Name: 肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 学习利用尾静脉注射模型研究小鼠肺转移瘤负荷，结合数字图像分析技术实现精准定量。该方法高效、经济且可重复，为癌症转移研究提供可靠的实验方案。

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本研究的代表性数据由美国国家癌症研究所（资助号：K22CA218549，授予S.T.S）提供支持。此外，我们感谢俄亥俄州立大学综合癌症中心比较病理学与小鼠表型分析共享资源平台（负责人：Krista La Perle，DVM，PhD）在组织学和免疫组织化学服务方面的支持，以及病理成像核心在算法开发与分析方面的协助，他们对本文所报告的综合分析方法的建立提供了帮助。

动物使用遵循俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议 2007A0120-R4（项目负责人：Gina Sizemore 博士）下的大学实验动物资源中心（ULAR）规定。
1. 乳腺癌细胞尾静脉注射
<ol>
	<li>注射用细胞和注射器的准备
	<ol>
		<li>根据小鼠数量和拟使用的细胞浓度，接种适量的细胞。 
		注意：注射的细胞数量以及转移灶形成的时间取决于所使用的细胞系，需进行优化。在本演示中，将 1 × 106 个 MDA-MB-231 细胞通过静脉注射注入 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 小鼠体内，注射后最迟在 24 天内可观察到肉眼可见的肺部病灶。对于 MVT1 小鼠乳腺肿瘤细胞系17，将 3 × 106 个细胞注射入免疫功能健全的 FVB/N 小鼠，14 天内即可观察到大量肺转移灶22,23。</li>
		<li>吸除培养基，并用 1× PBS 清洗细胞培养板。用最小体积的胰蛋白酶消化细胞，加入适量培养基，使用血细胞计数板或其他常用方法进行细胞计数。可使用台盼蓝（0.4%）或其他活/死细胞染料来确定活细胞数量。</li>
		<li>以 180 × g 离心 5 分钟，收集细胞。</li>
		<li>将适量细胞重悬于无菌 1× PBS 中，使每只小鼠注射体积为 100 µL。将细胞悬液置于冰上以维持细胞活性。</li>
		<li>注射前，使用 200 µL 或 1 mL 移液器充分重悬细胞，避免细胞聚集。用 28 G 胰岛素注射器吸取 100 µL 细胞悬液（参见材料表）。</li>
		<li>将注射器保持垂直，轻弹注射器并缓慢调节活塞，以排除所有气泡。静脉内注射气泡可能导致空气/气体栓塞，可能致命。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尾静脉侧向注射 
	注意：在实验性乳腺癌转移检测中，注射操作应在&#62; 6 周龄的雌性小鼠上进行。
	<ol>
		<li>抓住小鼠尾巴，将其滑入适当尺寸的带槽管状固定装置中（参见材料表中所用的固定装置）。</li>
		<li>插入固定装置的堵头部分，将小鼠侧放，使其侧尾静脉易于观察。小鼠尾部有一条腹侧动脉，与生殖器成一直线，一条背侧静脉，以及两条侧尾静脉。</li>
		<li>用无菌擦拭巾清洁小鼠尾部表面。用非优势手的拇指和食指夹住尾部，并施加轻微张力。</li>
		<li>从尾部远端开始，将针头以斜面朝上的方向平行于静脉插入。</li>
		<li>如允许操作，小心地将针头套回保护帽并弯成 20–30° 角。强烈推荐使用单手操作法或专用针头回套装置。 
		注意：无需回抽确认，因为这可能导致静脉塌陷。然而，针头刚进入时可能会看到少量血液回流。正确插入后，针头应能顺利进入静脉。</li>
		<li>缓慢将全部体积注入静脉。推动活塞时不应感到阻力。</li>
		<li>若感到任何阻力，应立即拔出注射器针头。如需重新穿刺，可再次插入针头（理想情况下不超过 3 次），向尾部近端或对侧侧尾静脉移动。</li>
		<li>注射后可能会有少量血液被挤出。用无菌纱布轻轻按压，并用无菌擦拭巾擦拭。</li>
		<li>立即将注射器丢弃至合适的锐器容器中。</li>
		<li>将小鼠放回清洁、通风良好的笼具中，并监测其是否出现痛苦迹象。</li>
		<li>每周监测 2–3 次小鼠是否出现转移形成的迹象（呼吸困难、弓背姿势、体重减轻）以及一般性不适。转移灶形成的时间取决于细胞系和小鼠品系。</li>
		<li>若使用活体动物成像设备，应在尾静脉注射后立即对小鼠进行成像，以确认细胞注射成功并获取“零时间点”数据（本文未包含活体生物发光成像的具体细节，相关内容可参见 Yang 等人24的描述）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肺组织固定及转移性肺肿瘤负荷分析
<ol>
	<li>肺组织膨胀以维持肺部结构形态，用于组织病理学检查
	<ol>
		<li>按照批准的安乐死程序（例如，以每分钟30-70%的腔室体积置换率使用二氧化碳）&#160;操作后，将小鼠尸体用针固定在解剖板上。可喷洒或涂抹70%乙醇，以防止解剖过程中毛发干扰。&#160; 
		注意：二氧化碳窒息可能导致肺出血，这是一种预期的背景性病变，尤其在较低流速时更为明显。</li>
		<li>沿中线切开胸腔，将切口向头侧和尾侧延伸至腹膜，并通过夹住剑突切除膈肌。</li>
