肿瘤细胞外侧尾静脉注射后肺转移的病理分析
2020年5月20日
静脉注射癌细胞常用于转移研究，但转移性肿瘤负担可能难以分析。在本文中，我们展示了转移的尾静脉注射模型，并包括一种分析所得转移性肺肿瘤负担的新方法。
目前没有分析尾静脉注射诱导的转移性肺肿瘤负荷的金标准。我们利用数字图像分析以高效的方式准确且可重复地量化肺转移。这种方法既省时又省钱。
而且，当与数字图像分析相结合时，可以对产生的肺转移性肿瘤负荷进行高度准确和全面的分析。为了制备用于注射的人乳腺癌细胞，首先，根据要使用的小鼠数量和细胞浓度，将适当数量的细胞置于合适的细胞培养基中。当细胞达到 80% 至 90% 汇合时，用 PBS 洗涤板，并根据标准方案在最小体积的胰蛋白酶中分离细胞。
当细胞分离后，将细胞重悬于新鲜培养基中进行计数，并通过离心收集细胞。然后，将细胞以适当浓度重悬于每只小鼠 100 微升 PBS 中，置于冰上。在注射前，将细胞彻底重悬在冰上以避免结块，并将 100 微升细胞装入 28 号胰岛素注射器中。
保持注射器垂直，敲击轴，同时缓慢调整柱塞以去除任何气泡。如果允许，请小心地重新盖上针头并将针尖弯曲成 20 到 30 度角。将一只超过 6 周龄的雌性老鼠束缚在塑料老鼠束缚器中，并将老鼠侧放，以便于观察其侧尾静脉。
找到与生殖器对齐的腹动脉、背静脉和两条外侧尾静脉，并使用无菌湿巾清洁尾部表面。用非惯用手的食指和拇指抓住尾巴，施加轻微的张力，然后从尾巴的远端开始，插入针头，斜面朝上，平行于静脉。缓慢地将整个体积的细胞输送到静脉中。
注射后可能会有少量血液移位。用无菌纱布轻轻按压注射部位。然后将注射器丢弃在适当的锐器容器中，并将鼠标放在干净、通风且有监测的笼子中。
在尾静脉注射后不超过一小时内，进行活体动物体内成像以确认细胞注射成功，并获得时间零数据。为了保持肺的结构形式以进行组织病理学，请将鼠标固定在解剖板上，并用 70% 乙醇润湿皮毛。用中线切口打开胸部，将切口向颅侧和尾部延伸至腹膜，并抓住剑突以去除隔膜。
使用第二把剪刀，剪断胸骨两侧的肋骨，小心地去除胸腔，为肺部扩张留出空间。为了隔离气管，请去除下颌下唾液腺和舌骨下肌肉组织，并在气管的两侧放置针，以防止在进针过程中发生不必要的移动。装入一个 3 毫升注射器，配备一个 26 号针头，加入 2 到 3 毫升 10% 中性缓冲福尔马林，然后将针头插入气管。
慢慢注射福尔麦林，同时观察肺部扩张。一旦福尔梅林开始从肺部泄漏，用镊子捏住气管并取出针头。然后分离整个呼吸器官，将器官直接放入新鲜福尔麦林的容器中。
为了分析转移性肺肿瘤负荷，在高分辨率载玻片扫描仪上以 40 倍放大倍率扫描 H&E 染色的肺组织切片，并将图像导入适当的图像分析软件程序。调整定义形状和稀疏度的参数，以最好地拟合图像。要显示肿瘤转移和正常肺组织的分割区域，为每种组织类型使用不同的颜色标签，请打开 Decision Forest 程序，然后按照提示的一系列是或否问题对每个类别进行适当的图像训练。
要调整每个类的特征，请应用滤镜来锐化、模糊或按形状排序，以提高算法的准确性。在此分析中，肿瘤转移显示为蓝色。正常组织为绿色，细支气管上皮为黄色。
红细胞以红色显示，空气空间显示为粉红色。设置完所有特征后，保存修改后的设置并将算法应用于整组或一系列 H&E 染色组织。然后导出所有输出变量，以允许量化每种组织类型的微米平方面积，并允许从样本总净组织面积计算百分比。
在尾静脉注射荧光素酶标记的人上皮乳腺癌细胞后不到两小时，胸腔内存在生物发光信号可以被认为是准确注射的确认。在该实验中，胸部区域的光子计数随着时间的推移而增加，并且在注射后第 24 天仍然存在强烈的生物发光信号。在尸检时，在这些小鼠中观察到许多肉眼可见的肺部病变。
使用图像分析软件和自定义算法，可以按不同的组织特征分割整个肺组织。通过以这种方式分割肺组织，该软件可以量化各种参数。在这里，显示了对注射人上皮乳腺癌细胞的小鼠肺组织进行分析的原始数据，然后用旨在阻断转移定植的药物治疗。
正如这些图像所表明的，这些治疗组之间转移性肿瘤负荷的差异可能很容易被忽视，因为肺结节的总数没有差异。然而，对所有参数的综合分析表明，净肺转移面积百分比存在显着差异，这强调了需要一种彻底的转移性肺肿瘤负荷分析方法。无气泡的适当细胞重悬液对于预防肺栓塞至关重要，成功的肺充气有助于保持组织结构完整性以进行准确的图像分析。可以对肺组织进行免疫染色，以确定肺部病变或肺微环境中是否存在感兴趣的细胞或蛋白质。
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概述
本研究介绍了一种用于分析癌症研究中转移性肺肿瘤负担的尾静脉注射模型。引入了一种新型数字图像分析方法，以有效量化肺转移瘤。
关键研究组成部分
科学领域
- 转移瘤研究
- 癌症生物学
- 图像分析技术
背景
- 静脉注射癌细胞是转移瘤研究中常用的方法。
- 分析转移瘤负担可能具有挑战性。
- 当前的方法缺乏量化肺转移瘤的标准化。
- 数字图像分析为准确测量提供了一个有前景的解决方案。
研究目的
- 开发一个用于研究肺转移瘤的可靠模型。
- 引入一种用于量化转移瘤负担的成本效益高的方法。
- 提高转移瘤分析的可重复性。
使用的方法
- 将人乳腺癌细胞尾静脉注射到小鼠中。
- 用于量化肺转移瘤的数字图像分析。
- 用于准备癌细胞的标准细胞培养协议。
- 时间高效且成本效益高的分析技术。
主要结果
- 成功建立了尾静脉注射模型。
- 使用数字图像分析准确量化肺转移瘤。
- 证明了该方法的可重复性。
- 提供了一种分析转移瘤负担的综合方法。
结论
- 尾静脉注射模型对转移瘤研究有效。
- 数字图像分析显著提高了量化的准确性。
- 这种方法可以促进进一步的癌症转移研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of metastatic tumor burden is critical for evaluating therapeutic efficacy in preclinical oncology. This method addresses a key bottleneck in metastasis research by enabling reproducible, high-throughput analysis of lung colonization using digital image analysis. It supports data-driven go/no-go decisions in lead optimization by providing objective, multi-parametric readouts that reduce biological variability and improve predictive confidence in target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying changes in metastatic burden following genetic or pharmacological perturbation.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible metrics for comparing target engagement across experimental conditions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by distinguishing between effects on tumor cell survival, extravasation, or colonization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative outputs (metastasis number, size, area) suitable for high-content screening campaigns.
