将其粘接，制成一个尺寸为21 mm × 20.5 mm的矩形托盘，托盘内设有交错排列的矩形柱，柱体长度为7 mm、宽度为0.5 mm、高度为2.5 mm。两列柱体之间的水平间距为2.5 mm（图2B）。</li>
	<li>将该托盘在120 °C下高压灭菌20 min。</li>
	<li>用含1%泊洛沙姆407的PBS溶液对托盘进行包被处理1 h。使用前需充分用PBS冲洗去除泊洛沙姆407，并将模具用PBS充分清洗。</li>
</ol>
4. ECT 构建
<ol>
	<li>完成细胞谱系分析后，将CM+EC和MC方案的细胞合并，使MC的终浓度为10%至20%，每构建物的总细胞数为六百万个细胞5。</li>
	<li>将六百万个混合细胞悬浮于ECT培养基中（α最低必需培养基，添加10%胎牛血清、50 µM 2-巯基乙醇和100 U/mL青霉素-链霉素）。</li>
	<li>基质溶液的制备
	<ol>
		<li>将133 µL酸溶性大鼠尾部I型胶原蛋白溶液（2 mg/mL，pH 3）与17 µL 10倍浓缩最低必需培养基（MEM）混合。然后将该溶液与17 µL碱性缓冲液（0.2 M NaHCO3、0.2 M HEPES和0.1 M NaOH）混合。 
		注：胶原蛋白必须保持在冰上（4 °C）。检查缓冲液颜色，若所有溶液混合后培养基未呈现粉红色，则需向培养基中添加额外的碱性缓冲液。混合步骤必须为先混合I型胶原蛋白与10倍浓缩MEM，再加入碱性缓冲液。不得更改此顺序。混合过程中切勿产生气泡。</li>
		<li>向中和后的胶原蛋白溶液中加入67 µL基底膜基质。 
		注：混合后的溶液必须保持在冰上（4 °C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将含有六百万个细胞的细胞悬液在1,100 rpm（240 × g）下离心5分钟，然后用167 µL高糖DMEM + 20% FBS + 1%青霉素-链霉素（100倍浓缩）重悬细胞。</li>
	<li>将细胞悬液与基质溶液混合。每构建物的细胞/基质混合液总体积为400 μL。 
	注：此步骤中，细胞/基质混合液应为非黏稠状且呈粉红色。需保持在冰上，因凝胶在室温下会固化。I型胶原蛋白的终浓度为0.67 mg/mL。</li>
	<li>将细胞/基质混合液均匀倾倒至已涂覆泊洛沙姆407的PDMS组织模具上，该模具置于六孔培养板中12。 
	注：倾倒时应小心操作，避免产生气泡，以防凝胶填充不全。</li>
	<li>将细胞/基质混合液置于标准CO2培养箱（37°C，5% CO2）中孵育60分钟。</li>
	<li>组织形成后，用4 mL ECT培养基浸没组织模具。 
	注：尽管细胞/基质在60分钟内已交联，但构建物仍非常脆弱。添加培养基时应轻柔，避免损伤组织。</li>
	<li>将组织培养14天，每天更换培养基。</li>
	<li>在ECT植入前，使用无菌精细镊子轻轻将ECT从加载柱上取下。 
	注：从模具中取出后的最终ECT尺寸小于原始模具尺寸。2.1 cm × 2.05 cm的模具可生成约1.5 cm × 1.5 cm的释放ECT；较大的3.9 cm × 4.05 cm模具可生成约3 cm × 3 cm的ECT。未加载的ECT在温热培养基中表现出内在的自发搏动。虽然其最初维持网状结构，但未加载的ECT会随时间收缩并致密化。可用精细镊子轻柔夹持组织，并使用7-0丝线将ECT缝合至心外膜。</li>
</ol>