		<li>使用另一把剪刀（避免钝化刀刃），沿胸骨两侧剪断肋骨，并小心移除肋骨笼，为肺组织膨胀留出空间。</li>
		<li>通过去除下颌下唾液腺和舌骨下肌群暴露气管。在气管两侧放置固定针，可防止插入针头时发生不必要的移动。</li>
		<li>用26 G注射器吸取2–3 mL 10%中性缓冲福尔马林，插入气管。</li>
		<li>缓慢注入福尔马林，并观察肺组织膨胀情况（通常需要约1.5 mL福尔马林）。</li>
		<li>当福尔马林开始从肺组织渗出时（避免过度膨胀），用镊子夹闭气管，拔出注射器针头，并分离整个呼吸系统。将肺、心脏等组织直接放入福尔马林中，后续可在固定后进行进一步修整。</li>
		<li>采用标准方法完成组织处理、包埋、切片及苏木精-伊红（H&amp;#38;E）染色。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肺转移瘤负荷分析
	<ol>
		<li>使用高分辨率切片扫描仪以40倍放大倍率扫描H&amp;#38;E染色的肺组织切片（图3）。</li>
		<li>将图像导入图像分析软件（例如Visiopharm图像分析系统），用于定量分析肺转移灶。 
		注意：建议新用户参加现场或在线培训以掌握图像分析软件的使用。该商业网站还提供多种网络研讨会。</li>
		<li>从软件的应用库中选择Visiopharm 10118 H&amp;#38;E肺转移瘤分析应用（App）。 
		注意：该应用旨在对H&amp;#38;E染色切片上的肺转移灶进行标记和定量。作为10118 H&amp;#38;E肺转移瘤应用的一部分，第一步图像处理通过“组织检测应用”对肺组织进行分割；第二步图像处理使用“转移灶检测应用”，识别肺组织内的转移灶。转移灶通过形态特征进行识别，而形态异常、颜色过红或分布过稀疏的区域则不被识别为转移灶。</li>
		<li>调整定义形态和稀疏度的参数，使其最佳匹配代表性图像。肿瘤转移灶和正常肺组织的分割区域可使用不同颜色标签显示每种组织类型。 
		注意：如果该应用无法准确区分转移灶与正常肺组织，则可能需要使用Visiopharm决策森林程序编写自定义应用（如本实验所做，见图2和图3）。自定义算法的编写细节如下所述。否则，请继续执行步骤2.2.9。</li>
		<li>打开决策森林程序，该程序通过在目标图像上训练多个类别（即肺组织（非肿瘤性）、转移灶、红细胞、上皮细胞和/或空白区域）来工作。在图2中，肿瘤转移灶为蓝色，正常组织为绿色，细支气管上皮为黄色。此外，红细胞为红色，气腔为空粉色。</li>
		<li>根据系统提示的一系列是非问题，对每个类别进行适当训练。算法的准确性决定了所需的是非问题数量。在本分析中，自定义算法/应用的准确性设定为50（范围0–100）。</li>
		<li>通过应用锐化、模糊、按形状排序等滤镜，调整每个类别的特征，以提高算法/应用的准确性。Visiopharm通过一个或多个称为特征的“镜头”来观察每个类别。特征改变类别观察图像的方式，以突出特定颜色或强度。 
		注意：对于自定义算法，面积≥8500 µm2的转移灶被标记并计为转移灶。此设定考虑了尺寸变异以及过小而无法检测的转移灶。面积小于8500 µm2的小型异常形态区域和小型转移灶被归入正常组织定量范围。</li>
		<li>保存来自应用或自定义算法的修改后设置，然后将该算法/应用应用于整套或一系列H&amp;#38;E染色组织切片。</li>
		<li>最后，导出所有输出变量，包括表1中列出的内容。每种组织类型的面积（以平方微米，µm2计）可被量化，百分比则基于标本的净组织总面积（即总组织面积减去气腔面积）计算得出。</li>
		<li>在创建自定义算法时，应与经美国兽医病理学家学院认证的兽医病理学家共同审阅组织标注，以确保测量准确并正确区分不同组织类型。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Brown, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Stereology+Applications+for+the+Pathologist%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Practical Stereology Applications for the Pathologist.</a> Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).</li>
<li>Aeffner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Microscopy%2C+Image+Analysis%2C+and+Virtual+Slide+Repository%5BTitle%5D)+AND+%22Institute+for+Laboratory+Animal+Research+Journal%22%5BJournal%5D)">Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository.</a> Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

