Name: 用于神经元细胞贩运研究的管子中纯化和直接单生物素重组BDNF的改进协议 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 了解利用HEK293细胞转染和亲和层析柱纯化技术制备重组脑源性神经营养因子（BDNF）并进行单生物素标记的优化方案。该方法可高效获得具有生物活性的BDNF，适用于神经元细胞贩运研究的荧光显微成像实验。

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作者衷心感谢以下机构提供的经费支持：Fondecyt（1171137）（FCB）、科学与技术基础卓越中心（AFB 170005）（FCB）、千禧年中心（P07/011-F）（FCB）、惠康信托资深研究员奖（107116/Z/15/Z）（GS）以及英国痴呆症研究中心基金会资助（GS）。本研究得到了天主教大学先进显微镜单元（UMA UC）的支持。

所有实验均按照智利国家科学技术研究委员会（CONICYT）批准的指南进行。本研究中使用的方案已获得智利天主教大学生物安全、生物伦理与动物福利委员会的批准。涉及脊椎动物的实验已获得智利天主教大学生物伦理与动物福利委员会的批准。
注意：以下方案旨在从 HEK293 细胞产生的 500 mL 条件培养基总体积中纯化 BDNFAvi。用于纯化 BDNFAvi 的条件培养基的制备和处理量可根据需要进行放大或缩小。但在这些情况下，可能需要进一步优化。本方案中所用培养基和缓冲液的组成详见补充材料。&#160;
1. 从 HEK293 条件培养基中生产和纯化 BDNFAvi
<ol>
	<li>HEK293 细胞的转染
	<ol>
		<li>在 37 ºC 条件下，使用添加补充剂的 DMEM 培养基（10% 胎牛血清、1× 谷氨酰胺补充剂、1× 抗生素/抗真菌剂）将 HEK293 细胞培养至 15 cm 培养皿中细胞融合度达到 70%。</li>
		<li>将培养基更换为转染缓冲液。</li>
		<li>配制用于转染的 PEI-DNA 混合物。使用两个不同的 15 mL&#160;锥形管分别稀释 DNA 和 PEI 25K。在一个管中将 20 μg 质粒 DNA 稀释至终体积为 500 μL；在另一个管中将 60 μg 线性 PEI 25K 稀释至终体积为 500 μL。室温孵育 5 分钟。&#160;</li>
		<li>小心地将 DNA 溶液用移液器滴加到 PEI 管中，通过上下吹打混合一次。室温孵育 25 分钟。&#160;</li>
		<li>将 1 mL PEI-DNA 混合物均匀滴加至每个 15 cm 培养皿中。在 37 ºC 条件下用 PEI-DNA 混合物孵育细胞 3 小时。</li>
		<li>将培养基更换为新鲜的孵育缓冲液。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基的收集与保存
	<ol>
		<li>在 HEK293 细胞转染后 48 小时，收集所有培养皿中的培养基。配制 补充文件 1 中“上清液修饰缓冲液”部分所述溶液的浓缩储备液，并将其加入 HEK293 上清液中，以达到所列的终浓度。 
		注意：细胞可丢弃或回收用于进一步分析。</li>
		<li>将培养基置于冰上孵育 15 分钟。&#160;</li>
		<li>将培养基分装至离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 条件下，以 10,000 x g 离心 45 分钟。此步骤可去除培养基中悬浮的细胞碎片和死亡细胞。&#160;</li>
		<li>收集上清液，加入牛血清白蛋白（BSA），使其终浓度为 0.1%，然后于 -20 °C 保存。在纯化步骤前可先将培养基分装冷冻，以便更快解冻。 
		注意：冷冻条件培养基储存时间最长达 2 个月时仍可获得良好结果，更长时间的储存效果尚未评估。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>培养基的浓缩与纯化&#160;
	<ol>
		<li>在 37 °C 恒温水浴中解冻培养基。</li>
		<li>将培养基分装至离心管中。&#160;</li>
		<li>在 4 °C 预冷的离心机中以 3,500 x g 离心 1 小时。此步骤可去除残留的细胞碎片，确保色谱柱的适当流速。</li>
		<li>使用截留分子量为 10 kDa 的蛋白浓缩装置，将 500 mL 培养基浓缩至 100 mL。按照制造商推荐的离心参数进行操作，以实现最佳浓缩效果。</li>
		<li>向浓缩后的培养基中加入 500 μL Ni-NTA 琼脂糖珠，于 4 °C 摇床上孵育过夜。&#160;</li>
		<li>组装色谱装置，并将培养基倒入其中。静置 5 分钟后打开双向旋塞，使培养基流过柱子。</li>
		<li>用 5 mL 洗涤缓冲液洗涤珠子 5 分钟。确保在柱内充分重悬珠子。打开双向旋塞排出洗涤缓冲液。重复此步骤 3 次。</li>
		<li>向柱中加入 1 mL 洗脱缓冲液。确保在柱内充分重悬珠子。孵育 15 分钟后，将洗脱液收集至 1.5 mL 微量离心管中。为实现 BDNFAvi 的完全洗脱，重复此步骤 3 次。</li>
		<li>将每次洗脱液各取 5 μL，以及市售 BDNF 的不同浓度样品（40–160 ng），上样至 15% 聚丙烯酰胺凝胶中。使用抗 BDNF 抗体通过 Western 印迹法检测纯化蛋白。&#160;</li>
