Name: 高通量图像引导立体定向神经导航和聚焦超声系统，用于在啮齿动物中打开血脑屏障 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 学习使用模块化聚焦超声系统在啮齿动物中实现血脑屏障暂时性开放的方法。该技术通过微泡介导的声孔效应促进药物递送，适用于胶质瘤等中枢神经系统疾病的精准医疗研究。

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本项目由KWF-STW资助（儿童弥漫性内生性桥脑胶质瘤和高级别胶质瘤的声孔效应药物递送）。我们感谢Ilya Skachkov和Charles Mougenot在系统开发过程中提供的支持与建议。

所有体内实验均获得荷兰伦理委员会（许可证编号 AVD114002017841）和荷兰阿姆斯特丹自由大学动物福利机构的批准。研究人员接受了FUS系统基本操作的培训，以尽量减少动物的不适。
1. 聚焦超声系统
注意：所述装置是基于市售组件自制的血脑屏障（BBB）破坏系统，包含一个3D打印的定制锥形聚焦装置和可拆卸的立体定位平台。该系统采用模块化设计，可根据现有设备和特定用途进行调整。本方案描述了对小鼠脑桥区域较大范围进行声孔效应（sonoporation）的操作流程。通过调整靶向位置，可对大脑的不同区域进行靶向处理。本研究中使用的超声换能器为1 MHz单元素换能器，其&#160;焦距为75 mm，孔径为60 mm，焦点区域为1.5 × 1.5 × 5 mm（峰值压力的半高全宽，FWHM）。换能器的焦平面通过动物颅骨，在与耳杆相交的水平面内进行定位。
<ol>
	<li>为啮齿类动物选择合适的用于血脑屏障开放的换能器。 
	注意：根据微泡的特性及所用频率，声学参数（特别是机械指数 MI）可能需要相应调整13,38。</li>
	<li>将换能器安装至3D打印的锥形装置中。</li>
	<li>在锥形装置的底端使用声学透明的聚酯薄膜（Mylar膜），以实现声束传播路径的声学耦合，并将锥形容器内注满脱气水。</li>
	<li>如图1所示，将换能器安装在动物上方的电动线性平台上，以实现换能器的自动垂直定位。</li>
	<li>根据研究需求设计可拆卸的立体定位平台，该平台应包括温度可控的加热装置、门齿固定器和耳杆、麻醉系统以及多模态定位标记物，如图1和图2所示。立体定位平台的安装采用二维线性平台系统，可在声束下方对动物进行精确的自动定位（&#60; 0.1 mm）。</li>
	<li>将换能器连接至如图1所示的声发射链路，该链路由换能器、函数发生器和功率放大器组成。</li>
	<li>建立图像处理流程，用于检测多模态定位标记物，从而实现对目标脑区的精确定位超声穿孔，并采集针式水听器检测到的空化信号数据。</li>
	<li>校准系统，并确定换能器焦点位置与动物在立体定位平台上垂直位置的对应关系。</li>
</ol>
2. 动物准备
注意：以下实验方案是针对小鼠设定的，但也可适用于大鼠。本实验使用雌性裸鼠 Foxn1-/-（6-8 周龄）。
<ol>
	<li>让动物在动物房中适应至少一周，并定期称重。</li>
	<li>在FUS治疗前30分钟，通过皮下注射给予布托啡诺（0.05 mg/kg）以启动镇痛治疗。</li>
	<li>用 3% 异氟烷、2 L/min 氧气麻醉动物2 并确认动物已深度麻醉。在整个操作过程中保持动物处于麻醉状态，并监测其呼吸频率和心率，根据需要调整异氟烷浓度。</li>
	<li>涂抹眼药膏以防止眼睛干燥并避免可能的损伤。</li>
	<li>用剃须刀和脱毛膏去除头部顶部的毛发，然后用水清洗以去除残留物，避免对皮肤造成刺激。</li>
	<li>对于使用生物发光成像（BLI）肿瘤模型的实验，采用29 G胰岛素注射器经腹腔注射（i.p.）150 µL D-荧光素（30 mg/mL），用于BLI成像引导。</li>
	<li>插入26-30 G尾静脉导管，并用少量肝素溶液（5 UI/mL）冲洗导管和静脉。用肝素溶液充满导管，以防止血液凝固。 
	注意：当导管内出现血液反流时，表明导管插入效果良好。应避免导管内存在气泡，以防发生栓塞。为避免注射压力过高，应确保导管长度尽可能短。</li>
	<li>将动物置于温度可控的立体定位平台上，以避免低体温。 
	注意：低体温会减少血液循环，从而可能影响微泡的注射/循环以及药物的药代动力学39.</li>
