简化的大洋广布性尾海鞘动物双生住囊虫 Oikopleura dioica 的采样与培养

本方案直观展示了如何建立一种长期、可靠的海洋浮游被囊动物双生住囊虫（Oikopleura dioica）培养体系。双生住囊虫培养系统为研究生态学、发育生物学、基因组学和进化等广泛的生物学领域提供了基础资源。该物种生命周期短、繁殖力高，且可从近岸环境中轻松采集，是一种理想的模式生物。

尽管本方案已针对住囊虫（Oikopleura dioica）进行了优化，但我们希望其也可应用于其他浮游生物。首先，需启动藻类饵料以维持住囊虫的培养，起始步骤为对过滤海水进行高压灭菌。为建立钙质针杆藻（Chaetoceros calcitrans）的原种培养，向60 mL高压灭菌海水内添加以下成分：30 µL维生素溶液、30 µL溶液A、15 µL硅酸钠和60 µL链霉素。

最后，加入30 µL前期培养的C.calcitrans作为接种物。有关其他藻类物种和培养类型的添加物及接种体积，请参见论文中的表二。接种后，将原代培养物和传代培养物置于17 °C的培养箱中，在持续光照条件下进行维持培养。

大约10天后，通过观察锥形瓶变色可确认藻类生长。一旦出现变色，将储备培养物转移至4°C条件下长期保存，可保存长达一个月，同时在同一培养箱中继续维持继代培养。为制备工作培养物，向400 mL经高压灭菌的海水中加入所需的补充物，并接种100 mL上一代的继代培养物。

用橡胶塞密封烧瓶，插入一支一次性的一毫升移液器，然后将其转移至藻类培养站，在室温条件下维持8小时光照周期，并持续通气。每天手动摇晃藻液培养物两次，以防止藻细胞在烧瓶底部聚集。待藻类培养物稳定生长后，于当地采样点采集野外样本。

投放浮游生物网，使网底端沉入水面以下一至两米处。以每秒约5到1米的速度拖网。持续往返拖网两到五分钟。

拖网时间应根据现场浮游生物的丰度进行调整。拖网结束后，小心地将网具提出水面，并缓慢地将网底收集物转移至一个500毫升的玻璃瓶中。加液至瓶口，避免产生气泡，以防运输过程中气泡对生物造成应激。

在此阶段，可通过将样品瓶置于深色背景前观察来确认住囊虫的存在。然而，物种级别的鉴定需要进行显微观察。重复此过程，直至收集到三个500毫升的样品瓶。

采集表层海水，使用CTD剖面仪记录盐度、温度和叶绿素浓度。此外，现场采集10至15升海水，以帮助动物适应实验室环境。为使动物适应，需将采样点的表层海水与实验室中保存的过滤海水按1:1比例混合配制。

最终体积应根据浮游生物样品的浓度调整至五到十升之间。将500毫升样品小心加入已准备好的烧杯中。使用连接在以15 RPM转速旋转的同步电机上的桨叶，将浮游生物保持悬浮状态过夜。

次日早晨，用肉眼检查是否存在住囊虫。将动物转移至培养皿中，在暗视野显微镜下以20至40倍的放大倍数进行观察，以进行阳性鉴定。住囊虫的特征是呈蝌蚪状，其尾部在半透明的囊室内呈波浪状摆动。

为确认 O. dioica，应寻找具有黄色性腺的完全成熟雄性个体，或带有卵子的雌性个体。若动物尚未成熟，则观察尾部远端一半区域是否存在两个脊索下细胞。这些细胞在成熟与未成熟个体中均存在。

确认物种后，将其转移至新的培养皿中。重复此过程，直至有10到20个个体在物种水平上得到确认。若未发现O.dioica，可继续搅拌烧杯额外一至两天。

最初不易观察到的小型 O.dioica 会继续生长并逐渐变得容易观察。如果一周后仍未发现任何个体，应丢弃该样品并重新采样。为了建立单培养体系，需从野外样品中分离出 120 只 O.dioica，并置于五升过滤海水内。