		<li>利用市售 BDNF 制备的标准浓度曲线，测定每次洗脱液中纯化 BDNFAvi 的浓度。</li>
		<li>将纯化的 BDNFAvi 分装后于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 体外 利用BirA酶对BDNFAvi进行单生物素标记
<ol>
	<li>体外单生物素化反应&#160;
	<ol>
		<li>配制生物素化缓冲液试剂的浓缩储备液。使用浓缩储备液可最大限度减少重组蛋白的稀释。&#160;</li>
		<li>取800 ng的BDNFAvi，加入生物素化缓冲液试剂以及与BDNF摩尔比为1:1的BirA酶。例如，对于终体积为200 μL的反应体系，加入：含800 ng BDNFAvi的溶液100 μL、0.5 M pH 8.3 Bicine 20 μL、100 mM ATP 20 μL、100 mM MgOAc 20 μL、500 μM d-生物素 20 μL、0.8–1 μg（或1 μL）BirA-GST，并用超纯水定容至200 μL。&#160; 
		注意：已成功使用含约30 ng/μL BDNFAvi的400 μL样品进行生物素化反应，最终获得均一单生物素化的BDNFAvi，终浓度约为20 ng/μL。</li>
		<li>将反应混合物在30 °C杂交炉中孵育1小时，每15分钟轻轻翻转管子混匀内容物。&#160;</li>
		<li>按照步骤2.1.2中相同的体积加入ATP和BirA，并重复步骤2.1.3。&#160;</li>
		<li>反应产物可储存于-80 °C以备后续分析，或暂时置于冰上立即使用（例如进行生物素化质量控制）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生物素化分析
	<ol>
		<li>每份BDNF样品使用30 μL链霉亲和素磁珠，加入1 mL封闭缓冲液中进行封闭。在室温下，于微量离心管旋转仪中孵育1小时。&#160;</li>
		<li>使用磁力分离架沉淀磁珠3至5分钟，或直至上清液完全澄清&#160;，弃去封闭缓冲液。</li>
		<li>向磁珠中加入50 μL新鲜封闭缓冲液和80 ng单生物素化的BDNFAvi（mbtBDNF）样品，通过移液确保磁珠完全重悬。</li>
		<li>在4 °C下，以约20 RPM的速度于微量离心管旋转仪中孵育1小时&#160;。&#160;</li>
		<li>使用磁力分离架收集磁珠3至5分钟，收集上清液，并保留30 μL用于分析。</li>
		<li>用500 μL PBS洗涤磁珠一次，然后使用磁力分离架收集磁珠3至5分钟。回收上清液，并保留30 μL用于分析。&#160;</li>
		<li>向磁珠中加入10 μL 4×上样缓冲液。</li>
		<li>将样品在97 °C加热7分钟，以洗脱mbtBDNF。&#160;</li>
		<li>使用抗BDNF特异性抗体检测mbtBDNF19。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. mbtBDNF 生物学活性的验证
<ol>
	<li>通过蛋白质印迹法检测 pTrkB 和 pERK。
	<ol>
		<li>在 60 mm 培养皿中接种 200 万个大鼠皮层神经元。&#160;</li>
		<li>将神经元培养 7 天（DIV7）。实验开始时，更换为无添加物的 Neurobasal 培养基。</li>
		<li>更换培养基 1 小时后，加入 mbtBDNF 至终浓度为 50 ng/mL。在 37 ºC 下孵育 30 分钟。设置阴性对照组（未用 BDNF 刺激）和阳性对照组（用 50 ng/mL 商业来源的 BDNF 处理）。</li>
		<li>收集培养基，并用 1× PBS 轻柔洗涤每个培养皿。收集并弃去 1× PBS。</li>
		<li>将培养皿置于冰上，向每个培养皿中加入 50–80 μL 裂解缓冲液。使用细胞刮棒裂解细胞。&#160; 
		注意：裂解步骤应尽快完成，以避免蛋白质去磷酸化和降解。剧烈刮取 1–2 分钟足以在蛋白质印迹中观察到目标蛋白。&#160;</li>
		<li>收集裂解液，并在涡旋振荡器上以最高速度振荡 5 秒。</li>
		<li>将裂解液在 14,000 × g（4 °C）条件下离心 10 分钟，收集上清液。</li>
		<li>使用 BCA 蛋白定量法20测定上清液中的蛋白含量&#160;。</li>
		<li>向每种条件含 30–50 μg 蛋白的样品中加入上样缓冲液，并上样至 12% 聚丙烯酰胺凝胶进行蛋白质印迹。使用特异性磷酸化抗体检测 pTrkB 和 pERK，以验证 BDNFAvi 的生物学活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过 pCREB 免疫荧光验证 BDNF-QD 的生物学活性。
	<ol>
		<li>将 40,000 个大鼠皮层神经元接种于 10 mm 盖玻片上，盖玻片需预先高压灭菌并用多聚-L-赖氨酸处理，方法如前所述21。</li>
		<li>在 37 ºC 下，于神经元维持缓冲液中（见补充材料）培养神经元 7–8 天。&#160;</li>