随着研究人员继续采用静脉注射肿瘤细胞作为转移的实验模型，目前尚缺乏分析由此产生的转移性肿瘤负荷的标准操作规范。在某些情况下，通过对特定细胞系进行操作和/或使用化学化合物后，可在宏观上观察到转移性肿瘤负荷的显著差异。然而，在其他情况下，若不进行详尽的病理学分析，转移灶的定植和生长的细微差异可能会被忽视或误判。本研究在先前发表的尾静脉注射方案基础上，进一步提出了一种全面的转移性肺部肿瘤负荷分析方法。重要的是，这种数字病理学分析方法也可用于定量分析原位注射具有自发转移能力的肿瘤细胞后所产生的肺转移性肿瘤负荷，以及其他实验性转移模型（如心内注射等）和患者来源的异种移植（PDX）模型中的肺转移负荷。通过兽医病理学家使用数字成像和软件算法开发，确保了该方法在分析转移性肺部肿瘤负荷时具备可重复性、准确性和全面性25。
根据已发表的研究或通过严谨的实验优化，慎重选择细胞系、细胞浓度以及检测终点至关重要。鉴于转移性定植过程高度依赖于与多种免疫细胞群体的相互作用26,<sup clas...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

尽管转移是一个高度复杂且效率低下的过程1，但它却是导致癌症患者发病和死亡的重要因素2。事实上，大多数与癌症相关的死亡均归因于疾病的转移性扩散3,4。为了成功转移，肿瘤细胞必须从原发部位脱离，侵入邻近的间质组织，进入血液循环或淋巴系统，迁移到继发部位的毛细血管床，穿出血管进入继发组织，并增殖生长形成转移病灶5。小鼠模型的使用对于深入理解介导转移定植和生长的分子机制至关重要6,7。本文重点讨论乳腺癌转移，针对这一领域，常采用基因修饰小鼠模型以及移植方法，每种方法各有其优势与局限性。
基因工程小鼠乳腺肿瘤模型利用乳腺组织特异性启动子，如MMTV-LTR（小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列）&#160;和WAP（乳清酸性蛋白），在乳腺上皮中驱动外源基因的表达8。已通过此类方式表达的癌基因包括多瘤病毒中T抗原（PyMT）、ErbB2/Neu、c-Myc、Wnt-1以及猴病毒40（SV40）9,10,11,12,13。尽管这些遗传学模型在研究原发性肿瘤的发生与进展方面具有重要价值，但其自发转移至远端器官的能力较弱。此外，相较于自发性或实验性转移模型，这些转基因小鼠模型通常耗时更长、成本更高。鉴于大多数基因工程乳腺肿瘤模型在研究转移过程中的局限性，移植技术已成为研究这一复杂过程的有力手段&#160;，包括将合适的细胞系进行原位移植、尾静脉注射、心内注射以及颅内注射&#160;。
尽管多种乳腺癌细胞系在原位注射到乳腺脂肪垫后易于发生转移14,15，但转移性肿瘤负荷的一致性和可重复性可能存在挑战，且此类研究的持续时间通常可达数月。在评估肺转移时，尾静脉内注射通常是更可重复且更省时的方法，转移扩散通常在几周内即可发生。然而，由于静脉注射模型&#160;绕过了转移级联反应的初始步骤，在解释这些研究结果时必须谨慎。在本演示中，我们展示了乳腺肿瘤细胞的尾静脉注射，以及一种准确且全面的分析方法。
尽管科研界在理解乳腺癌转移这一复杂过程方面已取得显著进展，但据估计，目前仍有超过15万名女性患有转移性乳腺癌16。在Ⅳ期乳腺癌患者中，&#62;36%的患者存在肺转移17；然而，转移灶的部位分布和发生率可能因分子亚型的不同而有所差异18,19,20,21。伴有肺转移的乳腺癌患者中位生存期仅为21个月，凸显了寻找有效治疗方法和新型生物标志物的迫切需求17。实验性转移模型（包括肿瘤细胞静脉注射）的应用将继续推动我们对这一重要临床挑战的认识。当尾静脉注射与数字成像病理学以及本方案中所述的肺转移肿瘤负荷分析方法相结合时，将成为乳腺癌转移研究中的有力工具。

<table><tbody><tr><td>酒精消毒片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>&lt;强&gt;注射前清洁尾部&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>解剖剪</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>&lt;强&gt;用于小鼠解剖和肺组织灌注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺、4.5 g/L葡萄糖和丙酮酸钠的DMEM培养基</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>MDA-MB-231 