一种改进的方案：在离心管中纯化并直接单生物素标记重组BDNF，用于神经元细胞内运输研究

本实验的总体目标是通过转染HEK293细胞并结合层析柱纯化，建立一种优化的流程以制备和纯化BDNF输卵管蛋白。随后，该BDNF输卵管蛋白通过体外反应进行单生物素标记，以便后续利用荧光显微镜进行标记与检测。该方法的主要优势在于能够以优化的方式实现BDNF的表达、纯化及单一位点生物素化。

已采用成本效益高的转染试剂优化了妊娠参数，以实现BDNF的最大产量，纯化过程在便于操作且可放大的层析装置中进行。每15厘米培养皿的转染操作开始时，将60微克聚乙烯亚胺溶于500微升无添加剂的DMEM中，同时将20微克BDNF输卵管质粒溶于500微升无添加剂的DMEM中。室温孵育5分钟，然后小心地将DNA溶液用移液器加入聚乙烯亚胺管中，通过上下吹打混合一次。

室温孵育25分钟，然后将1毫升PEI/DNA混合物滴加到每个15厘米培养皿中。用PEI/DNA混合物孵育细胞3小时，随后更换为孵育缓冲液。转染细胞48小时后，收集所有培养皿中的培养基。

然后将BDNF培养基组分加入HEK293上清液中，包括氯化钠、磷酸盐缓冲组分、咪唑和蛋白酶抑制剂。冰上孵育15分钟。随后将培养基分装至离心管中。

在4°C条件下，以10,000 g离心45分钟。此步骤可去除悬浮在培养基中的细胞碎片和死细胞。然后收集上清液。

加入 BSA，使其终浓度为 0.1%，并在 -20 摄氏度保存，最长可保存两个月。为纯化 BDNF，首先将培养基置于 37 摄氏度恒温水浴中解冻，然后将培养基分装至离心管中。

在4°C条件下，以3,500 ×g离心一小时。此步骤可去除残留碎片，确保层析柱中液体流动充分。随后使用蛋白浓缩器将培养基体积从500毫升浓缩至100毫升。

按照制造商推荐的离心参数进行操作，以获得最佳浓缩效果。然后向浓缩后的上清液中加入 500 µL 镍-NTA 琼脂糖珠，于 4 °C 摇床中孵育过夜。次日，组装层析装置并将样品倒入其中。

静置五分钟，然后打开双向停止旋塞，使培养基流过。用五毫升洗涤缓冲液洗涤五分钟，确保将柱中的珠子重新悬浮。重复此步骤三次。

最后，向柱中加入1毫升洗脱缓冲液，确保充分重悬珠子。孵育15分钟后，将洗脱液收集至微量离心管中。重复此步骤三次，以实现BDNF的完全洗脱。

为了对BDNF进行生物素标记，取含有800纳克蛋白的等分试样，加入生物素标记缓冲液试剂，再加入与BDNF摩尔比为1:1的BirA-GST。在杂交炉中30摄氏度孵育60分钟，每隔15分钟轻轻翻转试管混匀内容物。然后加入与第一步相同体积的ATP和BirA-GST，继续孵育60分钟，每隔15分钟混匀试管内容物一次。

生物素标记的BDNF可立即置于冰上以进行生物素化验证，或在负80摄氏度保存以备后续分析。为验证BDNF输卵管的生物素化情况，首先在封闭缓冲液中封闭每份BDNF样品对应的30微升链霉亲和素磁珠。室温孵育一小时后，将磁珠置于磁力架中沉淀，随后弃去封闭缓冲液。

加入 50 µL 新鲜封闭缓冲液和 BDNF 样品至珠粒中，确保充分重悬。混匀离心管中的内容物，并在 4 °C 下于微量离心管旋转仪中孵育 1 小时。按照文中所述方法制备样品，用于后续 Western 印迹分析，以评估生物素化反应的效率。

为了将BDNF输卵管与量子点偶联，首先加入适量的量子点，使其与BDNF达到1:1的摩尔比，然后稀释至终体积为20微升。混匀管内溶液，用铝箔包裹以避光。在室温下于摇床中孵育30分钟。