		<li>实验开始时，更换为无添加物的 Neurobasal 培养基，并在 37 ºC 下孵育 1 小时。</li>
		<li>通过向一份 mbtBDNF 样品中加入适量的量子点-链霉亲和素偶联物（streptavidin-QD），使 BDNF-QD 达到 1:1 的摩尔比，制备与量子点偶联的 mbtBDNF（BDNF-QD）。然后用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL。用铝箔包裹管子以避光。&#160; 
		注意：另准备一支试管，加入相同体积的量子点-链霉亲和素偶联物，并用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL，作为阴性对照。</li>
		<li>将 mbtBDNF 与 streptavidin-QD 的混合物在室温下于摇床上孵育 30 分钟。&#160;</li>
		<li>用 Neurobasal 培养基将 BDNF-QD 稀释至所需终浓度（200 pM 和 2 nM）。</li>
		<li>在无添加物的 Neurobasal 培养基中孵育 1 小时后，用 BDNF-QD 或 streptavidin-QD（对照）刺激神经元，BDNF 的终浓度为 200 pM 和 2 nM，在 37 °C 下孵育 30 分钟。&#160;</li>
		<li>用 1× PBS（37 °C）洗涤盖玻片 3 次，并用含磷酸酶抑制剂的 4% 多聚甲醛溶液处理盖玻片，固定细胞 15 分钟。</li>
		<li>用 PBS 洗涤细胞 3 次，然后在封闭/通透缓冲液（5% BSA，0.5% Triton X-100，1× 磷酸酶抑制剂）中孵育 1 小时。</li>
		<li>在 4 °C 下，用抗-pCREB 抗体（1:500，溶于含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的溶液中）孵育过夜。&#160;</li>
		<li>次日，用 1× PBS 洗涤 3 次，然后在含 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 的溶液中与二抗（1:500）孵育 1 小时。&#160;</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 3 次，加入 Hoechst 核染色液（5 μg/mL）染色 7 分钟。&#160;</li>
		<li>用 1× PBS 洗涤 3 次，封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>活体神经元中 BDNF-QD 逆行轴突运输的可视化
	<ol>
		<li>按照先前所述方法制备微流控室并接种神经元16。</li>
		<li>培养 7–8 天后，更换为无添加物的 Neurobasal 培养基。</li>
		<li>通过向一份 mbtBDNF 样品中加入适量的量子点-链霉亲和素偶联物（streptavidin-QD），使 BDNF-QD 达到 1:1 的摩尔比，制备与量子点偶联的 mbtBDNF（BDNF-QD）。然后用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL。用铝箔包裹管子以避光。&#160; 
		注意：另准备一支试管，加入相同体积的量子点-链霉亲和素偶联物，并用 Neurobasal 培养基稀释至 20 μL，作为对照。</li>
		<li>将 mbtBDNF 与 streptavidin-QD 的混合物在室温下于摇床上孵育 30 分钟。&#160;</li>
		<li>将 BDNF-QD 稀释至所需终浓度（2 nM）。</li>
		<li>在无添加物的 Neurobasal 培养基中孵育 1 小时后，将 BDNF-QD 或对照混合物加入微流控室的轴突区室中。在 37 ˚C 下孵育 210 分钟，以确保 BDNF-QD 发生净逆行运输。</li>
		<li>进行活细胞成像时，使用适合该用途的显微镜（37 °C 和 5% CO2 条件下），利用 100 倍物镜观察微沟道中靠近胞体区室的轴突逆行运输情况。以每秒 1 帧的速度采集图像。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种基于亲和层析技术的mbtBDNF蛋白制备与纯化流程的优化方法，该方法基于Sung及其合作者的研究工作17。优化内容包括使用一种成本较低的转染试剂（PEI），同时保持了脂质体转染试剂（如lipofectamine）等更昂贵转染方法的高效性。这一优化显著降低了实验方案的整体成本，实现了可扩展性的同时保持了高性价比。该方案还考虑了操作便利性，例如可将条件培养基冷冻保存长达2个月。这些优化使该流程能够适应不同实验室的具体需求，提升成本效益，并获得均一且具有生物活性的重组BDNF蛋白。此外，该方案也可通过将层析装置替换为在锥形管中利用重力沉降磁珠的方式，适用于小规模生产。尽管这是一种可行的方法，但其耗时较长，且根据我们的经验，产量较低。随后，生物素标记的BDNF可偶联至多种链霉亲和素结合探针，包括荧光染料和超顺磁性纳米颗粒，从而成为研究BDNF内吞后运输过程的有力工具。因此，这一经过优化且操作简便的蛋白制备方案对于从事该领域研究的实验室具有重要应用价值。
在原核系统中表达具有复杂翻译后修饰的重组蛋白（如BDNF<sup class...