次日早晨，寻找性腺呈黄色的完全成熟雄性个体，以及卵子呈闪亮金黄色球状的雌性个体。使用5毫升钝头移液管，将15只雄性和30只雌性轻轻转移至含有2.5升过滤海水的产卵烧杯中，以制备产卵用烧杯。为尽量减少手动转移过程中的物理应激，请缓慢地将动物释放到新海水的液面以下。

让分离的成体自然产卵。产卵后，可通过从产卵烧杯底部吸取5到10微升海水，并在显微镜下观察是否存在卵裂的卵，以确认受精是否成功。产卵后的第一个早晨（即第一天），烧杯中应出现带有膨胀住囊的新一代幼体动物。

使用一个500毫升的手持烧杯，将动物轻柔地转移到含有7.5升新鲜过滤海水的新烧杯中。倾倒时应缓慢将液体沿液面倒出，以尽量减少湍流和剪切力。在产卵后的第二个早晨（即第二天），人工将150只动物转移到含有5升新鲜过滤海水的新烧杯中。

在产卵后的第三个早晨，即第三天，将120只动物手动转移至装有五升新鲜过滤海水的新烧杯中。到第四天时，应出现性成熟成体动物。选取15只雄性与30只雌性，放入含2.5升过滤海水的新产卵烧杯中，以启动下一代的繁殖。

该过程需重复并持续进行，直至培养物生命周期结束。为了维持 O. dioica 的单一种群培养，需每天从工作培养物中制备藻类食物，并每日投喂三次。

使用分光光度计在660纳米波长下测定工作培养液的吸光度，以配制每日食物。将吸光度值、目标O.dioica培养体积及动物成熟度输入预先准备好的电子表格中，依据先前确定的藻类生长曲线，计算出当日投喂所需的藻类精确体积。用移液器将计算出的藻液体积转移至50毫升离心管中，在室温下以5,000g离心5分钟。

缓慢倒出上清液，小心地用移液器上下吹打以重悬沉淀的藻类。用新鲜的过滤海水将离心管补至原始体积。根据电子表格中的每日藻类投喂量图表，在上午9点向每个烧杯中加入指定量的藻液。

中午12点和下午5点。可设置自动给药泵在下午5点为动物喂食。

在周末无培养人员在场的情况下。每次喂食后，将制备好的藻类食物保存在4°C，直至下次喂食时使用。可通过拖曳装有100微米网孔和非过滤性网底的改良浮游生物网，在港口轻柔拖网收集O. dioica。

2015年至2019年间的采样显示，冲绳港湾水域中O.dioica的出现存在季节性变化。表层海水温度似乎影响着该动物的出现。当表层海水温度达到28摄氏度或更高时，O.dioica占据优势。

O.dioica 在 24 至 27 摄氏度的温度范围内与 Oikopleura longicauda 共存。然而，在低于 23 摄氏度的温度下，O.longicauda 占据主导地位。盐度的变化与 O.dioica 的丰度无相关性。

建立稳定的小型尾索动物（O.dioica）培养体系的三个最重要因素是：采用多级过滤系统维持高水质，确定最佳喂养方案（建议通过建立藻类标准曲线来实现），以及准备含有足够数量雄性和雌性个体的产卵烧杯。按照所提供的实验方案，O.dioica 在 23 °C 条件下的生活周期为四天。我们已成功稳定建立了六个独立的 O.dioica 种群，每个种群均持续繁衍超过 20 代。

总之，建立稳定培养的 O.dioica 可以快速且低成本地完成。通过适当的设置，可在一周内建立稳定的培养体系。结合其较小的基因组和较短的生活周期，这使得 O.dioica 成为一种强大的脊索动物模型物种。

可以使用人工海水和天然海水培养O.dioica。利用固体培养和冷冻保存方法可实现藻类食物的长期储存。此外，O.dioica的精子也可冷冻保存，并保持超过一年的活力。

O. dioica 继续为各个生物学领域提供重要的研究见解。了解当地的季节性变化、建立精细的培养体系，以及少数专注研究人员的投入，即可相对轻松地实现高效的培养。