<ol><li>Sanganalmath, S. K., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapy+for+heart+failure%3A+A+comprehensive+overview+of+experimental+and+clinical+studies%2C+current+challenges%2C+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Cell therapy for heart failure: A comprehensive overview of experimental and clinical studies, current challenges, and future directions.</a> Circulation Research. 113, 810-834 (2013).</li>
<li>Fisher, S. A., Doree, C., Mathur, A., Martin-Rendon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-Analysis+of+Cell+Therapy+Trials+for+Patients+With+Heart+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for Patients With Heart Failure.</a> Circulation Research. 116, 1361-1377 (2015).</li>
<li>Menasché, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+for+severe+heart+failure+treatment%3A+first+clinical+case+report%3A+Figure+1%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report: Figure 1.</a> European Heart Journal. 36, 2011-2017 (2015).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-engineered+cardiac+tissue+sheets+with+cardiomyocytes+and+vascular+cells+for+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-engineered cardiac tissue sheets with cardiomyocytes and vascular cells for cardiac regeneration.</a> Scientific Reports. 4, 6716(2014).</li>
<li>Masumoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+myocardial+regenerative+potential+of+three-dimensional+engineered+cardiac+tissues+composed+of+multiple+human+iPS+cell-derived+cardiovascular+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The myocardial regenerative potential of three-dimensional engineered cardiac tissues composed of multiple human iPS cell-derived cardiovascular cell lineages.</a> Scientific Reports. 6, 29933(2016).</li>
<li>Zimmermann, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+heart+tissue+grafts+improve+systolic+and+diastolic+function+in+infarcted+rat+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered heart tissue grafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts.</a> Nature Medicine. 12, 452-458 (2006).</li>
<li>Fujimoto, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+fetal+cardiac+graft+preserves+its+cardiomyocyte+proliferation+within+postinfarcted+myocardium+and+sustains+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineered fetal cardiac graft preserves its cardiomyocyte proliferation within postinfarcted myocardium and sustains cardiac function.</a> Tissue engineering. Part A. 17, 585-596 (2011).</li>
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<li>Bian, W., Liau, B., Badie, N., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+hydrogel+molding+to+control+the+3D+geometry+of+bioartificial+muscle+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic hydrogel molding to control the 3D geometry of bioartificial muscle tissues.</a> Nature protocols. 4, 1522-1534 (2009).</li>
<li>Zhang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+cardiac+patch+for+advanced+functional+maturation+of+human+ESC-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes.</a> Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).</li>
<li>Christoforou, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiac+progenitors+differentiate+to+cardiomyocytes+and+form+biosynthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiac progenitors differentiate to cardiomyocytes and form biosynthetic tissues.</a> PloS one. 8, 65963(2013).</li>
<li>Nakane, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Cell+Composition+and+Geometry+on+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells-Derived+Engineered+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Impact of Cell Composition and Geometry on Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Engineered Cardiac Tissue.</a> Scientific Reports. 7, 45641(2017).</li>
<li>Kowalski, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cardiomyocyte+Alignment+from+Three-Dimensional+%283D%29+Confocal+Microscopy+of+Engineered+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cardiomyocyte Alignment from Three-Dimensional (3D) Confocal Microscopy of Engineered Tissue.</a> Microscopy and Microanalysis. 1, (2017).</li>
</ol>

作者没有需要披露的财务或科学利益冲突。

在完成对线性结构的由人诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的工程化心肌组织（ECT）5的研究后，我们优化了实验方案，将hiPSC来源的心肌细胞（CMs）、内皮细胞（ECs）和心外膜细胞（MCs）混合，以促进ECT中血管细胞的体外扩增，并实现ECT与受体心肌组织之间的体内血管耦合。
为了促进可植入式大尺寸网格状工程化心肌组织（ECT）结构的构建，我们采用薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）板材设计了具有交错排列加载柱的三维模具。在初步实验中，我们发现ECT在凝胶收缩过程中会黏附于PDMS加载柱上，因此改进了方法，在每个模具表面涂覆表面活性剂泊洛沙姆（poloxamer），以防止细胞黏附，这是本实验方案中的关键步骤9。在体外成熟过程中，ECT保持与内部加载柱及模具底部不黏连，这有利于凝胶的收缩以及后续将ECT从模具中完整取出。本方案的另一个关键步骤是在细胞-凝胶基质混合物凝固之前，将其均匀地倒入PDMS模具中。该操作必须在短时间内完成。同时应避免混合物中产生气泡，因为气泡可能导致ECT结构出现空泡化并...