	<li>使用耳杆和咬合杆将动物头部固定在立体定位仪平台上，并用绑带固定身体，再用胶带将动物尾巴固定在平台上。</li>
</ol>
3. 体内成像引导聚焦超声
注意：本实验方案采用1 MHz单元素换能器，使用持续时间为10 ms的脉冲串脉冲，机械指数（MI）为0.4，脉冲重复频率为1.6 Hz，共40个周期，持续240秒。该方案针对以六氟化硫（SF6）作为惰性气体、由磷脂稳定的微泡进行优化，微泡平均直径为2.5 μm，且超过90%的微泡直径小于8 μm。
<ol>
	<li>将装有动物的立体定位平台置于成像设备中（例如, 生物发光成像或X射线成像，并对动物进行图像采集。</li>
	<li>结合多模态配准标记物与图像处理流程，根据换能器的焦点位置标记动物的位置。</li>
	<li>通过将脑部轮廓图覆盖在获取的X射线图像上，或利用BLI图像确定肿瘤中心，以确定目标区域（图2). 特定脑区的位置在Paxinos脑图谱中有明确标注40 以颅骨标记点bregma和lambda作为参考点。例如，脑桥位于相对于lambda的x=-1.0、y=-0.8、z=-4.5处。</li>
	<li>用胶带遮住动物的鼻孔和口部，以防止超声耦合剂干扰呼吸。</li>
	<li>在动物头部涂抹超声耦合剂。</li>
	<li>回缩动物颈部的皮肤，用超声耦合剂润滑针式水听器，并将针式水听器置于枕骨附近。</li>
	<li>使用图像处理流程和焦点来引导换能器到达正确位置。</li>
	<li>将预设参数应用于所有连接的设备，并定位目标脑区。 
	注意：根据研究问题的不同，可对肿瘤或脑区进行单焦点或立体容积形状的声孔效应处理，如图所示 图2.</li>
	<li>按照制造商说明激活微泡。注射120 µL（5.4 µg）微泡作为单次推注。</li>
	<li>用生理盐水冲洗尾静脉导管，以检查导管是否通畅。</li>
	<li>注射微泡并开始超声辐照。</li>
	<li>使用针式水听器记录微泡空化现象。</li>
	<li>声孔效应后给予血管内对比剂或药物。剂量、给药时机和方案取决于研究目的及所用药物。 
	注意：伊文思蓝是一种常用的染色剂，用于评估血脑屏障的开放情况41.</li>
	<li>在预定时间点或人道终点之前持续监测动物。</li>
</ol>
4. 微泡空化分析
注意：此处描述的是适用于SF体内实验的步骤6- 平均直径为2.5 µm（80%的微泡直径小于8 µm）的磷脂微泡，采用McDannold等人最初提出的方法，以持续时间为10 ms、频率为1 MHz的脉冲超声激发。12.
<ol>
	<li>将记录的 PCD 信号从时域通过傅里叶变换转换到频域。</li>
	<li>对稳定空化检测的 2nd 和 3rd 倍频（± 50 kHz）附近的谱功率进行积分，如 图 3 所示（2 MHz 和 3 MHz 处的绿色框）。</li>
	<li>对惯性空化检测的谱功率进行积分，范围包括主频率、2nd 和 3rd 倍频、1st 和 2nd 超谐波以及第一分谐波（± 150 kHz），如 图 3 所示（红色框）。</li>
	<li>对主频率附近（1 MHz ± 50 kHz）的谱功率进行积分，用于归一化先前获得的两个 PCD 信号。 
	注：在 1 MHz 条件下，SF6-磷脂微泡的体内实验中，PCD 信号在惯性空化发生前不显示超谐波或分谐波，如 图 3 所示。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究开发了一种经济高效的基于影像引导的聚焦超声（FUS）系统，用于实现血脑屏障（BBB）的短暂开放，从而提高药物向脑实质的递送效率。该系统主要由市售组件构成，并结合了X射线和生物发光成像（BLI）。所提出的模块化设计支持在高通量工作流程中使用多种成像模态进行治疗规划与评估。该系统可与更全面的高分辨率三维成像模态（如高分辨率磁共振成像或显微CT）联合使用，而在大部分研究中则采用二维成像模态，例如二维X射线和/或BLI。二维X射线和/或BLI不仅成本显著更低，而且由于各自的采集时间较短，非常适合大样本量的研究。本文所述的换能器适用于在脑部较深区域（f数为1.25）产生较大范围的血脑屏障开放（其尺度相当于小鼠脑大小）。我们已将该系统用于脑桥区域弥漫性生长的肿瘤研究43,44。对于这些区域，需要对脑桥内包含整个肿瘤区域的大体积组织进行声孔效应处理。该模块化系统可轻松调整，适用于大脑幕上其他类型的脑肿瘤。在选择换能器类型时，应综合考虑其f数、焦距和频率。
总体设计相较于先前...

