Name: 通过颅内注射和磁共振成像对大脑转移进行建模 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 了解通过颅内注射和磁共振成像对脑转移进行精确建模的方法。该技术利用立体定位框架实现精准肿瘤注射，并通过MRI实现肿瘤体积的连续监测，为深入研究脑转移机制提供了可靠的实验手段。

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本研究的代表性数据由美国国家癌症研究所资助（项目编号：K22CA218472，授予 G.M.S.）。颅内注射实验在俄亥俄州立大学综合癌症中心的目标验证共享资源平台（负责人：Reena Shakya 博士）进行，磁共振成像（MRI）在俄亥俄州立大学综合癌症中心的小动物影像共享资源平台（负责人：Kimerly Powell 博士）完成。上述两个共享资源平台均由俄亥俄州立大学综合癌症中心（OSUCCC）、美国国家癌症研究所资助的癌症中心支持基金（P30 CA016058）、俄亥俄州立大学各学院与部门的合作项目以及既定的费用分摊体系共同资助。

本文所述所有方法均已获得俄亥俄州立大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（项目负责人：Gina Sizemore；方案编号：2007A0120）。所有啮齿类动物存活手术均遵循IACUC政策，包括使用无菌技术、无菌物品、无菌器械，以及术前脱毛和切口部位的无菌准备。
1. 乳腺癌细胞的颅内注射
注意：本文所述方法使用了源自原发性MMTV-PyMT肿瘤的小鼠乳腺肿瘤细胞系DB723。既往研究已建立DB7细胞的颅内注射模型，该模型的组织病理学特征与人类乳腺癌脑转移（BCBM）相似12。重要的是，该模型采用免疫功能健全的FVB/N小鼠，因为DB7细胞系即来源于该小鼠品系。由于这是乳腺癌模型，实验中使用成年雌性小鼠。
<ol>
	<li>准备细胞。
	<ol>
		<li>在无菌操作台中，使用标准技术吸除细胞培养板中的培养基。</li>
		<li>用1×DPBS洗涤细胞，并按照制造商的方案进行胰蛋白酶消化。</li>
		<li>加入适量含FBS的培养基以终止胰蛋白酶反应，并使用血细胞计数板或首选方法测定细胞浓度。</li>
		<li>在4 °C下以300 × g离心4分钟，使细胞沉淀。</li>
		<li>吸除培养基，用1×DPBS洗涤，再次在4 °C下以300 × g离心4分钟。</li>
		<li>将细胞重悬于1×DPBS中至适当浓度，每2 µL注射体积中约含50,000个细胞。 
		注：细胞数量取决于细胞系的侵袭性，需由研究者自行确定。我们常规使用2 µL，但已有文献报道使用&#60;6 µL的体积15,16,17,18,19。低体积对于维持注射精度至关重要。</li>
		<li>将重悬的细胞置于冰上直至注射，以维持细胞活性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备小鼠进行手术。
	<ol>
		<li>对于有毛发的小鼠：使用脱毛膏/乳液或剃毛方式去除颅骨区域的毛发。该步骤应在手术前24–48小时内完成，若距离手术时间过近，可能影响皮肤质量和缝合强度。 
		注：由于本研究聚焦于转移性乳腺癌（主要影响女性的疾病），因此选用体重约为25 g的雌性FVB/N小鼠。</li>
		<li>根据IACUC及兽医的指导给予镇痛药物：术前至少1小时皮下注射Buprenorphine SR-LAB（剂量0.5–1 mg/kg，Buprenorphine储备液：0.5 mg/mL，对应注射量为0.0025–0.088 mL），可提供长达72小时的镇痛效果，必要时可在首次给药后48–72小时重复给药。同时在术前至少24–48小时开始给予NSAIDs（例如在饮水中添加20%布洛芬，即1 mg/5 mL），并持续至术后2–7天，以确保至少72小时的术后镇痛。 
		注：在俄亥俄州立大学，Buprenorphine SR-LAB由大学实验动物资源部门的兽医人员给药，因其属于管制药品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备立体定位仪用于手术。