和 MVT1 细胞系培养基基础</td></tr><tr><td>杜尔贝科磷酸盐缓冲液 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td><td>用于重悬肿瘤细胞以进行注射</td></tr><tr><td>乙醇（70% 溶液）</td><td>OSU</td><td></td><td>用于解剖过程中减少小鼠毛发；注意——易燃</td></tr><tr><td>伊文思蓝染料</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>在无菌 PBS 中按 1% 浓度使用，用于尾静脉注射技术的练习；注意——该试剂具有危险性</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>默克生命科学</td><td>F4135</td><td>细胞培养基添加剂；在DMEM中使用浓度为10%</td></tr><tr><td>镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>用于解剖和肺组织灌注</td></tr><tr><td>FVB/NJ小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>001800</td><td>MVT1细胞的同系小鼠品系</td></tr><tr><td>血细胞计数板（Bright-Line）</td><td>默克生命科学</td><td>Z359629</td><td>用于细胞培养以获得细胞计数</td></tr><tr><td>胰岛素注射器（28 G）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>用于尾静脉注射（BD 329424）</td></tr><tr><td>MDA-MB-231细胞</td><td>ATCC</td><td></td><td>人乳腺癌细胞系</td></tr><tr><td>MVT1 细胞</td><td></td><td></td><td>小鼠乳腺肿瘤细胞</td></tr><tr><td>针头（26 G）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td><td>用于膨胀小鼠的肺部</td></tr><tr><td>中性缓冲甲醛（10%）</td><td>Fisher Scientific</td><td>245685</td><td>用作组织固定剂及肺组织膨胀剂；慎用——危险试剂</td></tr><tr><td>NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>005557</td><td>由俄亥俄州立大学综合癌症中心（OSUCCC）靶点验证共享资源平台维护</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素 100倍浓缩液</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td><td>细胞培养基添加剂</td></tr><tr><td>无菌纱布</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9379092</td><td>用于在小鼠尾部出血时施加压力</td></tr><tr><td>注射器（5 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>用于膨胀小鼠肺组织</td></tr><tr><td>尾静脉固定器</td><td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td><td>用于固定小鼠以进行尾静脉注射</td></tr><tr><td>台盼蓝（0.4 %）</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>用于细胞培养中评估细胞活力</td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200-114</td><td>用于细胞培养中使肿瘤细胞从培养板上脱落</td></tr></tbody></table>