血脑屏障（BBB）是药物递送至脑实质的主要障碍。大多数已开发的治疗药物由于其理化参数（如脂溶性、分子量、氢键受体和供体）无法穿过血脑屏障，或因其对脑内外排转运蛋白具有亲和力而无法在脑内滞留1,2。能够穿过血脑屏障的药物仅占少数，通常是小分子脂溶性化合物，且仅对有限种类的脑部疾病有效1,2。因此，针对大多数脑部疾病，药理学治疗选择有限，亟需开发新的药物递送策略3,4。
治疗性超声是一种新兴技术，可用于多种神经学应用，如血脑屏障破坏（BBBD）、神经调节和消融4,5,6,7。为了通过颅骨使用体外超声发射器实现血脑屏障开放，通常将聚焦超声（FUS）与微泡联合使用。微泡介导的FUS可提高药物在脑实质中的生物利用度5,8,9。在声波作用下，微泡开始振荡，从而启动跨细胞转运并破坏血脑屏障内皮细胞间的紧密连接，促进大分子的旁细胞运输10。先前的研究已证实，声学发射强度与血脑屏障开放所引起的生物学效应之间存在相关性11,12,13,14。FUS联合微泡技术已在临床试验中用于胶质母细胞瘤的治疗，化疗药物包括替莫唑胺或脂质体多柔比星，同时也用于阿尔茨海默病和肌萎缩侧索硬化症的治疗5,9,15,16。
由于超声介导的血脑屏障开放为药物治疗带来了全新的可能性，因此需要开展临床前研究以推动其临床转化，并评估所选药物候选物的治疗反应。这通常需要一个兼具高空间精度和集成空化检测功能的高通量工作流程，以实现对靶向血脑屏障开放的高重复性监测。如果可能，这些系统在初始投资和运行成本方面都应具有成本效益，以便根据研究规模进行扩展。大多数临床前FUS系统均与磁共振成像（MRI）结合，用于影像引导和治疗规划15,17,18,19。尽管MRI能够提供有关肿瘤解剖结构和体积的详细信息，但它是一种昂贵的技术，通常需要由经过培训或具备专业技能的操作人员来执行。此外，高分辨率MRI在临床前研究机构中并不总是可及，且每只动物的扫描时间较长，使其不太适用于高通量药理学研究。值得注意的是，在神经肿瘤学领域的临床前研究中，特别是对于浸润性肿瘤模型，能够可视化并精确定位肿瘤是治疗成功的关键20。目前，这一需求仅能通过MRI，或通过转导了光蛋白的肿瘤实现，后者可在给予光蛋白底物后利用生物发光成像（BLI）进行可视化。
磁共振引导的聚焦超声（FUS）系统通常采用水浴以确保超声波在经颅应用中的有效传播，其中动物头部部分浸入水中，即所谓的“自下而上”系统15,17,18。尽管这类设计在小型动物研究中通常表现良好，但在动物准备时间、便携性以及使用过程中实际可维持的卫生标准之间仍存在权衡。作为磁共振成像的替代方案，其他用于立体定向导航的引导方法包括使用大鼠解剖图谱21,22,23、激光指示器辅助的视觉定位24、针孔辅助的机械扫描装置25，或生物发光成像（BLI）26。这些设计大多为“自上而下”系统，其中换能器置于动物头部上方，动物保持自然体位。“自上而下”工作流程可采用水浴22,25,26或充满水的锥形容器21,24。将换能器置于封闭锥形容器内使用的优点在于结构更紧凑、设置时间更短，并且易于去污，从而简化了整个操作流程。