神经元是神经系统的基本功能单位，具有复杂且特化的形态，能够实现突触通信，从而针对多种刺激产生协调而复杂的行为反应。树突和轴突等神经元突起是参与神经元通信的关键结构特征，而神经营养因子在决定这些突起的形态与功能方面起着至关重要的作用1。神经营养因子是一类分泌型生长因子家族，包括NGF、NT-3、NT-4以及脑源性神经营养因子（BDNF）2。在中枢神经系统（CNS）中，BDNF参与多种生物学过程，如神经传递、树突分支形成、树突棘的成熟以及长时程增强等3,4。因此，BDNF在调控神经元功能中发挥着关键作用。
多种细胞过程调控 BDNF 的动态变化及其功能。在神经元表面，BDNF 结合并激活原肌球蛋白受体激酶 B（TrkB）和/或 p75 神经营养因子受体（p75）。BDNF-TrkB 和 BDNF-p75 复合物被内吞，并分选至不同的内吞细胞器5,6,7,8。BDNF/TrkB 复合物的正确胞内运输对于不同神经环路中 BDNF 信号传导的正常功能至关重要9,10,11。因此，深入理解 BDNF 运输动态及其在病理生理过程中的改变，对于阐明 BDNF 在健康与疾病状态下的信号机制具有重要意义。开发新型且特异性的分子工具以监测该过程，将有助于推动该领域的发展，并更深入地揭示其中涉及的调控机制。
目前有多种工具可用于研究神经元中 BDNF 的运输。一种常用的方法是转染带有荧光分子（如绿色荧光蛋白（GFP）或GFP的单体红色荧光变体mCherry）标记的重组BDNF12,13。然而，BDNF过表达的一个主要缺点是无法递送已知浓度的这种神经营养因子。此外，它可能导致细胞毒性，从而干扰实验结果的解释14。另一种策略是转染带有表位标签的TrkB（如Flag-TrkB）。该方法可用于研究TrkB的内化动力学15，但也涉及转染过程，可能导致TrkB功能改变和细胞毒性。为了克服这些方法学上的局限性，研究人员开发了含有Avi序列（BDNFAvi）的重组NGF和BDNF变体，该序列可被生物素连接酶BirA单生物素化16,17。生物素化的重组BDNF可与多种链霉亲和素结合工具偶联，包括荧光染料、微珠、超顺磁性纳米颗粒等，用于检测。在活细胞成像方面，量子点（QD）已成为常用的荧光探针，与小分子荧光染料相比，其具有更高的亮度和抗光漂白能力，非常适合单颗粒追踪18。
利用BDNFAvi通过共转染表达BDNFAvi和BirA的质粒，成功制备了单生物素化BDNF（mbtBDNF），随后通过亲和层析纯化重组蛋白，每20 mL HEK293条件培养基可获得1–2 μg BDNF17. 此处，我们提出对该方案的改进，可从500 mL HEK293条件培养基中纯化BDNFAvi，旨在通过基于层析柱的纯化流程最大化蛋白回收率，同时便于操作。所使用的转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）可在不牺牲转染效率的前提下实现低成本操作。单生物素标记步骤已调整为一种 体外 通过避免共转染带来的复杂性，确保BDNF标记的均一性。mbtBDNF的生物学活性已通过Western印迹和荧光显微镜实验得到验证，包括pCREB的激活以及利用微流控小室进行活细胞成像以研究BDNF的逆行轴突运输。该方案的使用可实现高产率、均一的单生物素化且具有生物学活性的BDNF的优化制备。

