Name: 切除小鼠神经神经纤维神经丝的成像与分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学习荧光光激活成像技术，用于分析转基因小鼠周围神经髓鞘轴突中神经丝的定向运输与速度。该方法可直接观察神经丝动态，为研究神经元轴突运输机制提供重要工具。

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作者谨此感谢Paula Monsma在共聚焦显微镜操作和胫神经解剖方面的指导与协助，感谢Atsuko Uchida博士、Chloe Duger和Sana Chahande在小鼠饲养管理方面的帮助。本研究工作部分得到了美国国家科学基金会资助项目IOS1656784（授予A.B.）和IOS1656765（授予P.J.），以及美国国立卫生研究院资助项目R01 NS038526、P30 NS104177和S10 OD010383（均授予A.B.）的支持。N.P.B.获得了俄亥俄州立大学校长博士后学者计划资助的博士后奖学金。

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作者无任何利益冲突需要披露。

在分析脉冲逃逸和脉冲扩散实验时必须格外谨慎，因为在后期处理过程中，尤其是在平场校正、图像对齐和漂白校正阶段，存在引入显著误差的可能。平场校正对于纠正照明不均匀性是必要的，这种不均匀性会导致视野中从中心到边缘的光强逐渐下降。不均匀性的程度依赖于波长，因此平场校正应始终在用于采集实验数据的相同波长下进行。必须确保平场图像中的不均匀性能够真实反映待校正图像中的不均匀性。脉冲扩散实验尤其容易因不恰当的平场校正而产生误差，因为测量的兴趣区域（ROI）延伸至图像边缘区域，而该区域的光强下降最为显著。
最佳的paGFP激活条件会因激活方法和激光参数的不同而有所变化，必须在首次成像前通过实验经验确定。激活不足会导致激活荧光的信噪比过低，而激活过度则会引起激活荧光的漂白，因为紫光可同时激发未激活和已激活的paGFP。为了选择性地照射图像中的感兴趣区域，我们使用Andor FRAPPA激光振镜扫描系统，该系统可产生边界清晰、定义明确的荧光区域，如代表性结果所示。我们还成功使用了Andor Mosaic数字光阑（一种数字微镜装置），并以汞弧灯作为照明光源7...

神经丝的轴突运输最早于20世纪70年代通过放射性同位素脉冲标记法得以证实1该方法已为神经丝运输的研究提供了大量信息 体内但其空间和时间分辨率相对较低，通常最高也只能达到毫米级和天级2此外，放射性同位素脉冲标记是一种间接方法，需要注射并处死多只动物才能获得单条时间进程数据。随着20世纪90年代荧光蛋白的发现以及荧光显微镜技术的进步，研究人员得以在秒或分钟的时间尺度上，以亚微米级的空间分辨率直接观察培养神经元中的神经丝运输过程，从而更深入地揭示其运动机制3这些研究表明，轴突中的神经丝聚合物在微管轨道上由微管马达蛋白驱动，沿顺向和逆向快速且间歇性地移动。然而，神经丝是直径仅为10 nm的衍射极限结构，通常与其相邻结构相距仅数十纳米；因此，只有在神经丝分布稀疏的培养神经元中，才能将移动的聚合物与其邻近结构区分开来进行追踪。4因此，目前尚无法在含有大量神经丝聚合物（如髓鞘化轴突）的轴突中追踪单根神经丝。
为了利用荧光显微镜分析富含神经丝的轴突中神经丝的轴突运输，我们采用了一种自主研发的荧光光激活脉冲逃逸方法，用于研究培养神经细胞中神经丝的长期暂停行为4,5。通过在轴突的一小段区域内激活带有光可激活荧光标记的神经丝融合蛋白，随后通过测量荧光随时间的衰减来量化这些神经丝从激活区域的离开速率。该方法的优势在于，它是一种群体水平的神经丝运输分析技术，可在数分钟至数小时的时间尺度上应用，而无需追踪单个神经丝多聚体的运动。例如，我们已利用该方法分析了髓鞘化培养体系中神经丝运输的动力学特征6。
最近，我们描述了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠模型的建立，该模型在人类神经元特异性Thy1启动子调控下，于神经元中低水平表达一种带有光活化绿色荧光蛋白（paGFP）标记的神经丝蛋白M（paGFP-NFM）7。该小鼠模型可用于利用荧光显微镜原位分析神经丝的运输过程。本文中，我们介绍了两种用于分析这些小鼠胫神经有髓鞘轴突中神经丝运输的实验方法。第一种方法是上述的脉冲逃逸法。该方法可提供关于神经丝暂停行为的信息，但无法检测纤维离开激活区域的方向，因此不能用于测量净方向性和运输速度8。第二种方法是一种新的脉冲扩散法，其中我们不仅分析激活区域内荧光的减少，还分析荧光纤维向顺行和逆行两个方向离开激活区域时，在两侧相邻检测窗口中出现的荧光瞬时增强现象。在这两种方法中，均可通过对测量窗口内荧光变化进行数学分析和建模，获得神经丝运输的相关参数，如平均速度、净方向性和暂停行为。图3&#160;展示了这两种方法。
本方案演示了&#160;神经的解剖与制备、paGFP荧光的激活与成像，以及利用ImageJ的FIJI发行版软件包对所获图像进行神经丝蛋白运输的定量分析9。我们采用胫神经，因其较长（数厘米）且无分支；然而原则上，任何表达paGFP-NFM的神经，只要能够解剖并去鞘且不损伤轴突，均适用于本技术。

