使用定义的分化系统从多能干细胞的肝祖原体规范
2020年5月10日
本文的目标是提供一种标准化的方法，诱导人类肝祖细胞与多能干细胞的分化。这种程序的开发与即用媒体配方为用户提供了一个方便的系统，以产生人类肝细胞的生物医学研究和翻译。
该方案提供了一种干细胞衍生的肝脏分化系统，为基础和临床研究的肝脏生物学研究提供了可重复的工具。通过将标准化且易于遵循的方案与现成的培养试剂相结合，该系统允许大规模生产肝祖细胞和肝细胞样细胞。将人多能细胞维持在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳的 10 厘米培养皿中，溶于层粘连蛋白-531，每天每培养皿喂食 10 毫升干细胞维持培养基。
为了制备层粘连蛋白 521 板，将解冻的层粘连蛋白 521 在含钙和镁的冰冷 DPBS 中稀释至终浓度为 8 微克/毫升。向 24 孔板的每个孔中加入 250 微升层粘连蛋白溶液，或向 96 孔板的每个孔中加入 50 微升层粘连蛋白溶液。轻轻地左右摇动板以均匀地涂覆孔，然后用半透明的柔性薄膜密封板并在 4 摄氏度下存放过夜。
在细胞接种当天，将预包被的板在细胞培养箱中加热 30 至 60 分钟。吸出层粘连蛋白 521 溶液，并向每个孔中加入补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂的干细胞维持培养基，然后将板放回培养箱中。当细胞计数流畅度达到 70% 至 80% 时，从培养皿中吸出用过的培养基，并在室温下用 5 毫升不含钙或镁的 DPBS 洗涤每个培养皿。
从培养皿中吸出 DPBS 洗涤液，然后向培养皿中加入 5 毫升无酶解离试剂，并在 37 摄氏度下孵育板 8 至 10 分钟，直到细胞明显从培养皿中分离。用细胞刮刀轻轻地将细胞从培养皿中分离出来，然后用 5 毫升血清移液管上下移液每个孔的内容物，以产生单细胞悬液。对于每种细胞系，将所有维护孔中的细胞汇集到无菌 50 mL 试管中。
用 5 毫升这些干细胞维持培养基洗涤每个空的培养皿，并将洗涤液添加到装有混合细胞的相应试管中。对每个混合样品进行 3 次活细胞计数。将混合样品以 250 x g 离心 5 分钟。
然后吸出上清液，将细胞重悬于 1 至 3 毫升室温下，作为补充有 10 微摩尔 ROCK 抑制剂 Y27632 的干细胞维持培养基。在计算出达到所需接种密度所需的细胞数后，将细胞重悬至适当的浓度，并将其分配到预包被的板中。对于 24 孔板，每孔的总体积应为 1 毫升，对于 96 孔板，每孔的总体积应为 0.1 毫升。
轻轻地左右和来回摇动板，以确保细胞均匀分散，然后将接种板放入培养箱中，来回和左右摇动。如文本手稿中所述，为确定性内胚层诱导和随后的肝祖细胞规格分化准备培养基。在分化的第一天，从孔中取出用过的培养基，并用第一阶段的培养基代替。
在第 2 天、第 3 天和第 4 天，取出用过的培养基，并用第一阶段培养基 2 喂养每个孔。第 5 天，固定用于确定性内胚层分化分析的孔。对于剩余的孔，取出用过的培养基，并用 stem diff hepatic progenitor 培养基填充每个孔。
在第 10 天，收获细胞用于肝祖细胞分化分析或进行进一步的肝细胞样细胞分化。为了表征肝祖细胞分化培养物，使用免疫染色检测第 5 天确定的内胚层特异性标志物的表达，第 10 天检测肝祖细胞特异性标志物的表达，并量化 HNF4 α 阳性细胞的百分比。第 10 天，还通过 ELISA 测量甲胎蛋白和白蛋白分泌。
该方案用于区分来自人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的肝祖细胞。在分化方案的第 5 天，通过 Sox 17 表达评估确定的内胚层规格。在两种细胞系中，Sox 17 分别高表达 80% 和 87.8% 的 H9 和 P106 阳性细胞。
第 10 天，肝祖细胞表现出鹅卵石样形态。此外，还评估了 HNF4 α 、 AFP 、 白蛋白 和 细胞角蛋白 19 表达的肝祖细胞规格。两种肝祖细胞培养物都表达胎儿肝脏标志物，例如 HNF4 α 、 AFP 和 CK 19。
在两个细胞系中，第 10 天均检测到甲胎蛋白分泌，而 ELISA 未检测到白蛋白分泌。通过定量 HNF4 α 表达来评估细胞数量变异性和肝祖细胞分化效率。在第 10 天，肝祖细胞在行间没有显著差异，H9 和 P106 每孔的 HNF4 α 阳性细胞分别超过 95% 和 97%。
分化开始前均匀的细胞分布是确保肝祖细胞群均匀的关键。为此，轻轻地左右和来回摇动板，以确保细胞均匀分散。通过该方案产生的肝祖细胞可以进一步分化为肝细胞样细胞用于其他测定，为疾病建模或药物筛选提供可重复的标准化工具。
概述
本文介绍了一种从多能干细胞诱导人类肝脏前体细胞分化的标准化协议，提供了一个生成人类肝细胞的可访问系统。该方法包含即用型培养基配方，便于大规模生产肝脏前体细胞和肝细胞样细胞以用于生物医学应用。
关键研究组成部分
研究领域
- 干细胞生物学
- 肝脏再生和疾病建模
- 转化医学
背景
- 研究中可靠的肝脏分化方法的重要性
- 当前生成肝细胞的挑战
- 在药物测试和再生医学中的潜在应用
所用方法
- 人类多能干细胞的标准化分化协议
- 使用人类胚胎干细胞和诱导多能干细胞
- 免疫染色和ELISA用于细胞表征
主要结果
- 确认了确定性内胚层和肝脏前体标志物的高表达
- 显示了稳定和可重复的肝脏前体细胞生产
- 通过测量甲胎蛋白分泌的检测突出了高效的分化
结论
- 开发的协议为肝脏生物学研究提供了一个强大的工具
- 为研究肝功能和疾病提供了新的途径
常见问题解答
Executive Industry Relevance
This protocol enables scalable, reproducible generation of human hepatic progenitor cells from pluripotent stem cells, addressing the critical need for renewable liver cell sources in drug discovery and disease modeling. By standardizing differentiation across cell lines and culture formats, it reduces variability in preclinical assays and supports target validation in hepatotoxicity and metabolic disease programs. The system enhances predictive confidence in early discovery by providing a defined, scalable platform for mechanistic de-risking of liver-related targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hepatic lineage specification and pathway modulation in a human-relevant system.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible method for generating hepatic progenitors across hESC and hiPSC lines.