	<ol>
		<li>开启所有麻醉机、数字游标尺和数字注射器。 
		注：所有手术器械应在手术前充分清洁并灭菌。</li>
		<li>在生物安全柜中使用带有诱导室附件的麻醉机（图1A）。</li>
		<li>确保麻醉机的所有管道已连接至立体定位框架（图1B，插图1C），且正在使用的各单元管道上的夹子处于打开状态。关闭未用于手术的立体定位框架管道上的夹子。</li>
		<li>根据小鼠体重设置麻醉机至制造商推荐的鼻罩气流速率（例如，25 g小鼠：鼻罩气流速率为34 mL/min）。 
		注：本立体定位装置所配备的头部固定器仅推荐用于成年小鼠。请确保遵循该装置随附的制造商建议。</li>
		<li>确保已将适当麻醉剂（如异氟烷）预装入注射器并连接至麻醉机（图1B）。 
		注：注射器过度预充可能导致术中向小鼠输送过多麻醉剂，从而引起麻醉过量。</li>
		<li>通过旋转支架锁紧装置，将钻头适配器和1 mm钻头插入每个钻机中，并手动拧紧锁紧装置固定钻头。</li>
		<li>将钻机安装到立体定位框架上（图1C）。</li>
		<li>用1×DPBS、70%乙醇交替清洗Hamilton注射器各5次，最后再用1×DPBS清洗一次。清洗后放置一旁，待动物准备就绪后再进行注射。</li>
		<li>设置数字注射器以0.4 μL/min的速度注射，目标体积为2 μL。此速度和体积可缓慢将肿瘤细胞注入脑内，从而减少压力及相关组织损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位框架上。
	<ol>
		<li>使用前述诱导室对小鼠进行麻醉（例如异氟烷）。</li>
		<li>在整个操作过程中维持小鼠处于深度麻醉状态。麻醉机输出的麻醉剂百分比受多种因素影响，包括气流速率、刺激程度和体温。应频繁监测小鼠的麻醉深度，评估指标包括节律性呼吸（无喘息）、无眼睑反射（用棉签轻触眼睑无颤动）以及无足趾夹捏反应（夹捏足趾时不出现肢体回缩）。 
		注：不同品系的小鼠对麻醉的反应可能不同。</li>
		<li>当小鼠达到适当的深度麻醉状态后，将其转移至立体定位仪。在小鼠处于立体定位装置期间使用加热垫以维持体温和适宜的麻醉深度。 
		注：为实现低剖面设计，我们使用置于倒置移液器吸头盒内的空气激活暖手袋（图1D中的小鼠抬高盒）。</li>
		<li>打开小鼠口腔，将牙齿置于立体定位框架鼻部组件上的齿槽内（图2A）。将鼻罩滑过小鼠的鼻部/口部（图2B）。
		<ol>
			<li>使小鼠头部与齿槽保持水平。用棉签钝端轻轻打开口腔并将其滑入到位。确保鼻罩完全覆盖小鼠鼻部，否则麻醉气体无法正常输送。如果牙齿未卡入该凹槽，则鼻罩无法与鼻部正确对接（图2A插图）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用无菌棉签将眼用润滑剂涂抹于每只小鼠的眼睛上。使用眼用润滑剂可防止角膜干燥，降低角膜损伤风险及与角膜创伤相关的术后并发症。</li>
		<li>通过将左侧耳杆压向左耳内眦并利用立体定位框架上的螺丝将其锁紧，以稳定小鼠颅骨。然后将右侧耳杆滑向右耳内眦，并在立体定位框架上拧紧螺丝（图2B）。 
		注：安装耳杆时应确保小鼠头部水平且正直。若头部歪斜或倾斜，注射位置将偏离目标脑区。耳杆仅需拧紧至颅骨在中等手动探查刺激下保持固定即可。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制作颅骨开窗。
	<ol>
		<li>使用碘伏溶液和70%乙醇交替擦拭头皮各3次，进行头皮准备和清洁。由于手术部位靠近眼睛，建议使用碘伏溶液而非外科擦洗剂。</li>
		<li>使用无菌手术刀沿颅骨中线（沿矢状缝）做3 mm长的皮肤切口。切口处出血应极少。如发生出血，应用无菌棉签在出血部位持续施加稳固压力超过&#62;30秒。</li>
		<li>识别并调整钻头方向，使其垂直于前囟（图2C），并确保将数字游标尺归零。</li>
		<li>将钻头移至矢状缝外侧2 mm、冠状缝前方1 mm处（图2C）。为保证可重复性，所有动物的钻孔位置应统一位于矢状缝的左侧或右侧。</li>