<table><tbody><tr><td>二通旋塞阀</td><td>BioRad</td><td>7328102</td><td>层析装置组件</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>BDNF 洗脱缓冲液</td></tr><tr><td>丙烯酰胺/双丙烯酰胺</td><td>BioRad</td><td>1610154</td><td>SDS-PAGE 凝胶制备</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td>BDNF 浓缩</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Sigma</td><td>A9164</td><td>SDS-PAGE 凝胶制备</td></tr><tr><td>抗 B-III-微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>T8578</td><td>用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗 BDNF 抗体</td><td>Alomone</td><td>AGP-021</td><td>用于定量 BDNF 的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗 BDNF 抗体</td><td>Alomone</td><td>ANT-010</td><td>用于定量 BDNF 的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗 ERK 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>9102</td><td>用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗 pCREB 抗体 (S133)</td><td>Cell Signaling</td><td>9198</td><td>用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗 pERK 抗体 (T202, Y204)</td><td>Cell Signaling</td><td>4370</td><td>用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗 pTrkB 抗体 (Y515)</td><td>Abcam</td><td>ab109684</td><td>用于检测 BDNF 生物活性的 Western 印迹实验</td></tr><tr><td>抗生素/抗真菌剂</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>HEK293 细胞维持</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>BDNF 单生物素化缓冲液</td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>神经元维持</td></tr><tr><td>双(2-羟乙基)亚氨基三乙酸（Bicine）</td><td>Sigma</td><td>B3876</td><td>BDNF 单生物素化缓冲液</td></tr><tr><td>BirA-GST</td><td>BPS Bioscience</td><td>70031</td><td>用于 BDNF AviTag 单生物素化的酶</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>HyClone</td><td>HC.SH30396.02</td><td>HEK293 细胞维持</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>BDNF 缓冲液修饰组分，Western 印迹和免疫荧光实验的封闭缓冲液</td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>BDNF 单生物素化缓冲液</td></tr><tr><td>DMEM 高糖培养基</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>神经元接种</td></tr><tr><td>DMEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>11995-081</td><td>HEK293 细胞维持</td></tr><tr><td>Econo 柱漏斗</td><td>BioRad</td><td>7310003</td><td>层析装置组件</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL 试剂盒</td><td>Biological Industries</td><td>1633664</td><td>通过 Western 印迹检测蛋白质</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>神经元和 HEK293 细胞维持</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Merck</td><td>104094</td><td>BDNF 洗脱缓冲液，Western 印迹实验的裂解缓冲液</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 46R 离心机</td><td>Hettich</td><td>已停产</td><td>用于清除培养基中碎片的离心机</td></tr><tr><td>Hettich Universal 32R 离心机</td><td>Hettich</td><td>已停产</td><td>用于蛋白浓缩器离心的离心机</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>神经元接种</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 500</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29005063</td><td>Western 印迹图像采集</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma</td><td>I55513</td><td>BDNF 缓冲液修饰组分</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>BM-1370</td><td>PBS 组分</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>PBS 组分</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>用于分隔式神经元的盖片包被</td></tr><tr><td>Luer 接头管适配器</td><td>BioRad</td><td>7323245</td><td>层析装置组件</td></tr><tr><td>Luminata&amp;trade; Forte Western HRP 底物</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0100</td><td>通过 Western 印迹检测蛋白质</td></tr><tr><td>Mg(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;COO)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>105819</td><td>BDNF 单生物素化缓冲液</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>免疫荧光实验的封片试剂</td></tr><tr><td>MyOne C1 链霉亲和素磁珠</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>生物素化验证</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>106586</td><td>BDNF 缓冲液修饰组分</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>BM-1630</td><td>PBS 组分，BDNF 缓冲液修饰组分</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Merck</td><td>106346</td><td>BDNF 缓冲液修饰组分</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>神经元维持</td></tr><tr><td>Ni-NTA 琼脂糖珠</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>BDNF AviTag 纯化</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>用于荧光成像的显微镜</td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>BioRad</td><td>1620115</td><td>Western 印迹中的蛋白转膜</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 数字 CMOS 相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>用于落射荧光成像的相机</td></tr><tr><td>P8340 蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>BDNF 缓冲液修饰组分</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Merck</td><td>104005</td><td>免疫荧光实验的固定剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>神经元维持</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Corning</td><td>DLW354210</td><td>用于分隔式神经元的盖片包被</td></tr><tr><td>多聚-L-赖氨酸</td><td>Millipore</td><td>P2363</td><td>用于非分隔式神经元的盖片包被</td></tr><tr><td>Poly-Prep 层析柱</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>层析装置组件</td></tr><tr><td>聚乙烯亚胺 25K</td><td>Polysciences Inc.</td><td>PLY-0296</td><td>HEK293 转染</td></tr><tr><td>量子点 655 链霉亲和素偶联物</td><td>Invitrogen</td><td>Q10121MP</td><td>用于活细胞和固定细胞实验的单生物素化 BDNF AviTag 标记</td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td>免疫荧光实验用去垢剂</td></tr><tr><td>Syldgard 184 硅酮弹性体基质</td><td>Poirot</td><td>4019862</td><td>微流控腔室制备</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td>SDS-PAGE 凝胶制备</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Winkler</td><td>BM-2000</td><td>裂解缓冲液组分</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Merck</td><td>108603</td><td>免疫荧光和 Western 印迹实验中的细胞通透化</td></tr><tr><td>0.5% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>HEK293 传代</td></tr></tbody></table>