<table><tbody><tr><td>14 x 22 矩形垫圈 0.1 mm</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-100</td><td>内层垫圈</td></tr><tr><td>2-脱氧-D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>30 mm 带孔圆形垫圈</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>外层垫圈</td></tr><tr><td>35 x 10 mm 培养皿</td><td>Thermo Fisher</td><td>153066</td><td>解剖皿</td></tr><tr><td>40 mm 圆形盖玻片</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td></td></tr><tr><td>60 mL 注射器 - 鲁尔锁头</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>Andor Revolution WD 转盘共聚焦系统</td><td>Andor</td><td></td><td>配备 Perfect Focus 和 FRAPPA 系统</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher</td><td>12-541-B</td><td>用于荧光素载玻片</td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖溶液</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-70</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>尖头镊子</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Zeiss</td><td>47 50 03</td><td></td></tr><tr><td>带蜡解剖盘</td><td>Ginsberg Scientific</td><td>568859</td><td></td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-09</td><td>初段解剖剪刀</td></tr><tr><td>FCS2 灌流腔室</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>荧光素钠</td><td>Fluka</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>管路在线加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>SH27-B</td><td></td></tr><tr><td>椎板切除镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td>初段解剖镊</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>微流道载玻片</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td>用于荧光素载玻片</td></tr><tr><td>显微镜载物台插件</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>I-3017</td><td></td></tr><tr><td>物镜加热系统</td><td>Okolab</td><td></td><td>Oko Touch 配物镜环</td></tr><tr><td>物镜油 - A 型</td><td>Nikon</td><td>discontinued</td><td></td></tr><tr><td>Plan Apo VC 100x 1.40 NA 物镜</td><td>Nikon</td><td>MRD01901</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>磷酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2512</td><td></td></tr><tr><td>注射泵</td><td>Sage Instruments</td><td>Model 355</td><td></td></tr><tr><td>管路接头 - 雌性</td><td>Small Parts Inc.</td><td>1005109</td><td></td></tr><tr><td>管路接头 - 雄性</td><td>Small Parts Inc.</td><td>1005012</td><td></td></tr><tr><td>Tygon 管</td><td>Bioptechs</td><td></td><td>1/16&quot; 内径，1/32&quot; 管壁厚度</td></tr><tr><td>Vannas 弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>精细剪刀</td></tr></tbody></table>

离体小鼠胫神经中神经丝运输的成像与分析

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

神经丝蛋白聚合物以轴突运输慢速成分沿轴突移动，平均速度约为0.35–3.5 mm/天。直到最近，原位研究这种运动仅能通过放射性同位素脉冲标记实现，该方法可在整体神经中分析轴突运输，时间分辨率为数天，空间分辨率为毫米级别。为了以更高的时间和空间分辨率原位研究神经丝运输，我们开发了一种hThy1-paGFP-NFM转基因小鼠，该小鼠在神经元中表达带有光激活型GFP标记的神经丝蛋白M。本文描述了荧光光激活脉冲逃逸和脉冲扩散方法，用于分析来自这些小鼠胫神经单个有髓轴突中的神经丝运输。