声场与微泡的相互作用依赖于压力，其范围从低振幅振荡（称为稳定空化）到瞬态气泡破裂（称为惯性空化）27,28。目前已有明确共识：超声诱导血脑屏障开放（ultrasound-BBBD）需要声压显著高于稳定空化的阈值，以实现有效的血脑屏障开放，但同时应低于惯性空化的阈值，因为后者通常与血管/神经损伤相关29。最常见的监测与控制方法是采用被动空化检测（PCD）分析（背向）散射的声学信号，如McDannold等人所建议12。PCD依赖于对微泡发射信号傅里叶谱的分析，可实时测量稳定空化的特征信号（谐波、次谐波和超谐波）以及惯性空化的标志信号（宽带响应）的强度与出现情况。
由于微泡制剂的多分散性（振荡幅度强烈依赖于气泡直径）、不同品牌气泡壳层特性的差异，以及声学振荡对频率和压力的高度依赖性，实现精确压力控制的“通用型”PCD分析较为复杂30,31,32。因此，已提出多种不同的PCD检测方案，这些方案针对上述各项参数的特定组合进行了优化，并已应用于多种场景（从体外实验、小动物研究到临床PCD应用），以实现稳定的空化检测，甚至用于压力的回溯性反馈控制11,14,30,31,32,33,34,35。本研究中所采用的PCD方案直接源自McDannold等人的研究12，通过监测谐波发射以检测稳定空化，并通过宽带噪声检测惯性空化。
我们开发了一种基于影像引导的神经导航聚焦超声（FUS）系统，用于暂时性开放血脑屏障（BBB），以增强药物向脑实质的递送。该系统基于 commercially available components（市售组件），可根据动物实验设施中可用的成像技术，轻松适配多种不同的成像模式。由于我们需要高通量的工作流程，因此选择使用X射线和生物发光成像（BLI）进行影像引导和治疗规划。经光蛋白（例如荧光素酶）转导的肿瘤细胞适用于BLI成像20。在给予光蛋白底物后，可在活体中监测肿瘤细胞，并确定肿瘤的生长情况和位置20,36。BLI是一种低成本的成像方式，能够长期追踪肿瘤生长，具有快速扫描的优势，并且与MRI测量的肿瘤生长结果具有良好相关性36,37。我们选择用一个连接在换能器上的注水锥形装置替代传统的水浴，以提高灵活性，使安装实验动物的平台可自由移动8,24。该设计基于一个可拆卸平台，集成了（I）小动物立体定位平台，（II）兼容X射线和光学图像的定位标记物，（III）快速拆卸式麻醉面罩，以及（IV）集成的温度调控动物加热系统。在初始麻醉诱导完成后，动物被精确地固定在平台上，并在整个实验过程中保持该位置不变。因此，整个平台可依次通过干预流程中的各个工作站，同时维持精确且可重复的定位以及持续的麻醉状态。控制软件可自动检测定位标记物，并将所有类型的图像和成像模态（即micro-CT、X射线、BLI和荧光成像）自动注册到立体定位平台的参考坐标系中。借助自动校准程序，超声换能器的焦距被精确定位，从而实现干预规划、声学递送和随访成像分析的自动融合。如图1和图2所示，该装置具有高度灵活性，可用于设计专用的实验工作流程，并支持在不同工作站对动物进行交替操作，从而促进高通量实验的开展。我们已成功将该技术应用于高级别胶质瘤（如弥漫性中线胶质瘤）的小鼠异种移植模型中的药物递送。