		<li>将钻机调至最高速度。确保皮肤远离钻头，避免旋转钻头造成组织损伤，并小心启动钻头在颅骨上钻孔。钻孔深度约为0.5 mm，穿透颅骨形成颅骨开窗。注意不要将钻头下压过深，以免损伤脑组织。在钻孔过程中向钻点滴加无菌生理盐水，可抵消机器运转产生的热量，防止周围组织发生热损伤。</li>
		<li>完成颅骨开窗后，小心抬起并从立体定位框架上取下钻头。</li>
		<li>若需重复使用，用70%乙醇清洗钻头并妥善存放；否则应卸下钻头并浸入70%乙醇中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将癌细胞注射入脑
	<ol>
		<li>将自动注射装置连接至立体定位仪（图1D）。</li>
		<li>在洁净的Hamilton注射器中吸取&#62;2 µL已充分重悬于1×DPBS中的细胞悬液。务必在填充注射器前立即重悬细胞，以减少细胞团块形成，确保细胞悬液均匀。理想情况下应吸取6–8 µL细胞体积，以确保无气泡存在。</li>
		<li>将Hamilton注射器安装至注射装置上，通过向一次性无菌铺巾上排出少量液体来预充针头，以确认注射器正常工作。用蘸有70%乙醇的棉签擦拭注射器（图1D，插图），以去除针筒外壁的肿瘤细胞，降低沿注射路径种植肿瘤细胞的风险。</li>
		<li>将针尖对准颅骨开窗中心，接近暴露的大脑表面。</li>
		<li>将数字游标尺重新归零。</li>
		<li>缓慢将针插入脑组织深部3 mm，并在继续操作前让针在脑内停留至少60秒。这段时间允许脑实质适应针的存在，从而减少回压及肿瘤细胞沿针道反流的风险。</li>
		<li>在注射器屏幕上选择运行以开始向注射部位输送细胞。注射该体积约需5分钟。延长注射时间有助于减少注射力对脑实质造成的继发性损伤。</li>
		<li>注射程序完成后，让针在脑内再停留至少3分钟，使脑实质进一步适应注射过程。</li>
		<li>至少3分钟后，以0.75 mm/min的速度缓慢将针从脑中拔出。此过程必须极其缓慢且保持匀速，以减少回压及肿瘤细胞沿针道上移的风险。</li>
		<li>当针完全退出脑组织后，小心将Hamilton注射器从注射装置上取下，并按步骤1.2.8所述方法进行清洁。</li>
		<li>使用无菌棉签将温热的骨蜡涂抹于颅骨开窗处。骨蜡作为物理屏障，可防止肿瘤逸出颅腔。</li>
		<li>关闭切口（例如使用5-0 PDS可吸收缝线行单纯间断缝合，或使用缝合夹，选择术者最熟练的方式）。</li>
		<li>停止麻醉给药，通过松开并滑出耳杆、将鼻罩从小鼠身上滑下、并将牙齿从&#160;齿槽中脱离的方式将小鼠从装置中取出。</li>
		<li>将小鼠放入置于设定为37 °C加热板上的清洁笼盒中进行恢复。在恢复期间密切监测小鼠，通常在停止麻醉后10–15分钟内苏醒。</li>
		<li>小鼠苏醒后，根据所在机构IACUC规定监测是否达到早期安乐死标准。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 磁共振成像
<ol>
	<li>成像前10-20分钟，通过标准腹腔注射方式给予小鼠钆基对比剂（每20克体重小鼠注射100 µL的0.1 M MultiHance）24。随后使用诱导室吸入麻醉剂（例如异氟烷）与95% O2和5% CO2（即供气为空气混合气体）混合进行麻醉。</li>
	<li>将小鼠置于加热的固定装置上以维持体温，用耳杆和咬合固定器固定头部，并将装置放入配备小鼠脑部表面线圈的9.4 T磁体中。成像期间持续维持麻醉状态，每只小鼠的研究通常约需20分钟。在整个过程中，使用气动垫和小动物监测系统监测呼吸频率和心率（约70次/分钟）。</li>
	<li>获取定位像后，采用T2加权RARE序列（TR = 3500-4228 ms，TE = 12 ms，RARE因子 = 8，FOV = 2.0 × 2.0 cm，矩阵大小 = 256 × 256，层厚1 mm或0.5 mm，NA = 2-4，连续切片15-30层）对小鼠脑部进行成像；随后进行钆基对比剂增强后的T1加权RARE序列成像（TR = 1200 ms，TE = 7.5 ms，RARE因子 = 4，FOV = 2.0 × 2.0 cm，矩阵大小 = 256 × 256，层厚1 mm或0.5 mm，NA = 2-4，连续切片15-30层）。</li>