大量临床前研究和临床试验已证实基于细胞的心脏再生疗法对衰竭心脏的有效性1,2,3。在多种细胞类型中，人诱导性多能干细胞（hiPSCs）因其具有增殖能力、可分化为多种心血管谱系细胞4,5以及同种异体移植潜力，成为极具前景的细胞来源。此外，组织工程技术的发展使得将数百万个细胞递送至受损心脏成为可能5,6,7,8。
此前，我们报道了利用一种商业化的三维生物人工组织培养系统，由人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的心血管谱系细胞生成三维（3D）线性工程化心肌组织（ECTs）5,7。我们发现，ECTs中血管内皮细胞与壁细胞和心肌细胞共存，可促进组织在结构和电生理方面的成熟。此外，我们在免疫耐受的大鼠心肌梗死模型中验证了移植hiPSC-ECTs的治疗潜力，发现其可改善心脏功能、促进心肌再生并增强血管生成5。然而，通过该方法构建的线性ECTs为直径1 mm、长10 mm的圆柱体，因此不适合用于较大动物的临床前研究或临床应用。
基于组织模具在利用大鼠骨骼肌成肌细胞和心肌细胞9、人胚胎干细胞衍生的心肌细胞10以及小鼠诱导多能干细胞11生成多孔工程化组织方面的成功应用，我们开发了一种利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具制备可扩展的、由hiPSC衍生的大尺寸可植入组织的方案。我们评估了多种模具几何结构，以确定最有效的模具特性。与无孔或无连接结构的单层片状或线性结构相比，具有多个束状结构和连接点的网状工程化心肌组织（ECT）在细胞活力、组织功能和可扩展性方面表现出优异的特性。我们将网状ECT植入大鼠心肌梗死模型中，证实其具有与植入式圆柱形ECT相似的治疗效果12。本文中，我们详细描述了生成由hiPSC衍生的网状ECT的实验方案。

<table><tbody><tr><td>&lt;强&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿 100x20 mm 型</td><td>Falcon / Thomas Scientific</td><td>9380C51</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养多孔板 6 孔 50 个/箱</td><td>Falcon / Thomas Scientific</td><td>6902A01</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒</td><td>道康宁</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>创新细胞技术</td><td>AM-105</td><td></td></tr><tr><td>BMP4，重组（10&amp;micro;g)</td><td>R&amp;研发</td><td>RSD-314-BP-010</td><td></td></tr><tr><td>来自大鼠尾部的I型胶原蛋白溶液</td><td>Sigma</td><td>C3867</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型Matrigel</td><td>康宁</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>人源VEGF（165）IS，优级</td><td>Miltenyi</td><td>130-109-385</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127, 0.2 &amp;micro;m 过滤（水中 10% 溶液）</td><td>分子探针</td><td>P-6866</td><td></td></tr><tr><td>重组人bFGF</td><td>WAKO</td><td>060-04543</td><td></td></tr><tr><td>重组人/小鼠/大鼠 ActivinA (50&amp;micro;g)</td><td>R&amp;研发</td><td>338-AC-050</td><td></td></tr><tr><td>rh Wnt-3a（10&amp;micro;g)</td><td>R&amp;研发</td><td>5036-WN</td><td></td></tr><tr><td>Versene溶液</td><td>Gibco</td><td>15040066</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;培养基与添加剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11430</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>SIGMA</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>B27 补充剂（不含胰岛素）</td><td>Gibco</td><td>A1895601</td><td></td></tr><tr><td>DMEM，高糖</td><td>Gibco</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（500 ml）</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（500 ml）</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO₃</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1×</td><td>Gibco</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（5000 U/mL）</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 培养基</td><td>Gibco</td><td>21870092</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11900024</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;强&gt;流式细胞术&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗TRA-1-60，FITC，克隆号：TRA-1-60，BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560380</td><td></td></tr><tr><td>抗心肌肌钙蛋白T抗体，克隆：13-11，Thermo Scientific Lab Vision</td><td>Fisher</td><td>MS-295-P0</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS 清洁液</td><td>BD</td><td>340345</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSFlow 鞘液</td><td>BD</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSRinse 溶液</td><td>BD</td><td>340346</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带细胞过滤帽的Falcon管（每箱500个）</td><td>康宁</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（500 ml）</td><td>任何</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 可固定蓝色死细胞染色试剂盒（适用于405 nm激发）</td><td>分子探针</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRb；抗-CD140b，R-PE，克隆号：28D4，BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>558821</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47306-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>VEcad-FITC；抗CD144，FITC，克隆号：55-7H1，BD Biosciences</td><td>BD / Fisher</td><td>560411</td><td></td></tr><tr><td>Zenon Alexa Fluor 488 小鼠 IgG1 标记试剂盒</td><td>分子探针</td><td>Z25002</td><td></td></tr></tbody></table>

由人ips细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

Preparation of Mesh-Shaped Engineered Cardiac Tissues Derived from Human iPS Cells for In Vivo Myocardial Repair

