应用三维单轴机械刺激生物反应器系统诱导肌腱来源干细胞的肌腱向分化

不同的力学加载参数可诱导肌腱来源的干细胞分化为不同类型的细胞。本文介绍了应用三维单轴力学刺激生物反应系统诱导肌腱来源干细胞向肌腱细胞分化的详细过程。肌腱病是骨科常见的运动损伤之一。

跟腱病在中长跑运动员中的发生率最高，可达29%；而髌腱病在排球、篮球、田径、手球和足球运动员中也十分常见。然而，由于肌腱自我修复能力有限，且缺乏有效的治疗方法，肌腱病仍对患者的生活质量产生显著的负面影响。肌腱来源的干细胞（TDSCs）作为肌腱细胞的重要前体细胞，在肌腱病的发生发展以及肌腱病后功能与结构的修复过程中发挥着重要作用。

然而，与机械加载参数不同，如加载应力、加载频率、加载类型和加载周期等，可诱导肌腱来源干细胞（TDSCs）分化为不同的细胞类型。因此，一种有效且可靠的机械加载方案对于肌腱发生具有重要意义。本实验方案包含七个阶段：小鼠TDSCs的分离、小鼠TDSCs的培养与扩增、用于细胞片形成的刺激培养基的制备、在刺激培养基中培养形成细胞片、三维肌腱STEM细胞构建体的制备、单轴细胞拉伸机械刺激复合装置的组装，以及对体外机械刺激下类肌腱组织的评估。

小鼠TDSCs的分离。采用颈椎脱位法处死6至8周龄的小鼠，取髌腱和跟腱进行分离。

用6毫升I型胶原酶消化肌腱3小时。收集细胞，并在含10%胎牛血清和1%链霉素-青霉素混合液的完全α-MEM培养基中培养7天。通过流式细胞术结合荧光激活细胞分选鉴定肌腱来源干细胞（TDSCs），检测细胞表面标志物CD44、CD90和Sca-1的表达。

缺乏CD34和CD45的表达。传代并冻存细胞。传代后的细胞将用于后续步骤。

小鼠TDSCs的培养与扩增。取出预热的小鼠肌腱干细胞，缓慢加入四到五毫升完全α-MEM培养基。

用移液器将混合物转移至15毫升离心管中。用移液器加入培养基，定容至总体积8毫升。将离心管放入离心机中，确保平衡良好。

在 347 g 条件下离心细胞 5 分钟。从离心机中取出一支试管。检查底部的沉淀物。

弃去上清液。用一到两毫升完全培养基轻轻重悬细胞，避免产生过多气泡。

用移液器将重悬的细胞转移至T75培养瓶中。使用移液器向培养瓶中加入完全α-MEM培养基，使总体积达到10毫升，细胞终浓度为每平方厘米13,000个细胞。将培养瓶放入培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下进行培养。

每三天更换一次培养基。在更换培养基时于显微镜下观察并监测细胞，直至细胞培养至100%汇合度。制备用于细胞片形成的刺激性培养基。

将15毫升完全α-MEM培养基加入一个15毫升无菌离心管中。向15毫升培养基中加入6微升抗坏血酸，使其终浓度为4.4微克/毫升。轻轻颠倒混匀。

通过在刺激培养基中培养形成细胞片。小心弃去非正常的完全α-MEM培养基，避免触碰贴附在培养瓶底部的细胞。

缓慢加入10毫升刺激培养基，避免对完全融合的细胞造成扰动。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下，用刺激培养基培养细胞9天，每3天更换一次培养基，以充分生成细胞片层。

制备三维肌腱干细胞构建物。将培养瓶从培养箱中取出。完全弃去诱导培养基。

用 PBS 轻轻旋转冲洗单层细胞片。彻底弃去 PBS。用移液器向瓶角加入一毫升 0.25% 胰蛋白酶。

轻敲培养瓶的角落，使单层细胞片脱落，直至细胞片边缘从培养瓶底部脱离。立即加入9毫升完全α-MEM培养基，以终止胰蛋白酶消化反应。继续轻轻旋转培养瓶，使单层细胞片完全脱落。

将全部细胞片转移到含有培养基的培养皿中。用无菌镊子夹起细胞片的一角，顺时针旋转15次。再夹起细胞片的另一端，逆时针旋转10次，以形成类似肌腱的体外构建物。

在独特设计的生物反应器中组装单轴拉伸力学刺激系统。通过连接器将挂钩连接，然后调节两个挂钩之间的距离至两厘米。将3D TDSCs构建物在每个挂钩上轻轻缠绕于演示挂钩上，各绕三圈。

通过拧紧两端的螺丝，将带有细胞构建物的钩子固定在生物反应器的腔室内。用完全α-MEM培养基填满腔室。通过电缆将加速器连接到培养腔室。

使用无菌镊子剪断钩状连接器。打开电源和通道控制器以开始机械刺激。盖上腔室盖，观察指示灯，确保生物反应器能够正常工作。

将生物反应器放入培养箱中，对三维细胞构建物施加机械拉伸。加载方案为6%应变、0.25赫兹频率，持续8小时后休息16小时，共进行六天。评估机械刺激下体外生成的类肌腱组织。

使用螺丝刀松开螺丝，并小心取下组件。将类肌腱组织放入4%PFA中固定15分钟，然后将固定的类肌腱组织连同宠物的活检样本一起放入活检盒中。进行样品脱水处理。

最后，通过 HD 组织学分级进行评估。重复整个实验流程，并从类肌腱组织中提取 RNA，通过 qPCR 评估腱系标志物的表达。在进行机械刺激之前，TDSCs 将在完全培养基中生长至 100% 汇合，并呈现无序的 outward 结构形态。

六天后，可观察到细胞伸展、机械负荷、细胞外基质以及细胞排列均呈现出良好的取向性。经过机械负荷后，细胞在细胞外基质中分布密集且包裹良好。与未进行拉伸的样本相比，细胞形态更接近正常的肌腱细胞。

施加载荷的细胞构建物中的细胞密度高于未施加载荷的构建物。qPCR结果表明，与采用所述培养方法处理的对照组相比，本研究中的处理方式提高了腱系标志物的表达水平，包括Scleraxis、Mohawk、Tenomodulin和I型胶原。在机械刺激生物反应器系统方面，本研究方案采用了带有直线电机的分离腔室。

由于三维细胞构建体能够提供精确的力学加载，且与传统的二维细胞片和双轴拉伸方法相比，具有便携性和易于调节的优点，因此其形态更接近于肌腱的真实结构。而单轴拉伸则更符合肌腱细胞的受力特性。这为利用三维单轴拉伸系统刺激肌腱源性干细胞（TDSCs）分化提供了理论依据。

因此，在本实验方案中，二维细胞片最终被构建成三维细胞结构，并接受了单轴向力学加载。根据我们的生物反应器系统，加载方案为6%应变、0.25赫兹频率，每天加载8小时，随后休息16小时，持续6天。最后，通过形态学观察及肌腱相关标志物的表达水平，验证了该方案的有效性。

整个操作过程简单，但操作者需始终注意保持TDSC环境的无菌状态。本方案具有多种应用。通过刺激TDSCs模拟体内分化的过程，有助于研究肌腱病的病理过程。

此外，本方案提供了一种可重复的定向诱导TDSCs分化为类肌腱组织的方法，因此可简单有效地用于潜在的组织工程肌腱培养。总之，应用三维单轴机械刺激生物反应器系统是一种简单、经济、可重复且有效的诱导TDSCs向肌腱细胞分化的手段。

我们的方案详细提供了整个过程。