	<li>成像结束后，将小鼠放置于设定为37 °C的加热垫上的笼子中恢复。</li>
</ol>
3. 肿瘤体积测量
<ol>
	<li>获取总肿瘤体积
	<ol>
		<li>在 ImageJ 中打开 MRI DICOM 数据文件，ImageJ 是美国国立卫生研究院提供的免费图像处理软件（https://imagej.nih.gov/ij/）25。 
		注：ImageJ 可用于查看 DICOM 文件，这是利用嵌入的像素尺寸进行肿瘤体积计算所必需的（参见 图像、属性，其中“长度单位”可根据需要设置（例如，mm））。</li>
		<li>使用 自由选择 工具在肿瘤周围绘制轮廓。建议在暗室中进行这些选择以增强可视性。不要调整亮度/对比度，以保持不同实验会话之间的一致性。</li>
		<li>在 分析 菜单下，选择 测量 以获得所选区域的面积。如果在步骤 3.1.1 中选择了毫米为单位，则面积将以立方毫米表示。如需要，可通过按 ctrl+D 嵌入 自由选择 区域。通过进入 编辑 | 选项 | 颜色 更改输出颜色。在保存为 .tif 文件之前，将图像转换为 RGB 图像（图像 | 类型 | RGB 颜色）。</li>
		<li>继续测量单只小鼠所有包含肿瘤的切片，并将数值复制到适当的数据分析软件中（例如 Microsoft Excel 或 GraphPad Prism）。</li>
		<li>将各切片的面积相加，得到总肿瘤体积。务必根据切片厚度校正面积（面积/厚度）。</li>
		<li>重复执行步骤 3.1.1 至 3.1.5，直至所有小鼠均获得总肿瘤体积。由于肿瘤轮廓勾画具有一定的主观性，理想情况下应多次重复相同方法并取平均值，以减少技术误差。</li>
		<li>为设置比例尺，打开 DICOM 数据文件，进入 分析 | 工具 | 比例尺。由于尺寸信息已嵌入 DICOM 文件中，只需选择所需长度/宽度即可。在保存为 .tif 文件之前，转换为 RGB 图像（图像 | 类型 | RGB 颜色）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Lee, D., Marcinek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+small+animal+MRI+and+MRS%3A+basic+experimental+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo small animal MRI and MRS: basic experimental procedures.</a> Journal of Visualized Experiments. (32), (2009).</li>
<li>Shah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigational+chemotherapy+and+novel+pharmacokinetic+mechanisms+for+the+treatment+of+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">Investigational chemotherapy and novel pharmacokinetic mechanisms for the treatment of breast cancer brain metastases.</a> Pharmacological Research. 132, 47-68 (2018).</li>
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作者没有任何披露信息。

通过颅内注射并结合磁共振成像（MRI）进行连续监测，能够随时间推移以精确的肿瘤体积准确度可视化肿瘤生长过程。数字影像分析技术的应用可对脑部病灶进行解读，评估肿瘤体积、出血、坏死情况以及对治疗的反应。