<table><tbody><tr><td>1 mL 鲁尔锁注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309628</td><td>Plastipak</td></tr><tr><td>19 G 针头</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN1938R1</td><td></td></tr><tr><td>23 G 针头</td><td>Terumo Agani</td><td>8AN2316R1</td><td></td></tr><tr><td>3M Transpore 外科胶带</td><td>科学应用于生命</td><td>7000032707</td><td>或类似物</td></tr><tr><td>任意波形发生器</td><td>Siglent</td><td>未提供</td><td>SDG1025，25 MHz，125 Msa/s</td></tr><tr><td>自动立体定位</td><td>自制</td><td>未提供</td><td>立体定位仪的所有部件均为自制</td></tr><tr><td>布鲁克In-Vivo Xtreme</td><td>Bruker</td><td>未提供</td><td>包含软件</td></tr><tr><td>缓冲氯化钠溶液</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>220/12257974/110</td><td></td></tr><tr><td>盐酸丁丙诺啡</td><td>Indivior UK Limited</td><td>无可用数据</td><td>0.324 mg</td></tr><tr><td>笼具环境丰富化：纸浆智能窝</td><td>生物服务</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>碳过滤器</td><td>Bickford</td><td>NC0111395</td><td>Omnicon f/air</td></tr><tr><td>陶瓷勺</td><td>无</td><td>未提供</td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td>未提供</td><td>无</td><td></td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Gold Biotechnology</td><td>LUCK-1</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>VUmc 药房</td><td>未提供</td><td>70%</td></tr><tr><td>伊文思蓝</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Fresenius 氯化钠 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>未提供</td><td>0.9% NaCl，1000 mL</td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>Braun Surgical</td><td>未提供</td><td>Histoacryl 0.5 mL</td></tr><tr><td>水听器</td><td>精密声学</td><td>无可用数据</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>324825/324826</td><td>0.5 mL 和 0.3 mL</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>TEVA Pharmachemie BV</td><td>8711218013196</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Alfasan</td><td>未提供</td><td>10 %，10 mL</td></tr><tr><td>小鼠饲料：Teklad 全球 18% 蛋白质啮齿类动物饲料</td><td>Envigo</td><td>2918-11416M</td><td></td></tr><tr><td>Neoflon 导管</td><td>Becton Dickinson</td><td>391349</td><td>26 号针头，0.6 mm × 19 mm</td></tr><tr><td>示波器</td><td>是德科技</td><td>未提供</td><td>InfiniiVision DSOX024A</td></tr><tr><td>塑料管</td><td>Greiner bio-one</td><td>210261</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>功率放大器</td><td>电子学 &amp;amp; Innovation Ltd</td><td>210L</td><td>Model 210L</td></tr><tr><td>前置放大器直流耦合器</td><td>精密声学</td><td>n..</td><td>序列号：DCPS94</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>或类似物</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>AST Farma</td><td>未提供</td><td>2%</td></tr><tr><td>SonoVue 微泡</td><td>Bracco</td><td>无可用数据</td><td>8 &amp;micro;l/ml</td></tr><tr><td>无菌水</td><td>Fresenius Kabi</td><td>无可用数据</td><td>1000 mL</td></tr><tr><td>注射器</td><td>未提供</td><td>无可用数据</td><td>可以使用各种注射器</td></tr><tr><td>丁丙诺啡</td><td>Indivior UK limitd</td><td>未提供</td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>传感器</td><td>精密声学</td><td>未提供</td><td>1 MHz</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4142-1EA</td><td>或类似物</td></tr><tr><td>超声耦合剂</td><td>Parker Laboratories Inc.</td><td>01-02</td><td>Aquasonic 100</td></tr><tr><td>Vidisic 凝胶</td><td>博士伦</td><td>无可用数据</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

