一种用于自动化和标准化制造基于水凝胶的三维培养模型的开源技术平台

生物医学研究正面临可重复性危机，因为新的研究发现很少能转化为治疗应用。本方案通过减少人为因素，引入自动化和标准化制造流程。该方法特别关注用于三维细胞培养的光交联水凝胶，因为在过去十年中，水凝胶已成为癌症及其他疾病组织模型中最常用的技术平台。

我们通过开发一个开源技术平台，成功解决了当前的硬件和软件限制。该平台专为水凝胶设计，可实现组织工程研究中的自动化制造工作流程。要安装应用程序编程接口（API），请打开命令行界面。

要安装 work API，请输入 pip install openworkstation 并按 Enter 键。要操作移液生物制造模块，请输入命令安装 opentrons API。然后使用命令行打开 Python 脚本，验证两个 API 是否均已成功安装。

要生成协议代码，请打开协议设计应用程序，以生成将由平台执行的自定义协议脚本。该界面可在所有常用互联网浏览器上运行。在设置页面输入协议名称，然后点击继续。

在输入托盘设置中，选择 3×4 加热块以定义输入托盘。为定义材料和储备浓度，在“定义输入”菜单中选择 Gel 1，并将名称设为 GelMA。将储备浓度设为 20%，样本数量设为 3，然后点击“添加”以保存条目并填充第一列。

从“定义输入”菜单中选择凝胶2，并输入名称为海藻酸钠。将储备浓度设置为4%，样本数量设置为3，然后点击“添加”以保存条目并填充第二列。在按照示例设置光引发剂和稀释剂参数后，选择光交联，将时间设置为30秒，强度设置为2，然后点击“确定”。接下来，将孔板类型设置为96孔板，点击“第1组”，以设定制备双网络水凝胶的参数。

如有需要，勾选“应用高级混样程序”复选框，将样本数量设置为96，然后点击继续。设置工作台布局时，为每个槽位选择相应的托盘类型。当所有托盘类型选择完毕后，点击“左侧移液器”复选框，在下拉菜单中选择10至100微升正向置换移液器。

将吸液速度设为600，排液速度设为800。然后以相同方式设置移液器的正确参数。接着点击“生成方案”以生成并保存方案脚本。

在执行方案之前，用70%乙醇喷洒耗材，并根据用户设置中定义的布局进行摆放。根据所选设置，将装有材料的反应管放入铝块中，并置于温控模块上。接着，用70%乙醇喷洒手套，小心打开反应管，避免触碰已开启的管口。

当物质达到适当的实验温度后，通过用户界面运行生成的程序。工作站将首先执行归位过程，随后从存储模块中取出一个空的孔板。移除孔板盖后，孔板将被转运至下一个模块。

该方案规定了从每种储备液中移取的体积，并在每次更换试剂后自动更换移液头，以防止交叉污染。为了以可重复的方式混合黏性溶液，工作站执行一种针对黏性水凝胶优化的特定混合程序。方案设计应用程序会考虑储液槽的填充液位，并自动调整混合高度，以避免过度浸入黏性材料中。

在自动生成3D模型和孔板后，工作站会再次用盖子封闭孔板，并将孔板存放到存储模块中预设的位置。当程序运行结束后，从存储模块中取出孔板。为验证和确认所执行的程序，将孔板放入分光光度计中，在450纳米波长下两次读取吸光度值。

保存吸光度值后，打开作为出版物补充材料提供的分析电子表格文件，并将吸光度读数复制到“原始数据”工作表的表格中。然后点击“分析”工作表，查看自动计算并显示的均值、标准差和变异系数，这些数值用于评估96孔板中特定行和特定列的样品分布均匀性。为了确定甘油溶液高重复性的最佳设置，实验设计了以下几种方案：无温度控制且不接触孔壁移液；有温度控制但不接触孔壁移液；以及有温度控制并结合接触孔壁移液。

三种实验设置下计算得到的变异系数值表明，温度支架和吸头触碰功能对结果具有显著影响，凸显了在同时使用这两项功能时，该方案能够产生高度可重复的结果。在设置三中，结合使用吸头触碰功能与温度支架，标准差显著降低。对设置三的样品吸光度值进行绘图显示，整个实验过程中吸光度值无上升或下降趋势，因此表明样品位置对吸光度值无影响。

接下来，通过稀释20% GelMA储备液制备一系列不同浓度的GelMA溶液，并评估不同稀释浓度之间的差异。在各个浓度梯度下测得的吸光度值均存在显著差异，线性回归分析显示具有很高的拟合度，证实了可成功生成不同浓度梯度的溶液。此外，还评估了移液尖端接触对双网络水凝胶的影响，所用的水凝胶成分为5% GelMA、2%海藻酸钠和0.15% LAP，均由该装置自动制备。

整合尖端触碰操作可显著降低标准偏差，有助于生成可重复的数据集。吸光度值和热图的可视化结果证实，在使用尖端触碰去除移液尖端多余材料时，偏差明显减小。我们的技术实现了用于三维细胞培养和组织工程的水凝胶制备的自动化。

这是一种低成本的解决方案，可提高技术上具有挑战性的工作流程的通量和可重复性。通过提供可定制的开源方法，该技术为组织工程研究中广泛采用工艺自动化铺平了道路。