与任何实验操作一样，成功实施该技术必须遵循若干关键步骤。首先，立体定位装置的精确设置对该技术的成功至关重要。由于小鼠颅骨体积较小，即使存在微小的偏差，也可能导致实验动物中肿瘤生长速度和成瘤率出现显著差异。因此，操作人员必须接受使用这些仪器的正规培训。其次，整个操作过程中应保持热源供应，以确保麻醉深度不会过低。体温过低会因药物代谢减慢而导致麻醉意外过量，增加动物在麻醉状态下突然死亡的风险，或延长苏醒时间。预制的加热垫可能体积较大，在立体定位仪周围操作时不够灵活；而通过商业供应商购买的小型空气激活式暖手袋不仅能够维持稳定的温度，而且体积小巧，可轻松放置于倒置的移液器吸头盒内，该盒子用于将小鼠抬升至立体定位装置所需的合适高度。最后，定量分析本身较为直接，但常常难以区分肿瘤组织与非肿瘤组织。建议研究人员咨询影像学技术人员，以确保评估结果准确可靠。此外，建议多次重复肿瘤体积测量，以减少误差。同时...

脑转移的发生率比成人原发性中枢神经系统肿瘤高出10倍1，几乎在所有实体瘤中均有报道，其中肺癌、乳腺癌和黑色素瘤的发病率最高2。无论原发肿瘤位于何处，脑转移的发展通常预后不良，常伴随认知功能下降、持续性头痛、癫痫发作以及行为和（或）人格改变1,3,4,5。就乳腺癌而言，该疾病的预防与治疗已取得诸多进展。然而，约30%的乳腺癌患者最终会发展为转移性疾病，而在Ⅳ期患者中，约7%（SEER 2010–2013数据）会出现脑转移6,7。目前脑转移的治疗手段包括手术切除、立体定向放射外科和（或）全脑放疗。然而，即使采用这些积极的治疗方案，患者的中位生存期仍仅为8–11个月7,8,9。这些严峻的数据充分说明，迫切需要识别并实施新型且有效的治疗策略。因此，与其他转移至脑部的癌症一样，在实验室中建立准确的乳腺癌相关脑转移（BCBM）模型，对于推动该领域的重大进展至关重要。
迄今为止，研究人员已采用多种方法研究肿瘤向脑部转移的机制，每种方法均有其独特的优势与局限性10,11。实验性转移方法，如尾静脉注射和心内注射，可使肿瘤细胞在体内广泛播散，并可能在其他转移部位形成显著的肿瘤负荷，具体程度取决于所注射的细胞类型。若研究目标为脑转移，则这些结果可能造成干扰。颈内动脉注射法的优势在于可特异性地将肿瘤细胞靶向脑部，但其局限性在于技术操作难度较高。原位原发肿瘤切除模型通常被认为是最具临床相关性的转移模型，因其可重现完整的转移级联过程。然而，该方法需较长的等待时间以等待自发转移的发生，且脑转移的发生率明显低于其他转移部位，如淋巴结、肺和肝脏。通常情况下，动物模型会因其他转移部位的肿瘤负荷过重而在脑转移形成前即被剔除出研究。其他使用嗜脑性细胞系的方法虽能有效实现脑转移，但其局限性在于建系耗时，且细胞在传代过程中常逐渐丧失嗜脑性。鉴于上述局限性，研究人员常规采用颅内注射法建立脑转移癌模型11,12,13,14，并已发展出多种不同技术方案15,16,17,18,19。人们普遍承认，该方法同样存在局限性，最重要的是其无法用于研究转移早期阶段，包括肿瘤细胞从原发灶侵入血管、穿越血脑屏障以及在脑内定植等过程。然而，该方法仍可使研究人员检验以下三个方面：（1）哪些肿瘤来源的因子介导了脑内的肿瘤生长（例如，对肿瘤细胞中致癌因子进行基因操作）；（2）转移微环境的改变如何影响该部位的肿瘤生长（例如，比较不同基质成分发生改变的转基因小鼠）；以及（3）新型治疗策略对已形成病灶生长的抑制效果。
鉴于颅内注射模型具有潜在的应用价值，必须在注射过程中尽量减少技术误差，并精确地长期监测肿瘤生长情况。本文所述方法包括持续给予吸入性气体麻醉剂，以及使用立体定位钻孔仪和注射装置将肿瘤细胞直接植入脑实质中。使用气体麻醉剂可精确调节麻醉的深度和持续时间，并确保动物苏醒迅速且平稳。采用数字化控制的自动化钻孔与注射系统，可提高注射位点的精确度，减少传统手工钻孔和徒手注射方法常出现的技术误差。磁共振成像（MRI）的使用进一步提高了对肿瘤生长、肿瘤体积、组织反应、肿瘤坏死及治疗反应监测的精确性。MRI是软组织成像的首选方法20,21。该成像技术不使用电离辐射，因此相较于计算机断层扫描（CT）更具优势，尤其适用于在研究过程中进行多次成像。MRI在软组织对比度方面的可调范围远大于CT或超声成像（USG），能够更清晰地呈现解剖结构。对于脑组织内部的异常情况，MRI具有更高的敏感性和特异性。