A High-Throughput Image-Guided Stereotactic Neuronavigation and Focused Ultrasound System for Blood-Brain Barrier Opening in Rodents

血脑屏障（BBB）一直是治疗多种脑部疾病的主要障碍。由紧密连接连接的内皮细胞构成了一道生理屏障，阻止大分子（&#62;500 Da）进入脑组织。微泡介导的聚焦超声（FUS）可用于诱导血脑屏障短暂的局部开放，使较大的药物能够进入脑实质。
除了用于临床转化的大型临床设备外，针对药物候选物治疗反应评估的临床前研究还需要专用的小动物超声装置，以实现靶向血脑屏障开放。理想情况下，这些系统应支持高通量工作流程，兼具高空间精度和集成的空化监测功能，同时在初始投资和运行成本方面具有较高的成本效益。
本文介绍了一种基于商用组件的生物发光与X射线引导的小动物FUS立体定位系统，该系统满足上述各项要求。特别强调了高度自动化，以应对高通量临床前药物评价研究中常见的挑战。这些挑战包括需要实现标准化，以确保数据的可重复性、降低组内变异、减少样本量，从而符合伦理要求并减轻不必要的工作负担。所提出的BBB系统已在胶质母细胞瘤和弥漫性中线胶质瘤的患者来源异种移植模型中，用于BBB开放介导的药物递送试验，完成了验证。

所描述的FUS系统（图1 和 图2）及相关工作流程已在超过100只动物中应用，成功获得了健康小鼠及荷瘤小鼠的可重复数据。根据微泡团注峰值时刻记录的空化信号及其谐波处的谱密度，可通过傅里叶分析计算各频率的谱功率，具体方法见操作步骤4。依据声学参数协议（1 MHz，10 ms脉冲持续时间，机械指数MI为0.4）结合微泡造影剂的使用，可获得归一化的二次谐波积分功率谱nd 和 3rd 谐波对观察到的激发频率的积分功率谱进行了归一化处理 图3这提供了一种非常灵敏且可靠的稳定空化检测方法，相比之下，在未注射微泡或施加0.6机械指数（MI）时未检测到次谐波。在发生惯性空化的情况下，可检测到宽带噪声基底升高，最高达25 dB，同时出现超谐波和次谐波。尽管0.4和0.6 MI对应的声压未引起宏观损伤，但在0.6 MI时，组织学检查证实已出现微观损伤，如图所示 图4. 将压力振...

血脑屏障（BBB）可通过微泡介导的聚焦超声（FUS）实现暂时性开放。本文介绍了一种使用模块化FUS系统在体内进行高通量BBB开放的逐步操作方案，该系统便于非超声专业人员使用。