肿瘤细胞侧尾静脉注射后肺转移的病理学分析

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

转移是大多数癌症患者发病和死亡的主要原因，在小鼠中进行临床前建模具有挑战性。目前可用的自发转移模型较少，因此通过尾静脉注射合适细胞系的实验性转移模型已成为转移研究的主要方法。当癌细胞被注射至侧尾静脉后，肺是其定植的首选部位。该技术的一个潜在局限在于对肺转移瘤负荷进行准确定量。尽管一些研究者会统计预定大小的大转移灶数量，和/或在组织切片后计入微转移灶，另一些研究者则通过计算转移病灶面积占正常组织面积的比例来评估。当转移负荷较高时，这两种定量方法都可能变得极为困难。本文中，我们展示了一种肺转移的静脉注射模型，并结合使用图像分析软件对转移瘤负荷进行高级定量分析的方法。该方法可检测多个终点参数，包括转移灶的平均大小、转移灶总数以及转移灶总面积，从而实现全面分析。此外，该方法已由美国兽医病理学家学院（SEK）认证的兽医病理学家进行评审，以确保其准确性。

如果使用未标记的细胞进行尾静脉注射，可能难以确认肺部定植情况，除非（1）在解剖时观察到大转移灶，或（2）通过组织学分析发现微转移灶。当肺部转移性肿瘤负荷严重时，小鼠会出现呼吸困难。与任何肿瘤研究一样，应在整个实验期间密切监测小鼠状态。使用标记细胞是确认尾静脉注射是否成功的简便方法，因此本实验演示中采用了荧光素酶标记的 MDA-MB-231 细胞。然而，体内成像并非在所有实验设计或其他因素下都可行或必要。图1A 显示了尾静脉注射荧光素酶标记的 MDA-MB-231 细胞后不到2小时胸腔内的生物发光信号，以确认注射准确。在本实验中，胸腔区域的光子计数随时间增加，注射后第24天可观察到强烈的生物发光信号（图1B 和 C；注意比例尺的变化）。在解剖时，这些小鼠肺部可见多个肉眼可见的病灶（图1D）。
经过适当的组织处理和染色后，可对苏木精-伊红（H&amp;E）染色的肺组织切片进行...

静脉注射癌细胞常用于转移性研究，但转移性肿瘤负荷的分析往往较为困难。本文中，我们展示了一种通过尾静脉注射建立转移模型的方法，并介绍了一种分析由此产生的肺转移性肿瘤负荷的新方法。