MRI可在任意成像平面进行扫描，无需像二维超声或二维光学成像那样移动受试对象。需要特别指出的是，颅骨不会像在其他成像方式中那样衰减MRI信号。因此，MRI能够评估在CT或超声中可能因骨性结构伪影而被遮蔽的组织结构。另一个优势在于，目前已有多种可用于MRI的对比剂，可在相对较低毒性和较少副作用的前提下，显著提高病灶的检出能力。尤为重要的是，MRI可实现对肿瘤的实时动态监测，而尸检时的组织学评估则难以准确判断肿瘤体积。其他成像方法如生物发光成像，虽然在早期肿瘤检测和长期监测方面确实有效，但该方法需要对细胞系进行基因改造（例如荧光素酶/Luciferase或GFP标记），且无法进行体积测量。MRI的另一优势在于其与临床患者监测方式一致，且对MRI图像进行的后续体积分析已被证实与尸检时的组织学肿瘤大小高度相关22。通过MRI进行系列筛查监测，还可加强对可能出现的神经系统功能障碍的临床观察。
总体而言，立体定向颅内肿瘤注射结合连续磁共振成像的实验方法使我们能够获得可靠、可预测且可量化的结果，用于研究癌症中脑转移的机制。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;手术材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>贝塔碘（Betadine）</td><td>Purdue Products</td><td>19-027132</td><td>聚维酮碘，7.5%</td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>Surgical Specialities</td><td>903</td><td>无菌且可塑性蜂蜡与棕榈酸异丙酯</td></tr><tr><td>Buponorphine SR-Lab</td><td>ZooPharm</td><td>N/A</td><td>长效注射用镇痛剂，5 mL（0.5 mg/mL）聚合物制剂</td></tr><tr><td>棉签</td><td>Puritan</td><td>25-806 10WC</td><td>无菌长柄棉签</td></tr><tr><td>眼膏</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>润滑性凡士林和矿物油基眼用软膏</td></tr><tr><td>暖手袋</td><td>Hothands</td><td>HH2</td><td>空气激活发热包</td></tr><tr><td>布洛芬</td><td>Up &amp;amp; Up</td><td>094-01-0245</td><td>液体混悬剂，每5 mL含100 mg</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein INC</td><td>1182097</td><td>用于麻醉蒸发器的液态麻醉剂</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td><td>#10 一次性手术刀片</td></tr><tr><td>皮肤胶</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td>适用于皮肤伤口的安全粘合剂</td></tr><tr><td>无菌敷料</td><td>TIDI Products</td><td>25-517</td><td>独立包装的无菌铺巾</td></tr><tr><td>缝合线</td><td>Covidien</td><td>SP5686G</td><td>45 cm 带针5-0单丝聚丙烯缝合线</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;立体定位仪&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速钻机（Foredom）</td><td>Kopf</td><td>Model 1474</td><td>最高转速38,000 