由人iPS细胞衍生的网格状工程化心肌组织制备及其在体内心肌修复中的应用

本方案描述了一种新颖且简便的方法，用于制备源自人体诱导体细胞及干细胞来源心肌细胞的网状工程化心肌组织。该技术的主要优势在于组织几何形状的灵活性以及组织功能可扩展性。植入的网状工程化心肌组织可在大鼠心肌梗死模型中恢复心脏结构与功能。

证实其在心脏再生治疗中应用的可行性。这些技术需要可重复的人类干细胞处理过程以及稳定的组织培养技能以获得一致的结果。首先，将固化的聚二甲基硅氧烷（PDMS）片切割成适当尺寸，以便使用硅胶粘合剂将其粘合，制备一个21毫米×20.5毫米的矩形培养皿，内部设有交错排列的矩形支柱，支柱尺寸为长7毫米、宽0.5毫米、高2.5毫米。

两排微柱之间的水平间距应为2.5毫米。在将模具用含1%泊洛沙姆407（Poloxamer 407）的PBS溶液包被前，需在120摄氏度下高压灭菌20分钟，包被时间为1小时。随后用PBS彻底冲洗模具，并将模具放入六孔板的一个孔中。

进行谱系分析时，将心肌细胞、内皮细胞和血管壁细胞方案获得的细胞合并，使最终构建物中壁细胞的浓度占总细胞数的10%至20%，总细胞数为每构建物6×10⁶个细胞。在冰上，将133 µL酸溶性大鼠尾I型胶原溶液、17 µL碱性缓冲液与17 µL 10×最低必需培养基混合。

然后向胶原溶液中加入67 µL基底膜基质。接着，离心细胞并将沉淀重悬于167 µL高糖Dulbecco最低必需培养基中，该培养基需添加胎牛血清和抗生素。将细胞与基质溶液在冰上混合。

然后，将400微升细胞基质悬液小心地倒入涂有泊洛沙姆407的PDMS组织模具中。将细胞基质混合物置于标准细胞培养孵育箱中，在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育60分钟。组织形成后，用4毫升ECT培养基小心浸没模具，并将培养板放回细胞培养孵育箱中继续培养14天。

在植入 ECT 之前，您需对精细镊子进行灭菌，以小心地将 ECT 从装载柱上取下。组织模具可通过不同的图案、柱体长度和柱间距来制造，从而生成不同最终 ECT 几何形状的结构。本分析中使用的模具具有 7 毫米长的柱体，间隔宽度为 2.5 毫米。

泊洛沙姆407可防止细胞黏附于模具，并在14天内快速凝胶收缩后形成特征性的网状结构。即使在工程化角膜组织从模具中释放后，该结构仍能保持稳定。所制备的组织构建体宽度约为1.5厘米，厚度约为0.5毫米。

网格中每个束的宽度平均约为 0.5 毫米。使用尺寸大四倍且具有相同交错柱设计的模具，可制备出最终宽度为 3 厘米、包含 2400 万个细胞的网格 ECT。这种更大的网格 ECT 同样可轻松从模具中取出，并产生与较小尺寸网格 ECT 相当的局部作用力。

将细胞基质混合物均匀倒入组织模具中时，必须避免产生气泡，以防止最终凝胶中出现结构缺陷。可使用内置系统对收缩功能特性以及第四频率关系进行功能表征。

我们的最终目标是将电休克治疗（ECT）范式转化为利用大型动物临床前研究的临床疗法。