转移是大多数癌症患者发病和死亡的主要原因，在小鼠中进行临床前建模具有挑战性。极少的自发性……

目前尚无分析尾静脉注射诱导的转移性肺肿瘤负荷的金标准。我们采用数字图像分析方法，以高效、准确且可重复的方式定量肺转移灶。该方法具有节省时间和成本的优势。并且，结合数字图像分析，可对肺转移性肿瘤负荷进行高度准确和全面的分析。在准备用于注射的人乳腺癌细胞时，首先根据所需使用的小鼠数量和细胞浓度，将适量的细胞接种于合适的细胞培养基中。当细胞融合度达到80%至90%时，用PBS洗涤培养板，并按照标准操作规程用最小体积的胰蛋白酶消化细胞使其脱离。当细胞脱落后，将细胞重悬于新鲜培养基中进行计数，并通过离心收集细胞。随后，将细胞重悬于每只小鼠100微升的磷酸盐缓冲液（PBS）中，置于冰上，调整至适当浓度。注射前，需在冰上充分重悬细胞以避免细胞聚集，并将100微升细胞悬液加入一支28号胰岛素注射器中。保持注射器垂直，轻敲针筒同时缓慢调节推杆以排除任何气泡。若允许，小心地将针头套回针帽，并将针尖弯曲成20至30度角。将一只超过六周龄的雌性小鼠置于塑料小鼠固定器中进行固定，并将其侧卧放置，以便于观察其尾侧静脉。在生殖器平面对应位置找到腹侧动脉、背侧静脉以及两条侧尾静脉，使用无菌擦拭物清洁尾部表面。用非惯用手的拇指和食指夹住尾部，施加轻微张力，从尾部远端开始，将针头斜面朝上，平行于静脉刺入。缓慢将全部细胞悬液注入静脉中。注射后可能会有少量血液溢出。用无菌纱布轻轻按压注射部位。然后将注射器丢弃至合适的锐器容器中，并将小鼠放入清洁、通风良好的笼子中进行监测。在尾静脉注射后不超过一小时内，进行活体动物体内成像，以确认细胞注射成功，并获取时间零点的数据。为保持肺组织病理学的结构形态，将小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇润湿毛发。沿中线切开胸腔，将切口向上（头侧）和向下（尾侧）穿过腹膜延伸，抓住剑突以利于去除膈肌。使用另一把剪刀，沿胸骨两侧剪断肋骨，小心移除肋骨笼，为肺部扩张留出空间。为分离气管，需去除下颌下唾液腺和舌骨下肌群，并在气管两侧放置固定针，以防止针头插入过程中发生不必要的移动。取一支3 mL注射器，安装26号针头，吸取2–3 mL 10%中性缓冲福尔马林溶液，将针头插入气管中。缓慢注入福尔马林，同时观察肺部是否逐渐扩张。当福尔马林开始从肺部渗出时，用镊子夹闭气管并拔出针头。随后取下整个呼吸系统，将器官直接放入盛有新鲜福尔马林的容器中。为分析转移性肺肿瘤负荷，使用高分辨率切片扫描仪以40倍放大倍数扫描苏木精-伊红（H&E）染色的肺组织切片，并将图像导入合适的图像分析软件程序。调整定义形状和稀疏度的参数，使其最适于图像。为显示肿瘤转移灶和正常肺组织的分割区域，使用不同颜色的标签标记每种组织类型，打开决策森林（Decision Forest）程序，并根据提示的一系列是非问题，对每类图像进行适当训练。为了调整每个类别的特征，可应用滤镜进行锐化、模糊或按形状排序，以提高算法的准确性。在此分析中，肿瘤转移灶呈蓝色，正常组织为绿色，细支气管上皮为黄色。红细胞呈现红色，而气腔则呈现粉红色。当所有参数设置完毕后，保存修改后的设置，并将该算法应用于整套或系列H&E染色组织。然后导出所有输出变量，以便量化每种组织类型的微米平方面积，并计算其占样本总净组织面积的百分比。在将表达荧光素酶的人源上皮性乳腺癌细胞经尾静脉注射后不到两小时内，若在胸腔区域检测到生物发光信号，可视为注射准确的证据。本实验中，小鼠胸腔区域的光子计数随时间逐渐增加，注射后第24天仍可观察到强烈的生物发光信号。在解剖时，这些小鼠肺部可见多处肉眼可见的病灶。通过使用图像分析软件和自定义算法（如本视频所示），可根据不同的组织特征对整个肺组织进行分割。以这种方式对肺组织进行分割后，软件可量化多种参数。此处显示的是对经人上皮性乳腺癌细胞注射并随后接受旨在阻断转移性定植药物治疗的小鼠肺组织进行分析所获得的原始数据。如这些图像所示，如果不进行深入分析，很容易忽略不同治疗组之间转移性肿瘤负荷的差异，因为肺部结节数量的总数并无差别。然而，对所有参数的综合分析表明，肺转移净面积百分比存在显著差异，这凸显了对转移性肺肿瘤负荷进行系统分析的必要性。细胞重悬液必须充分混匀且不含气泡，这对于防止肺栓塞至关重要；成功的肺组织膨胀有助于维持组织结构的完整性，从而实现准确的图像分析。可对肺组织进行免疫染色，以检测肺部病灶或肺微环境中是否存在特定细胞或目标蛋白。