RPM</td></tr><tr><td>小鼠气体麻醉头固定器</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td>带齿孔和鼻罩的口部固定杆</td></tr><tr><td>非穿刺式耳杆</td><td>Kopf</td><td>Model 922</td><td>适用于小鼠的耳杆</td></tr><tr><td>立体定位仪</td><td>Kopf</td><td>Model 940</td><td>带数字显示 monitor 的底板、框架和线性刻度组件</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;注射器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射针头与注射器</td><td>Hamilton</td><td>80366</td><td>26号针头，针长51 mm，10 &amp;mu;L 容量注射器</td></tr><tr><td>Legato 130A 自动注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>P/N: 788130</td><td>带可编程触摸屏的自动注射泵装置</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;麻醉机&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 低流量数字蒸发器</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>数字式麻醉机</td></tr><tr><td>SomnoSuite 小鼠起始套装</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-MSEKIT</td><td>包含诱导室、2支麻醉注射器、18&quot; 管路、塑料鼻罩、2个废气吸收罐</td></tr></tbody></table>

通过颅内注射与磁共振成像建立脑转移模型

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

癌症的转移扩散是疾病进展、侵袭性癌症亚型和/或晚期诊断所带来的不幸后果。脑转移尤其具有破坏性，难以治疗，且预后较差。尽管目前美国脑转移的确切发病率仍难以估计，但随着颅外治疗手段在癌症治疗中效果不断提升，其发生率很可能会持续上升。因此，有必要识别并开发针对该部位转移病灶的新型治疗方法。为此，将癌细胞直接注射入颅内已成为一种成熟的脑转移建模方法。过去，由于无法直接测量肿瘤生长情况，这一模型在技术上受到限制；然而，随着小动物成像技术（如磁共振成像，MRI）的可及性和成像质量不断提高，研究人员现已能够更有效地在实验期间纵向监测肿瘤生长，并推断脑内发生的变化。本文展示了在免疫功能健全的小鼠中通过颅内注射小鼠乳腺肿瘤细胞并随后进行MRI检测的操作流程。该注射方法采用异氟烷麻醉，结合立体定位装置，利用数字控制的自动钻孔设备和针头注射系统，以提高操作精确度并减少技术误差。磁共振成像在俄亥俄州立大学詹姆斯综合癌症中心的小动物成像共享资源平台使用9.4特斯拉仪器进行，随时间序列采集数据。各时间点的肿瘤体积测量通过ImageJ软件实现。总体而言，该颅内注射方法可实现精准注射、逐日监测和准确的肿瘤体积测量，显著提升了该模型系统在探索脑转移驱动机制方面验证新假设的应用价值。

图3展示了单只小鼠在注射鼠源乳腺肿瘤细胞后两个时间点（第7天和第10天）的肿瘤体积定量结果。本实验中注射了50,000个DB7细胞，并通过MRI评估该动物的脑部情况。每次扫描共获取30个切片（厚度为0.5 mm）。对每次扫描的30个切片进行评估后发现，注射后第7天有5个切片显示肿瘤负荷（图3A），而注射后第10天则有9个切片显示肿瘤负荷（图3B）。每个图像的肿瘤区域均按前述方法进行评估，各帧的肿瘤面积如图3C所示。总肿瘤体积根据切片厚度进行计算和校正。图4展示了以发表格式呈现的代表性数据，包括代表性图像（图4A）以及随时间变化的肿瘤体积直方图（图4B）。