一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组bdnf，用于神经元细胞内运输研究

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

在HEK293细胞中表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），然后通过亲和层析以较低成本进行纯化。已建立一种可重复的实验方案，可在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接&#160;单一位点生物素标记。在此反应中，单生物素标记的BDNFAvi仍保持其生物学活性。
神经营养因子是一类由靶细胞来源的生长因子，在神经元的发育和维持中发挥重要作用。它们需要通过内吞途径中的快速运输机制，以实现不同神经元区室之间的长距离信号传递。用于研究神经营养因子转运的分子工具的开发，使得在细胞内精确追踪这些蛋白质成为可能 体内 记录。在本方案中，我们开发了一种优化且经济高效的单生物素化BDNF制备流程。通过在HEK293细胞中表达一种含有可生物素化Avi序列的重组BDNF变体（BDNFAvi），以微克级产量生产目标蛋白，随后采用亲和层析技术进行易于放大的纯化步骤。纯化后的BDNF可通过直接单步反应实现均一的单生物素化修饰 体外 在离心管中通过BirA酶进行反应。单生物素化的BDNF（mbtBDNF）可通过链霉亲和素与不同荧光染料偶联而具备生物学活性。BDNFAvi和mbtBDNF均保留其生物学活性，分别通过Western blot检测下游磷酸化靶蛋白以及转录因子CREB的激活得以验证。利用链霉亲和素偶联的量子点，我们能够观察到mbtBDNF的内化过程，并同时检测到CREB的激活，后者使用特异性识别磷酸化CREB的抗体进行检测。此外，与链霉亲和素-量子点偶联的mbtBDNF适用于在微流控培养室中培养的皮层神经元的逆向运输分析。因此，在离心管中制备的mbtBDNF是研究神经元中生理信号内体动态行为与运输过程的可靠工具。

基于层析柱的实验方案可实现对大量HEK293条件培养基的处理。在 图1，从500 mL条件培养基中纯化BDNFAvi的结果如图所示。连续从Ni-NTA琼脂糖珠上洗脱BDNFAvi，其浓度逐渐降低（图1A）。经过四次连续洗脱（每次持续15分钟）后，磁珠捕获的大部分BDNF得以回收。洗脱液的浓度范围为6至28 ng/μL，总产量约为 60 μg BDNFAvi的表1）。所产生的BDNFAvi随后通过一种高效的方式被生物素化 体外 由BirA-GST介导的反应，表现为上清液中缺乏非生物素化的BDNFAvi（图1B）请注意，此处介绍的生物素标记方法 图1B 对应于产生的总BDNF的一个等分试样，但反应可根据需要放大以适用于更大的体积。 
随后，采用两种不同的实验方法评估了mbtBDNF的生物学活性。首先...

在HEK293细胞中以低成本表达含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi），并通过亲和层析进行纯化。随后在离心管中利用BirA酶对BDNFAvi进行直接单生物素标记。与 commercially available BDNF 相比，BDNFAvi 及单生物素化BDNFAvi 均保持其生物学活性。

一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

含有Avi序列的重组BDNF（BDNFAvi）在HEK293细胞中表达，随后通过亲和层析以较低成本进行纯化。A ...