本方案描述了一种可扩展的、网状工程化心肌组织（ECT）的制备方法，该组织由人诱导多能干细胞（hiPSC）分化而来的心血管细胞构成，旨在实现临床应用目标。将hiPSC来源的心肌细胞、内皮细胞和血管壁细胞与凝胶基质混合后，注入具有矩形交错柱结构的聚二甲基硅氧烷（PDMS）组织模具中。培养至第14天时，ECT成熟为1.5 cm × 1.5 cm的网状结构，包含直径为0.5 mm的肌纤维束。心肌细胞沿每束长轴方向排列，并能自发同步搏动。该方法可扩展至更大尺寸（3.0 cm × 3.0 cm）的网状ECT，同时保持组织结构的成熟度和功能。因此，由hiPSC来源心脏细胞生成的网状ECT可能适用于心脏再生研究范式。

图1A,B展示了CM+EC和MC方案的示意图。通过CM+EC方案诱导出心肌细胞（CMs）和内皮细胞（ECs），通过MC方案诱导出间质细胞（MCs）后，将细胞混合，并调整终末MC浓度，使其占总细胞数的10%至20%。2 cm宽的组织模具根据设计图纸，使用0.5 mm厚的PDMS片材制作而成（图2A,B）。将六百万个CM+EC+MC细胞与I型胶原蛋白混合形成基质，并浇注到预先涂有泊洛沙姆407（poloxamer 407）的组织模具中（图2C）。在初步实验中，我们制作了具有不同柱长和间距图案的组织模具，并确认了工程化心肌组织（ECTs）的最终几何形态（图3）。本研究选用柱长为7 mm、间隔宽度为2.5 mm的模具。
泊洛沙姆407可防止细胞黏附到模具上，并在14天内快速凝胶收缩后促进...

本方案旨在生成含有源自人诱导性多能干细胞的心血管细胞的网状工程化心肌组织，以用于心脏疾病细胞移植治疗的研究。

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本方案描述了生成可扩展的网状工程化心肌组织（ECTs）的方法，该组织由来源于心血管细胞的细胞构成……

本方案描述了一种新颖且简便的方法，用于制备源自人体诱导体细胞及干细胞来源心肌细胞的网状工程化心肌组织。该技术的主要优势在于组织几何形状的灵活性以及组织功能可扩展性。植入的网状工程化心肌组织可在大鼠心肌梗死模型中恢复心脏结构与功能。证实其在心脏再生治疗中应用的可行性。这些技术需要可重复的人类干细胞处理过程以及稳定的组织培养技能以获得一致的结果。首先，将固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片切割成适当尺寸，以便使用硅胶粘合剂将其粘合，制备一个21毫米×20.5毫米的矩形培养皿，内部设有交错排列的矩形支柱，支柱尺寸为长7毫米、宽0.5毫米、高2.5毫米。两排微柱之间的水平间距应为2.5毫米。在将模具用含1%泊洛沙姆407（Poloxamer 407）的PBS溶液包被前，需在120摄氏度下高压灭菌20分钟，包被时间为1小时。随后用PBS彻底冲洗模具，并将模具放入六孔板的一个孔中。进行谱系分析时，将心肌细胞、内皮细胞和血管壁细胞方案获得的细胞合并，使最终构建物中壁细胞的浓度占总细胞数的10%至20%，总细胞数为每构建物6×10⁶个细胞。在冰上，将133 µL酸溶性大鼠尾I型胶原溶液、17 µL碱性缓冲液与17 µL 10×最低必需培养基混合。然后向胶原溶液中加入67 µL基底膜基质。接着，离心细胞并将沉淀重悬于167 µL高糖Dulbecco最低必需培养基中，该培养基需添加胎牛血清和抗生素。将细胞与基质溶液在冰上混合。然后，将400微升细胞基质悬液小心地倒入涂有泊洛沙姆407的PDMS组织模具中。将细胞基质混合物置于标准细胞培养孵育箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育60分钟。组织形成后，用4毫升ECT培养基小心浸没模具，并将培养板放回细胞培养孵育箱中继续培养14天。在植入 ECT 之前，您需对精细镊子进行灭菌，以小心地将 ECT 从装载柱上取下。组织模具可通过不同的图案、柱体长度和柱间距来制造，从而生成不同最终 ECT 几何形状的结构。本分析中使用的模具具有 7 毫米长的柱体，间隔宽度为 2.5 毫米。泊洛沙姆407可防止细胞黏附于模具，并在14天内快速凝胶收缩后形成特征性的网状结构。即使在工程化角膜组织从模具中释放后，该结构仍能保持稳定。所制备的组织构建体宽度约为1.5厘米，厚度约为0.5毫米。网格中每个束的宽度平均约为 0.5 毫米。使用尺寸大四倍且具有相同交错柱设计的模具，可制备出最终宽度为 3 厘米、包含 2400 万个细胞的网格 ECT。这种更大的网格 ECT 同样可轻松从模具中取出，并产生与较小尺寸网格 ECT 相当的局部作用力。将细胞基质混合物均匀倒入组织模具中时，必须避免产生气泡，以防止最终凝胶中出现结构缺陷。可使用内置系统对收缩功能特性以及第四频率关系进行功能表征。我们的最终目标是将电休克治疗（ECT）范式转化为利用大型动物临床前研究的临床疗法。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