- Reproducibility: Uses image analysis algorithms to minimize observer bias and ensure consistent lesion detection across samples.
- Scalability: Compatible with multi-group studies requiring statistical power for dose-response or combination therapy evaluations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models the preferential lung colonization seen in clinical metastasis, enhancing translational validity.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of imaging-derived metrics with molecular or histopathological biomarkers of metastatic progression.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing comprehensive burden analysis beyond simple nodule counting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly when assessing anti-metastatic compounds.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of metastasis suppressor or promoter genes via quantifiable changes in lung tumor burden.
- Screening: Delivers standardized, quantitative metastasis readouts enabling reliable compound screening and SAR development.
- Analytics: Provides multi-parametric data (count, size, area) that allow sophisticated statistical comparison of treatment effects.
- Translational Research: Connects in vivo metastasis models to histopathological validation through image-based tissue segmentation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline applicable across multiple cancer models and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metastasis studies by enabling objective, software-driven quantification of tumor burden.
- Operational Value: Increases throughput and reduces inter-user variability compared to manual counting or planimetry.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by increasing confidence in preclinical data, reducing late-stage failure due to inadequate metastasis modeling.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on robust, quantitative metastasis inhibition profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, tail-vein injection technique, and histology preparation.
- Dependent on access to high-resolution slide scanners and image analysis software capable of multi-class tissue segmentation.
- Necessitates standardization of fixation, staining, and imaging protocols to ensure comparability across experiments.
- Adaptation to other organ sites (e.g., liver, bone) may require adjustments to image analysis parameters and validation by pathologists.
- Practical limitations include the need for terminal endpoints and inability to monitor longitudinal metastasis progression in live animals.