本实验的总体目标是通过转染HEK293细胞并结合层析柱纯化，建立一种优化的流程以制备和纯化BDNF输卵管蛋白。随后，该BDNF输卵管蛋白通过体外反应进行单生物素标记，以便后续利用荧光显微镜进行标记与检测。该方法的主要优势在于能够以优化的方式实现BDNF的表达、纯化及单一位点生物素化。已采用成本效益高的转染试剂优化了妊娠参数，以实现BDNF的最大产量，纯化过程在便于操作且可放大的层析装置中进行。每15厘米培养皿的转染操作开始时，将60微克聚乙烯亚胺溶于500微升无添加剂的DMEM中，同时将20微克BDNF输卵管质粒溶于500微升无添加剂的DMEM中。室温孵育5分钟，然后小心地将DNA溶液用移液器加入聚乙烯亚胺管中，通过上下吹打混合一次。室温孵育25分钟，然后将1毫升PEI/DNA混合物滴加到每个15厘米培养皿中。用PEI/DNA混合物孵育细胞3小时，随后更换为孵育缓冲液。转染细胞48小时后，收集所有培养皿中的培养基。然后将BDNF培养基组分加入HEK293上清液中，包括氯化钠、磷酸盐缓冲组分、咪唑和蛋白酶抑制剂。冰上孵育15分钟。随后将培养基分装至离心管中。在4°C条件下，以10,000 g离心45分钟。此步骤可去除悬浮在培养基中的细胞碎片和死细胞。然后收集上清液。加入 BSA，使其终浓度为 0.1%，并在 -20 摄氏度保存，最长可保存两个月。为纯化 BDNF，首先将培养基置于 37 摄氏度恒温水浴中解冻，然后将培养基分装至离心管中。在4°C条件下，以3,500 ×g离心一小时。此步骤可去除残留碎片，确保层析柱中液体流动充分。随后使用蛋白浓缩器将培养基体积从500毫升浓缩至100毫升。按照制造商推荐的离心参数进行操作，以获得最佳浓缩效果。然后向浓缩后的上清液中加入 500 µL 镍-NTA 琼脂糖珠，于 4 °C 摇床中孵育过夜。次日，组装层析装置并将样品倒入其中。静置五分钟，然后打开双向停止旋塞，使培养基流过。用五毫升洗涤缓冲液洗涤五分钟，确保将柱中的珠子重新悬浮。重复此步骤三次。最后，向柱中加入1毫升洗脱缓冲液，确保充分重悬珠子。孵育15分钟后，将洗脱液收集至微量离心管中。重复此步骤三次，以实现BDNF的完全洗脱。为了对BDNF进行生物素标记，取含有800纳克蛋白的等分试样，加入生物素标记缓冲液试剂，再加入与BDNF摩尔比为1:1的BirA-GST。在杂交炉中30摄氏度孵育60分钟，每隔15分钟轻轻翻转试管混匀内容物。然后加入与第一步相同体积的ATP和BirA-GST，继续孵育60分钟，每隔15分钟混匀试管内容物一次。生物素标记的BDNF可立即置于冰上以进行生物素化验证，或在负80摄氏度保存以备后续分析。为验证BDNF输卵管的生物素化情况，首先在封闭缓冲液中封闭每份BDNF样品对应的30微升链霉亲和素磁珠。室温孵育一小时后，将磁珠置于磁力架中沉淀，随后弃去封闭缓冲液。加入 50 µL 新鲜封闭缓冲液和 BDNF 样品至珠粒中，确保充分重悬。混匀离心管中的内容物，并在 4 °C 下于微量离心管旋转仪中孵育 1 小时。按照文中所述方法制备样品，用于后续 Western 印迹分析，以评估生物素化反应的效率。为了将BDNF输卵管与量子点偶联，首先加入适量的量子点，使其与BDNF达到1:1的摩尔比，然后稀释至终体积为20微升。混匀管内溶液，用铝箔包裹以避光。在室温下于摇床中孵育30分钟。然后将BDNF输卵管稀释至所需的终浓度，并加入微流控室的轴突区室中，孵育210分钟，用于后续的活细胞或固定细胞成像。采用基于层析柱的方案可处理较大量HEK293条件培养基。在本实验中，处理了500毫升条件培养基以纯化BDNF输卵管。连续四次洗脱，每次持续15分钟，获得的BDNF输卵管蛋白浓度逐渐降低，范围为每微升6至28纳克。总产量约为60微克BDNF输卵管蛋白。随后，该纯化的BDNF通过BirA-GST介导的体外反应进行生物素标记。样品经均匀生物素化修饰，磁珠清除缓冲液上清中未检测到非生物素化的BDNF输卵管蛋白，证实了修饰的均一性。这些结果表明，本方案可实现大量BDNF输卵管蛋白的纯化及体外均一的单一位点生物素化修饰。随后，采用两种不同的实验方法评估了单一位点生物素化BDNF的生物学活性。首先，将接种于60毫米培养皿中的皮层神经元用50纳克/毫升的单生物素化BDNF处理30分钟，随后制备蛋白质用于Western印迹分析。通过检测磷酸化TrkB和磷酸化ERK来定量单生物素化BDNF的生物学活性。BDNF与TrkB结合可触发受体的自磷酸化，并激活包括ERK在内的多种下游激酶。为分析BDNF输卵管生物学活性，实验设置了未用BDNF刺激的阴性对照组和使用市售BDNF刺激的阳性对照组。两条条带均为磷酸化蛋白，在经市售BDNF和单生物素化BDNF处理的神经元中信号强度相似，且均强于阴性对照组。随后评估了与链霉亲和素量子点偶联的单生物素化BDNF的生物学活性，以证明其可用于活体成像实验。将皮层神经元接种于10毫米盖玻片上，并用终浓度为200皮摩尔或2纳摩尔的BDNF量子点处理30分钟，随后进行固定并针对磷酸化CREB染色。CREB是一种转录因子，在皮层神经元中可被活化的ERK1/2所靶向。用逐渐增加浓度的BDNF量子点刺激神经元，导致CREB磷酸化水平呈剂量依赖性升高，同时可见量子点颗粒围绕细胞核分布，表明BDNF量子点颗粒已被内吞，并触发了与BDNF介导的TrkB激活相关的信号通路。当使用200皮摩尔BDNF量子点刺激神经元时，检测到磷酸化CREB信号增加了两倍；而使用2纳摩尔BDNF量子点刺激时，磷酸化CREB信号增加了3.5倍。因此，生物素化的BDNF卵状结构具有生物学活性，并且在与链霉亲和素量子点偶联后不会丧失其活性，适用于免疫荧光和活细胞成像。最后，利用微流控腔室在区室化培养体系中评估了BDNF量子点的成像潜力。将皮层神经元接种于微流控小室中，以分离轴突和胞体-树突区室，并用2纳摩尔的BDNF量子点刺激3.5小时。进行活细胞显微成像，生成的延时图像用于定量分析携带BDNF量子点的细胞器的运动速度。检测到的平均移动速度为0.91微米/秒，与先前对细胞质胸腺嘧啶介导运输的分析结果一致。用2纳摩尔链霉亲和素量子点处理的微流控腔室未显示微管组中有移动的量子点，这由显影图谱证实。在相同条件下培养的细胞经500皮摩尔或2纳摩尔BDNF量子点刺激210分钟后，进行固定并用核染料标记。经BDNF量子点处理的神经元显示，在所有分析的亚区室（包括微管组的近端和远端以及胞体-树突区室）中，标记蛋白均呈剂量依赖性累积。相比之下，对照组神经元在整个微流控腔室中几乎未显示出任何量子点信号。因此，脑源性神经营养因子（BDNF）量子点可在微流控腔室中的活细胞和固定细胞中被检测到。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过基于层析柱的经济高效的方法制备单生物素化的BDNF卵白蛋白。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