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颅内脑转移瘤建模因缺乏精确且及时监测肿瘤大小及治疗反应的方法而变得复杂。本研究所展示的方法将颅内肿瘤注射与磁共振成像分析相结合，从而实现精确且一致的注射操作、增强的动物监测以及准确的肿瘤体积测量。

癌症的转移性扩散是疾病进展、侵袭性癌症亚型和/或晚期诊断的不幸后果。脑转移是……

该颅内注射方案具有重要意义，因为它能够实现精确注射、每日监测以及准确的肿瘤体积测量，从而更有效地研究脑转移的机制。该技术的主要优势在于能够对颅内肿瘤的生长进行连续监测。本实验操作将由来自Sizemore实验室的研究生研究员Jonathan Spehar和来自俄亥俄州立大学小型动物影像共享资源中心的影像研究科学家Anna Bratasz进行示范。开始操作前，旋转钻机上的支架锁，使钻头适配器和无菌的1毫米钻头能够插入钻机中，并手动拧紧钻头锁以固定钻头。将钻机连接到立体定位仪上，并将数字注射泵的输送速率设置为0.4微升/分钟，目标注射量为2微升。确认小鼠对足底反射无反应后，将麻醉后的小鼠放置于定位仪上，使用棉签的钝端将小鼠牙齿调整至口腔固定杆的凹槽内。将左侧耳杆紧贴左耳内眦以固定头骨，并使用立体定位仪上的螺钉将头骨锁定到位。然后以相同方式用右侧耳杆固定头骨的另一侧。制作颅骨窗时，依次使用碘伏溶液和70%乙醇交替擦拭头皮三次进行消毒，随后使用无菌手术刀沿颅骨中线矢状缝位置的皮肤做一3毫米切口。将无菌钻头垂直对准前囟，确保将数字游标卡尺归零，并将钻头向矢状缝外侧移动2毫米，向前囟冠状缝前方移动1毫米。将皮肤推开远离钻头，以最高速度操作，并注意解剖标志，小心钻出一个约0.5毫米深的骨孔，必要时用无菌生理盐水滴注冷却钻孔部位。完成颅骨开窗后，小心抬起钻头，并从立体定位仪上取下钻头。进行癌细胞注射时，将自动注射装置连接到立体定位仪上，并将六到八微升在DPBS中充分重悬的细胞悬液装入无菌的Hamilton注射器中。将注射器安装到注射装置上，挤出少量溶液至一次性无菌铺巾上，以预润注射针头。使用棉签蘸取70%乙醇擦拭注射器，并调整针尖对准颅骨窗口中心，直至接近暴露的大脑表面。将数字游标卡尺归零，缓慢将针头插入脑内深度三毫米处。针头留在脑内至少60秒后，在注射器屏幕上选择“运行”，开始向注射部位输送细胞。当所有细胞输送完毕后，将针头在脑内再停留至少三分钟，使脑实质适应注射，然后以每分钟0.75毫米的速度将针头从脑内撤出。为进行肿瘤负荷的磁共振成像，在适当实验时间点成像前10至20分钟，通过标准腹腔注射方式，按每20克体重100微升的剂量向小鼠注射基于钆的对比剂。注射后将小鼠麻醉，并将其置于加热的固定装置上。将该装置放入配备小鼠脑表面线圈的9.4 T磁体中，并获取定位图像。然后使用T2加权的rapid acquisition with relaxation enhancement（RARE）序列以及基于钆对比剂增强后的T1加权RARE序列对小鼠脑部进行成像。为测量总肿瘤体积，需在ImageJ中打开感兴趣的MRI数据文件，并使用自由手选区工具在肿瘤周围绘制轮廓。随后打开分析选项卡，选择“测量”以获得所选区域的面积。当评估完某只小鼠在特定时间点包含肿瘤的所有切片后，将数值导出至适当的数据分析程序中。此处可观察到在小鼠乳腺肿瘤细胞注射后第7天和第10天，单只小鼠肿瘤体积定量的代表性概览。每次扫描评估30个切片的结果显示，在注射后第7天，有5个切片显示出肿瘤负荷。在第10天时，九个切片显示出肿瘤负荷。随后按照所示方法测量每张图像中的肿瘤面积，从而能够追踪肿瘤体积随时间的变化。每种细胞系及每种受体小鼠模型均具有独特性，因此需要优化注射的细胞数量和MRI扫描时间表，以确保成像的准确性。按照此操作步骤，可获取脑组织用于几乎所有后续检测，包括单细胞分离或组织病理学分析。

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科研

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Cancer Research

癌症研究

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