然后将BDNF输卵管稀释至所需的终浓度，并加入微流控室的轴突区室中，孵育210分钟，用于后续的活细胞或固定细胞成像。采用基于层析柱的方案可处理较大量HEK293条件培养基。在本实验中，处理了500毫升条件培养基以纯化BDNF输卵管。

连续四次洗脱，每次持续15分钟，获得的BDNF输卵管蛋白浓度逐渐降低，范围为每微升6至28纳克。总产量约为60微克BDNF输卵管蛋白。随后，该纯化的BDNF通过BirA-GST介导的体外反应进行生物素标记。

样品经均匀生物素化修饰，磁珠清除缓冲液上清中未检测到非生物素化的BDNF输卵管蛋白，证实了修饰的均一性。这些结果表明，本方案可实现大量BDNF输卵管蛋白的纯化及体外均一的单一位点生物素化修饰。随后，采用两种不同的实验方法评估了单一位点生物素化BDNF的生物学活性。

首先，将接种于60毫米培养皿中的皮层神经元用50纳克/毫升的单生物素化BDNF处理30分钟，随后制备蛋白质用于Western印迹分析。通过检测磷酸化TrkB和磷酸化ERK来定量单生物素化BDNF的生物学活性。BDNF与TrkB结合可触发受体的自磷酸化，并激活包括ERK在内的多种下游激酶。

为分析BDNF输卵管生物学活性，实验设置了未用BDNF刺激的阴性对照组和使用市售BDNF刺激的阳性对照组。两条条带均为磷酸化蛋白，在经市售BDNF和单生物素化BDNF处理的神经元中信号强度相似，且均强于阴性对照组。随后评估了与链霉亲和素量子点偶联的单生物素化BDNF的生物学活性，以证明其可用于活体成像实验。

将皮层神经元接种于10毫米盖玻片上，并用终浓度为200皮摩尔或2纳摩尔的BDNF量子点处理30分钟，随后进行固定并针对磷酸化CREB染色。CREB是一种转录因子，在皮层神经元中可被活化的ERK1/2所靶向。用逐渐增加浓度的BDNF量子点刺激神经元，导致CREB磷酸化水平呈剂量依赖性升高，同时可见量子点颗粒围绕细胞核分布，表明BDNF量子点颗粒已被内吞，并触发了与BDNF介导的TrkB激活相关的信号通路。

当使用200皮摩尔BDNF量子点刺激神经元时，检测到磷酸化CREB信号增加了两倍；而使用2纳摩尔BDNF量子点刺激时，磷酸化CREB信号增加了3.5倍。因此，生物素化的BDNF卵状结构具有生物学活性，并且在与链霉亲和素量子点偶联后不会丧失其活性，适用于免疫荧光和活细胞成像。最后，利用微流控腔室在区室化培养体系中评估了BDNF量子点的成像潜力。

将皮层神经元接种于微流控小室中，以分离轴突和胞体-树突区室，并用2纳摩尔的BDNF量子点刺激3.5小时。进行活细胞显微成像，生成的延时图像用于定量分析携带BDNF量子点的细胞器的运动速度。检测到的平均移动速度为0.91微米/秒，与先前对细胞质胸腺嘧啶介导运输的分析结果一致。

用2纳摩尔链霉亲和素量子点处理的微流控腔室未显示微管组中有移动的量子点，这由显影图谱证实。在相同条件下培养的细胞经500皮摩尔或2纳摩尔BDNF量子点刺激210分钟后，进行固定并用核染料标记。经BDNF量子点处理的神经元显示，在所有分析的亚区室（包括微管组的近端和远端以及胞体-树突区室）中，标记蛋白均呈剂量依赖性累积。

相比之下，对照组神经元在整个微流控腔室中几乎未显示出任何量子点信号。因此，脑源性神经营养因子（BDNF）量子点可在微流控腔室中的活细胞和固定细胞中被检测到。观看本视频后，您应能够充分理解如何通过基于层析柱的经济高效的方法制备单生物素化的BDNF卵白蛋白。