血脑屏障（BBB）一直是治疗多种脑部疾病的主要障碍。由紧密连接连接的内皮细胞构成了……

高级别胶质瘤（如弥散性内生性脑桥胶质瘤）具有高度侵袭性，致死率高。尽管经过多年的广泛研究，血脑屏障仍然是一个重要难题，因为化疗药物难以有效到达脑组织。幸运的是，聚焦超声能够暂时且局部地打开血脑屏障，从而实现有效的治疗。我们开发了一种小型且经济高效的神经导航聚焦超声系统，用于血脑屏障的开放。该系统采用 commercially available 组件构建，具有高度自动化，可用于临床前药物评价研究。精准医疗的定义是：在正确的时间为正确的患者提供正确剂量的正确药物。为此，需要筛选大量预先选定的药物。我们紧凑型高通量聚焦超声系统可用于血脑屏障开放，正是实现这一目标的有效工具。本次实验操作将由我研究团队的两名博士生 Rianne Haumann 和 Elvin t Hart 进行演示。图像引导的立体定向神经导航聚焦超声的工作流程包括在超声平台上进行介入成像和声学耦合，以实现声孔效应。之后，可进行随访成像。根据所设计实验的要求，选择合适的换能器。将其置于一个装有脱气水的3D打印锥形容器中，容器底部由声学透明的Mylar膜封闭。将换能器连接至函数发生器和功率放大器。将换能器安装在电动线性位移平台上，以实现自动垂直定位，并将其连接至功率放大器。使用可拆卸的立体定位平台，该平台包含温度可控的加热装置、门齿固定杆和耳杆、麻醉系统以及多模态定位标记物。将该平台连接至二维线性移动平台。在使用FUS系统之前，需对其进行校准，并确定换能器的焦点位置。焦点位置对应于动物在立体定位平台上的垂直位置。动物到达后，需在实验环境中适应至少一周，并定期称重。实验当天，在聚焦超声（FUS）处理前30分钟，通过皮下注射给予布托啡诺。麻醉小鼠后，涂抹眼药膏以防止眼睛干燥。如有必要，使用剃刀和脱毛膏去除动物头部的毛发。用水清洗皮肤，以去除任何残留物。对于使用BLI肿瘤模型的实验，用29号胰岛素注射器腹腔内注射150微升D-荧光素酶底物。为进行微泡给药以开放血脑屏障，插入26至30号尾静脉导管，并用少量肝素溶液冲洗静脉。使用组织胶带固定导管，防止其脱落。如果插管成功，用肝素溶液填充导管以防止血液凝固。将动物置于温度可控的立体定位平台上，以避免低体温。使用咬合杆和耳杆固定动物头部，并用胶带将尾巴和导管固定在平台上。用绑带固定小鼠的躯体。将固定好小鼠的立体定位平台置于成像设备中，对动物进行成像。确定动物是否在平台上正确放置。根据换能器的焦点位置，结合多模态定位标记和图像处理流程来标记动物的位置。通过在获取的X射线图像上叠加脑轮廓，或利用生物发光成像（BLI）图像确定肿瘤中心，以确定靶区。在放置换能器之前，用胶带覆盖动物的鼻孔和口腔，以防止超声耦合剂干扰呼吸。在小鼠头部涂抹超声耦合剂，以确保声波的良好传导。将针式水听器置于枕骨附近，记录微泡空化信号。根据校准值，引导换能器至动物体上方的正确位置。应用预设参数至所有连接的设备，以靶向目标脑区。将换能器置于正确位置后，按照制造商说明溶解并激活微泡。在注射微泡前，用生理盐水冲洗尾静脉导管，以确认尾静脉通路通畅。启动超声辐照轨迹，同时注射微泡。此时，针式水听器将实时检测并验证微泡空化效应。如需要，可在声穿孔后给予血管内对比剂或药物。持续监测动物直至预定时间点。当机械指数（MI）为0.4并结合微泡使用时，声压可实现稳定空化效应的高灵敏度和可靠检测；相比之下，未注射微泡时无法检测到次谐波信号，而在MI为0.6时则观察到惯性空化现象。尽管MI高达0.6的声压未引起肉眼可见的组织损伤，但在MI为0.6时，组织学检查已可观察到显微镜下的组织损伤。压力振幅为机械指数（MI）0.8时，导致较大血管出现肉眼可见的脑出血以及广泛组织溶解，并伴有红细胞外渗。通过静脉注射伊文思蓝以验证脑桥区域血脑屏障（BBB）的开放。在接受聚焦超声（FUS）联合微泡处理的小鼠中，观察到伊文思蓝偶联白蛋白在脑桥和小脑水平外渗，表明对目标区域实现了精确定位。本方案最关键的步骤包括尾静脉导管的正确放置、动物的定位与靶向，以及结合空化检测的微泡注射与聚焦超声操作。该自制的聚焦超声系统可根据多种研究问题进行调整和重新设计，同时具备成本效益高和工作流程自动化的特点，适合经验相对不足的研究人员使用。