用于神经元细胞贩运研究的管子中纯化和直接单生物素重组BDNF的改进协议

受调控的内吞作用决定了大多数膜蛋白在细胞表面的表达水平。本文中，我们利用可还原且不能透过膜的生物素化试剂，测定多拓扑膜蛋白——多巴胺转运体（DAT）的内吞速率。该方法为测定大多数质膜蛋白内吞速率提供了一种简便直接的途径。...

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开发可生物素化的融合蛋白在各个研究领域具有广泛的应用前景。重组蛋白工程技术是一种简单直接且成本效益高的方法，能够高效地获得按特定设计定制的蛋白质。...

可溶性与不可溶性生物素化蛋白的表达、分离与纯化在神经组织再生中的应用

脑源性神经营养因子（BDNF）的轴突运输对多种神经元群体的存活和功能至关重要。某些变性类疾病的特点是轴突结构和功能的破坏。我们展示了利用原代神经元在微流控芯片中检测QD-BDNF活体运输的技术。...

原代神经元中量子点标记的BDNF轴突运输的实时成像

本方案描述了去硫代生物素、链霉亲和素和APTES系统的可定制化表面功能化方法，以分离特定的目标细胞类型。此外，本文还涵盖了该方法的应用、优化及验证过程。...

一种通过玻璃表面功能化实现靶向细胞分离的方法

本文介绍了一种优化的实验方案，可通过荧光染色方法有效显示生物素化葡聚糖胺（BDA）在神经环路中的标记情况。该方法适用于在共聚焦激光扫描显微镜下分析BDA标记的精细结构，并将其与其他神经成分区分开来。...

提高高分子量生物素化葡聚糖胺在大鼠丘脑皮层投射示踪中的应用

本报告介绍了两种基于生物素标记的方法，用于测定在质膜上表达的蛋白质的细胞表面表达水平及其内吞速率。...

利用生物素标记法测定原代星形胶质细胞培养物中蛋白质的细胞表面表达及内吞速率

本方案描述了细胞膜亲和色谱（CMAC）柱的制备方法，其中固定化了含有功能性跨膜原肌球蛋白激酶受体B蛋白的细胞膜片段。同时阐述了CMAC柱在鉴定复杂天然混合物中与这些受体相互作用的特化植物代谢物中的应用。...

用于鉴定与固定化原肌球蛋白激酶受体B相互作用的特化植物代谢物的细胞膜亲和色谱柱

本方案描述了一种适用于小型仪器设备的猪脑微管蛋白高产率分离技术。该分离流程辅以微管蛋白聚合活性的测定方法。 体外...

优化从猪脑组织中提取微管蛋白的产量

本方案介绍了一种基于生物素连接酶与目标蛋白融合后，利用其邻近效应在活体（in...

体内邻近生物素化用于四膜虫（Paramecium tetraurelia）蛋白质相互作用研究

了解利用HEK293细胞转染和亲和层析柱纯化技术制备重组脑源性神经营养因子（BDNF）并进行单生物素标记的优化方案。该方法可高效获得具有生物活性的BDNF，适用于神经元细胞贩运研究的荧光显微成像实验。

一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

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