一种用于研究伤口诱导多倍体化的 Drosophila 模型

该方案可用于研究伤口诱导的多倍体现象。这是一种保守的组织修复过程，在成年果蝇中，细胞通过生长而非分裂来实现修复。通过制造一个简单的穿刺伤口，可在短短两天内在果蝇上皮组织中诱导出多倍体细胞。

随后可轻松评估上皮细胞的大小、倍性及排列情况。首先准备两个小瓶，每瓶装有10至15只新羽化的雌性果蝇（所关注的品系），并在新鲜培养基小瓶中于25摄氏度下继续培养，每瓶加入约5只雄蝇，培养至果蝇3至5日龄。

对于腹部创伤，在孵育结束时，使用一根0.1毫米的不锈钢针组装多个针固定装置，使每根针的尖端向外突出。在体视显微镜下，将老龄雌性果蝇置于二氧化碳麻醉垫上进行麻醉，并用毛笔将果蝇排列成一行。

佩戴安全眼镜，一手持针 holder，另一手持镊子，用镊子将果蝇腹面朝上放置。随后在腹侧中线两侧的目标 A4 区域的上皮蓝色右侧区域刺穿成年雌性果蝇，刺伤后将受伤的果蝇放回培养管中，直至达到预定的实验时间点。在实验终点时，在体视显微镜下检查每只麻醉果蝇是否存在伤口及疤痕，并在九孔玻璃解剖皿中的一孔内加入 Grace's 溶液。

使用镊子夹住受伤雌蝇胸部的背侧，将果蝇浸入溶液孔中。另一只手用第二把镊子在果蝇后部目标A6节段下方刺穿并移除背侧表皮。若未完全取出内脏器官，可对腹部背侧施加压力，挤出剩余组织。

用镊子在目标 A2 上方的胸部连接处折断整个腹部，并将腹部转移至含有约 100 微升 Grace 溶液的孔中。当所有腹部组织收集完毕后，将收集孔中的 Grace 溶液体积减少至 30 微升。用一只手的镊子将腹部背侧朝下固定，另一只手将威尼斯弹簧剪的下部刀片插入每个腹部的腹腔，沿背侧中线剪开，直至腹部完全打开。

向每个腹部固定区域的干燥解剖板上加入 30 微升 Grace 溶液，每个区域使用 4.1 毫米的固定针，并将剖开的腹部组织置于溶液液滴中。当所有腹部组织均完成剖开并放置后，用针将腹部组织固定在培养皿的四个背侧角上，注意使组织平展，避免撕裂或过度拉伸腹部组织。

然后用 30 微升固定液替换每个封片区域的 Grace 溶液。并在每个培养皿底部贴上标签胶带，标记对照组和实验组。以封片果蝇组织样品。

染色后，在体视显微镜下用镊子将腹部组织从解剖板上取下。用镊子夹住每个样本的背侧，将其转移至载玻片上约30微升封片介质的液滴中。在体视显微镜下调整腹部组织的方向，使组织内面朝下紧贴盖玻片，并用镊子将已定向的腹部组织拉至每个介质液滴的边缘。

将每张已固定的盖玻片放置在标记好的载玻片上，并用实验室纸巾去除多余的封片剂。然后用透明指甲油密封盖玻片边缘，并将载玻片置于载玻片盒中，在4摄氏度下保存，直至成像。

标记细胞间连接的隔膜连接蛋白Fast three可作为制备过程中是否发生处理干扰的指标。若腹部出现大面积划痕或未染色区域，干扰了伤口区域，则必须弃除，不得纳入分析。当中央出现一个大的多核细胞覆盖伤口痂皮时，表明伤口修复已完成。

上皮层中大于10微米的间隙被视为伤口闭合和再上皮化的缺陷。在此项代表性分析中，使用有丝分裂细胞活化受抑制的果蝇，52%的伤口无法在伤口痂上形成连续的上皮层。该膜伤口愈合实验可进一步提供有关伤口修复缺陷程度的信息，从而将再上皮化缺陷分为完全开放、部分闭合或完全闭合三类。

例如，在本实验中，通过同时抑制内复制和细胞融合来阻断伤口诱导的多倍化，导致92%的上皮伤口完全无法闭合。而有丝分裂细胞周期的激活则导致上皮伤口闭合缺陷。此外，通过掺入胸腺嘧啶类似物EDU检测细胞周期活性，并通过直接测量细胞核DNA含量确定上皮细胞的倍性。

在分离腹部上皮组织时，注意不要用解剖工具触碰组织，以免划伤样本。解剖后可进行细胞增殖、细胞死亡、细胞丢失、切口大小或细胞核DNA含量等评估，以更深入地理解伤口诱导的多倍体现象或其他上皮内过程。