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科研

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Neuroscience

神经科学

高通量图像引导立体定向神经导航和聚焦超声系统，用于在啮齿动物中打开血脑屏障

微泡介导的聚焦超声破坏血脑屏障（BBB）是一种有前景的脑部靶向药物递送无创技术1-3。本方案概述了在大鼠模型中进行磁共振成像引导下经颅BBB破坏的实验操作流程。...

磁共振成像引导下利用经颅聚焦超声在大鼠模型中破坏血脑屏障

本视频介绍了一种通过微泡介导的聚焦超声（FUS）产生短暂开放来暂时性破坏血脑屏障（BBB）的方法。这些短暂的局部血脑屏障开放最终可用于将较大分子量的药物直接递送至脑实质。...

基于聚焦超声的微泡介导血脑屏障开放：一种通过声孔效应在小鼠血脑屏障中创建局部瞬时开放的技术

聚焦超声结合微泡造影剂可实现血脑屏障的局部和短暂开放。该技术已被用于递送多种物质通过血脑屏障。本文提供了一种在有或无磁共振成像（MRI）引导下，向啮齿类动物脑部进行局部递送的详细实验方案。...

利用聚焦超声在大鼠模型中实现特定部位血脑屏障开放的台式实验方法

本方案详细阐述了通过聚焦超声开放血脑屏障（BBB）进行基因递送的必要步骤，以及通过组织学检测评估基因表达水平和化学遗传受体神经调控活性的方法。...

聚焦超声诱导血脑屏障开放以靶向脑结构并评估化学遗传学神经调控

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内...

利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

本研究描述了一种结合磁共振成像（MRI）与低强度脉冲聚焦超声（FUS）的方案，利用颈静脉插管的活体大鼠来监测血脑屏障（BBB）的开放情况。...

使用临床前聚焦超声系统监测大鼠血脑屏障开放

一种将质粒DNA导入小鼠视网膜细胞以开展功能获得或功能缺失研究的方法 体内...

体内 电穿孔转染发育中小鼠视网膜

本报告中，我们介绍一种完全自动化且高度多功能的系统，该系统能够同时检测啮齿类动物的多种认知行为并记录其神经元活动。...

一种用于检测啮齿类动物多认知功能及记录神经元活动的全自动化且高度多功能的系统

本文描述了一种利用微泡和超声在小鼠中广泛开放血脑屏障的技术。通过该技术，可将锰递送至小鼠脑内。由于锰是一种可在去极化神经元中蓄积的磁共振成像（MRI）对比剂，该方法可实现对神经元活动的成像。...

利用超声波血脑屏障破坏结合锰增强磁共振成像进行功能性神经影像学研究

本方案描述了如何使用近期开发的用于标准体外电生理学设备的系统，开展自动图像引导的膜片钳实验。...

应用自动化图像引导膜片钳技术研究脑片中的神经元

学习使用模块化聚焦超声系统在啮齿动物中实现血脑屏障暂时性开放的方法。该技术通过微泡介导的声孔效应促进药物递送，适用于胶质瘤等中枢神经系统疾病的精准医疗研究。

一种用于啮齿类动物血脑屏障开放的高通量图像引导立体定向神经导航与聚焦超声系统

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