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Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析

本文描述了一种用于测定人癌细胞系转移潜能的实验性转移检测方法的操作步骤。...

实验性转移检测

本视频介绍了一种通过尾静脉注射将标记的癌细胞注入小鼠模型的技术。我们进一步利用实时成像监测乳腺癌转移灶的形成与生长过程 体内...

尾静脉注射：小鼠模型中用于转移性研究的癌细胞接种方法

在本视频中，通过尾静脉将黑色素瘤细胞静脉注射到小鼠模型体内。这些黑色素瘤细胞随后经循环系统迁移，适应远端微环境，并在肺等器官中引发转移。...

实验性黑色素瘤转移小鼠模型：研究黑色素瘤细胞肺转移潜能的平台

本论文描述了一种在肿瘤转移动物模型中定量肺部肿瘤细胞聚集的方法。...

肺肿瘤细胞募集实验

转移在癌症的致病性中起着至关重要的作用，据估计导致约90%的癌症死亡。我们报道了一种用于小鼠的转移性黑色素瘤模型方案，该模型可用于评估治疗药物针对这一临床现象的有效性。...

注射同源小鼠黑色素瘤细胞以评估其在肺部的转移潜能

通过门静脉注射将乳腺肿瘤细胞递送至小鼠肝脏的手术方法已建立。该模型可在完全免疫功能正常的宿主体内研究肝转移的晚期阶段，包括肿瘤细胞的外渗、定植、存活以及在肝脏内的转移性增殖。...

一种用于研究乳腺癌肝转移的门静脉注射模型

本文旨在详细描述肺转移检测（PuMA）实验方案。该模型允许研究人员利用宽场荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜，在肺组织中研究转移性骨肉瘤（OS）细胞的生长情况。...

研究骨肉瘤肺转移定植的实用考量：基于肺转移检测实验

需要一种动物模型来解析循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中促进肺部定植的作用。在此，我们建立并成功实施了一种体内检测方法，专门用于验证CTC表面聚合纤连蛋白（polyFN）组装对肺部定植的必要性。...

肺组织中循环肿瘤细胞可视化肺定植检测方法的建立

所述方法结合了实验性尾静脉转移模型与活体动物实时成像技术，可实现对乳腺癌转移灶形成和生长的实时监测，同时还能对肺部转移灶的数量和大小进行定量分析。...

联合使用尾静脉转移实验与活体实时成像技术定量分析乳腺癌肺部转移定植及负荷

我们描述了一种通过尾静脉注射内源性HER2扩增的炎性乳腺癌细胞系建立的乳腺癌脑转移异种移植小鼠模型。...

通过尾静脉注射炎症性乳腺癌细胞建立脑转移模型

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

学习利用尾静脉注射模型研究小鼠肺转移瘤负荷，结合数字图像分析技术实现精准定量。该方法高效、经济且可重复，为癌症转移研究提供可靠的实验方案。

肿瘤细胞侧尾静脉注射后肺转移的病理学分析

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