- Predictive Value: Supports functional target validation through consistent expression of hepatic markers like HNF4 alpha and AFP.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces hepatocyte-like cells with measurable secretory functions (e.g., AFP) for functional assay development.
- Operational Value: Uses off-the-shelf reagents and defined media to ensure assay standardization and scalability.
- Predictive Value: Enables reliable compound screening via homogeneous cell populations with >95% HNF4 alpha positivity.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models fetal hepatic marker expression relevant to disease mechanisms and developmental toxicity.
- Operational Value: Allows seamless progression from progenitor to hepatocyte-like states for longitudinal preclinical studies.
- Predictive Value: Supports risk-adjusted advancement by providing quantifiable differentiation efficiency metrics.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from stem cell-based target validation through assay development to preclinical efficacy and safety testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of hepatic lineage commitment and transcriptional regulation.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible hepatic progenitor cells for compound library screening.
- Analytics: Enables quantitative readouts via immunostaining (HNF4 alpha, AFP, CK19) and ELISA (AFP secretion) for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical validation through staged differentiation and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable differentiation platform applicable across multiple liver-focused projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in liver biology models through marker-defined, low-variability cell populations.
- Operational Value: Ensures standardization, reproducibility, and scalability across users and culture formats.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological noise in hepatotoxicity and metabolism assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of liver-targeted candidates based on consistent progenitor differentiation outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in pluripotent stem cell culture and differentiation techniques.
- Dependent on laminin coating, defined media formulations, and ROCK inhibitor supplementation.
- Necessitates standardized cell seeding and dispersion protocols to ensure homogeneity.
- Requires adaptation of timing and media for different pluripotent stem cell lines.
- Limited by the absence of albumin secretion at day 10, indicating incomplete maturation for certain hepatocyte functions.