关键词：神经丝蛋白，轴突运输，光激活GFP，原位分析，有髓轴突，转基因小鼠 离体分离的神经节段通过灌注含氧生理盐水在显微镜载物台上维持，并采用转盘共聚焦荧光显微镜进行成像。使用紫光激活短段轴突区域的荧光，随后对激活区域及其邻近区域的荧光随时间的变化进行分析，从而实现对神经丝运输过程在分钟级时间分辨率和空间分辨率下的研究。&#160;以及微米。数学建模可用于从所得数据中提取神经丝运输的动力学参数，包括速度、方向偏好性和暂停行为。脉冲逃逸法和脉冲扩散法也可被改进用于可视化其他神经中的神经丝运输。随着更多转基因小鼠的开发，这些方法还可用于成像和分析轴突中其他细胞骨架蛋白和胞质蛋白的轴突运输。

图3展示了脉冲逃逸和脉冲扩散实验的代表性图像。我们已发表多项研究，描述了使用脉冲逃逸方法所获得的数据及对该类数据的分析方法5,6,7,8,17。下文将展示脉冲扩散数据如何提供关于神经丝运输方向性和速度的信息，此类信息此前尚未报道。
神经丝在轴突中的运输是间歇性且双向的。这种运输可以通过任一时刻沿顺向和逆向移动的神经丝所占比例来描述，分别记为 <img alt="静态平衡，ΣFx=0，受力分析图，力的平衡，物理学教学概念" src="/files/ftp_upload/61264/61264eq41v2.png" style="margin:auto; vertical-align: middle;" ...