从人体 iPS 细胞中提取的网状工程心脏组织用于活体心肌修复

从脱细胞组织制备可注射基质凝胶并将其注射入大鼠心肌的方法 体内...

用于心肌组织工程的生物来源可注射材料的制备

生成排列整齐的心肌组织是将干细胞生物学的最新进展应用于临床实用目的的关键要求。本文中，我们描述了一种微接触印刷技术，可精确控制细胞形态与功能。利用高度纯化的胚胎干细胞来源的心脏前体细胞，我们进而生成了各向异性的功能性心肌组织。...

通过微接触印刷技术生成取向功能性心肌组织

本论文描述了利用表面标志物表达和细胞分选技术构建明确组成的工程化心肌组织的方法。这些明确组成的心肌组织随后可用于多组织生物反应器，以研究心脏细胞治疗的机制，从而提供一个具有功能性且可控的人类心脏模型系统。...

构建定义明确的人源工程化心肌组织以研究心肌细胞治疗机制

我们提出了三种新颖且更高效的方案，用于将人诱导性多能干细胞分化为心肌细胞、内皮细胞和平滑肌细胞，并提供了一种递送方法，通过结合细胞注射与补片介导的细胞因子递送，提高移植细胞的定植效率。...

多能干细胞来源的心脏细胞用于心肌修复

本方案描述了一种基于网状模具的方法，用于构建具有满意结构完整性和同步搏动行为的三维无支架心肌组织。...

一种基于网状模具的无支架三维心脏组织构建方法

本文介绍了一种在豚鼠模型中诱导左心室冷冻损伤，随后植入来源于人诱导多能干细胞心肌细胞的心肌补片的实验方案。...

在豚鼠模型心肌损伤后植入人诱导多能干细胞来源的心肌补片

本文介绍一种易于使用的3D自组装心脏微组织阵列制备方法，该阵列由预先分化的人诱导多能干细胞来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞组成。这种操作简便且所需细胞量少的心脏微组织制备技术，可用于疾病建模及药物研发的早期阶段。...

利用人iPSC来源的心肌细胞、心脏成纤维细胞和内皮细胞构建三维心脏微组织阵列

本实验方案旨在介绍并演示一种高度定向的人类心肌组织三维（3D）微流控模型的构建方法。该模型由干细胞来源的心肌细胞与心脏成纤维细胞（CFs）在仿生性胶原基水凝胶中共培养形成，可用于心肌组织工程、药物筛选及疾病建模等应用。...

在微流控平台上构建三维有序的人类心脏组织

本文介绍了一组从人诱导性多能干细胞衍生的心肌细胞在高通量、多维度培养条件下生成心脏类球体（CSs）并进行冷冻保存的实验方案。该三维模型可作为疾病建模和高通量筛选的可靠平台，并在冷冻保存后仍能维持其功能特性。...

人诱导多能干细胞来源心脏类球体的生成、高通量筛选与生物样本库保存

利用光来控制心肌细胞和组织可实现非接触式刺激，从而保持细胞的自然状态和功能，这一方法在基础研究和治疗应用中均具有重要价值。...

一种用于通过非遗传性光学刺激研究钙离子（Ca2+）传导的心脏微生理系统

本文介绍了一种可重复的方法，通过结合熔融电纺写入（MEW）法制备的聚己内酯（PCL）支架、纤维蛋白水凝胶以及人诱导多能干细胞来源的心肌细胞和成纤维细胞，生成三维心肌组织。该技术可精确控制支架结构，适用于临床前药物筛选和心脏疾病建模。...

利用聚己内酯支架的熔融静电纺丝书写技术与人诱导多能干细胞来源的心脏细胞生成三维人心肌组织

学习利用人诱导多能干细胞制备网状工程心脏组织的方法，用于大鼠心肌梗死模型中的心脏再生治疗。该技术具有几何灵活性高、功能可扩展的优势，为心肌修复提供了可靠的实验方案。

由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

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