我们描述了荧光光激活方法，用于分析来自表达光激活神经丝蛋白的转基因小鼠的外周神经有髓轴突中单根轴突内神经丝的轴突运输。

神经丝蛋白聚合物以每天约0.35–3.5毫米的平均速度，沿轴突在轴突运输的慢速成分中移动。直到最近，该研究……

本方案允许使用荧光显微镜直接成像幼年或成年小鼠有髓轴突中的神经丝群体，从而能够测量分离神经节段中神经丝运输的方向性和速度。该方法依赖于表达目标蛋白的光激活荧光融合蛋白的小鼠，但也可适用于任何易于解剖的神经。首先，将充氧的生理盐水倒入一个60毫升的注射器中，并确保注射器内残留的空气尽可能少。将注射器连接到管路，然后将流出管放入废液瓶中。将外密封圈放入灌流室外壳内，确保流体入口和出口柱与密封圈上的孔对齐，然后将内密封圈平放在1.5号圆形盖玻片上，小心抚平密封圈上的任何褶皱，以确保密封紧密。将盖玻片和密封圈放置在纸巾或实验擦拭纸上，密封圈朝上。使用一把较大的解剖剪，在脊柱中段附近的背部皮肤上做一纵向切口，并继续沿动物腹侧周围剪开。缓慢将皮肤从肌肉上剥离，并剪开筋膜。接着，使用显微解剖剪在大腿肌肉处（位于尾部与膝关节中间位置）做一切口，以暴露坐骨神经。确保穿过肌肉可见的神经未被切断。沿背侧和腹侧延长切口以去除肌肉，随后去除小腿的肌肉，切割时保持浅而短，以避免损伤神经。持续去除肌肉，直至胫神经从坐骨神经分支处到足跟的整个路径完全暴露。 用镊子夹住胫神经脊柱近端，用显微解剖剪将其剪断，注意不要对神经施加过大的张力。小心将其从肌肉上抬起，并剪断任何连接组织，操作时注意避免对神经施加张力。剪断胫神经脊柱远端，将其转移至盛有室温含氧生理盐水的小培养皿中。从神经的近端开始，用一对超细尖镊子轻轻夹住暴露的轴突末端。用另一对镊子在近端夹住神经鞘，并缓慢向神经远端拉动，确保此过程中不施加过度张力。夹住神经近端，缓慢将其平铺于盖玻片上，然后在轻微张力下将其拉直。将微流道载玻片有凹槽的一面朝下覆盖在神经上，并使流道方向与神经平行。翻转盖玻片和微流道组件，将其放入灌流室外壳中，使载玻片与外侧垫圈相对。为固定灌流室，将其置入金属外壳中并旋转锁紧环。缓慢推动生理盐水注射器的活塞，使灌注室充满液体。在安装和成像过程中，始终确保进液管、出液管、出液烧瓶和注射器的位置高于灌注室本身。将灌注装置转移至倒置显微镜载物台上，并将生理盐水注射器安装到注射泵中，然后启动电机，调节流速至每分钟0.25毫升。连接管路式溶液加热器，并将其设定为 37 摄氏度。连接物镜加热器，并将其设定为 37 摄氏度。在物镜上滴加镜油，然后将灌流腔室插入载物台固定装置中。将油涂抹于灌流室加热垫上，并将其连接至灌流室，然后接通电源并设置温度为 37 摄氏度。将灌流室固定在载物台适配器上，并使物镜油与灌流室底部盖玻片接触。使用明场照明聚焦于靠近盖玻片表面的神经底面的轴突层。有髓鞘的轴突可通过髓鞘的存在来识别，该髓鞘在无对比度增强的明场透射光照明下可见。首先获取一张明场参考图像，记录神经的方向性，然后使用488纳米激光和适用于光激活GFP的发射滤光片获取共聚焦图像。将激光功率设置为正常成像功率的约五倍，以三到四分钟的曝光时间获取图像，随后再获取另一张共聚焦图像，以记录漂白步骤后的预激活自发荧光。以与轴突平行的方向绘制一条直线，其长度等于明场图像所需的激活窗口大小。以该直线为引导，垂直于轴突方向绘制一个跨越整个视野的矩形兴趣区域。使用405纳米光进行模式化激发，在该区域内激活GFP荧光，并确保在激活前和激活后立即各采集一幅图像。激活完成后，立即启动一分钟计时器。计时结束时，开始采集延时成像序列。将250毫克荧光素粉末加入0.5毫升双蒸水中，混匀至无可见颗粒，然后在台式离心机中离心30秒，以沉淀任何未溶解的物质。向载玻片上加入 8 µL 荧光素溶液，并覆盖一张 1.5 号盖玻片。吸去多余液体，用指甲油密封盖玻片，然后让载玻片自然干燥。将载玻片的盖玻片一侧朝下放置在倒置显微镜的载物台上，调节焦距，使荧光聚焦在盖玻片表面的薄层平面上。移动载玻片以找到一个不含气泡或大颗粒荧光素的视野，采集一个跨度为六微米、间隔为0.2微米的Z轴图像序列，使中间图像为原始焦平面。关闭所有光路快门（包括相机快门），并将激光功率和曝光时间设置为零秒。使用这些设置采集100张图像的图像序列，随后将对其进行平均以生成暗场图像。此处展示了脉冲逃逸和脉冲扩散实验的代表性图像。对于脉冲逃逸法，激活区域内荧光衰减动力学可提供有关长期和短期暂停行为的信息。这些实验中的激活区域可以较短。在脉冲扩散法中，采用更长的激活区域，以提供更丰富的荧光神经丝。这可延长侧翼区域荧光增强保持线性的时间。此处使用15 µm的侧翼窗口。对测量窗口的总荧光强度进行了定量分析。在脉冲逃逸法中，衰减呈双相性：初始的指数衰减代表沿轨道神经丝的离开，随后在10至20分钟出现较慢的第二相指数衰减，代表偏离轨道的丝状结构的离开。对于脉冲扩散策略，运动速度和方向性的计算仅依赖于侧翼窗口中的斜率。对于此处使用的窗口长度，线性相位持续约五分钟。图中展示了一条经糖酵解抑制处理的神经的延时影像，显示从激活区域向外的运输明显减少。事实上，经抑制剂处理的神经，其远端和近端斜率均显著降低。这两种条件下，群体移动速度也显著下降。在实施本方案时，请务必注意，应在动物处死后尽快完成解剖和腔室组装步骤，因为神经组织的健康状况会随着时间推移而下降。神经元细胞培养可用于对单个神经丝的运动进行测量与分析，从而补充本方案所获得的群体水平数据。

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