2D-HELS MS Seq：一种基于液相色谱-质谱的通用方法，用于直接从头测序含不同核苷酸修饰的RNA混合物
2020年7月10日
本文介绍了一种基于液相色谱-质谱（LC-MS）的测序方法的详细实验方案，该方法可作为直接测序短链RNA（<35 nt每轮）的手段，无需经过cDNA中间步骤；同时，也可作为在单个研究中以单碱基精度对多种核苷酸修饰进行测序的通用方法。
本方案涵盖了使用新开发的直接测序RNA方法时所需的所有关键步骤，无论RNA样本是单链、混合的还是经过修饰的。该方法不受酶促错误或碱基互补性的影响，提供了一种直接的工作流程和通用解决方案，使得能够同时测序多种RNA修饰，而非一次仅检测一种特定修饰。
该技术可开发为一种诊断工具，用于确定与人类疾病相关的特征性RNA片段，同时可作为研究表观转录组水平RNA修饰的精确工具。该方法不依赖于任何先前的测序技术，而是一种全新的方法，我们的目标是使其成为测序任何修饰RNA的首选方法。
本实验方案的某些部分包含一些关键步骤，通过视觉演示可以更准确地传达，例如对RNA进行3'端标记、LC-MS数据采集以及使用MassHunter软件进行数据分析。我将演示该操作流程，并设置LC-MS仪器以检测我们的RNA样品。进行一步法标记反应时，将2微升150微摩尔的AppCp-生物素、3微升10倍浓度的连接酶反应缓冲液、1.5微升100微摩尔的RNA样品、3微升无水DMSO、10单位T4 RNA连接酶以及19.5微升DEPC处理水混合，总体积为30微升。
将反应物在16摄氏度下孵育过夜，然后根据手稿说明进行柱纯化。将RNA分为三等份，加入等体积甲酸后，在40摄氏度下孵育反应体系。每个反应完成后，立即用干冰冷冻样品，以终止酸降解反应。
使用离心真空浓缩仪将样品干燥约30分钟。用20 µL经DEPC处理的水重悬干燥后的样品，并将其混合。在LC-MS检测前，将样品储存在20 °C条件下。
在配制好流动相后，将RNA样品转移至LC-MS进样小瓶中。每次进样应包含100至400皮摩尔的RNA，体积为20微升。数据采集完成后，使用分子特征提取工作流程提取化合物信息，包括质荷比、保留时间、峰面积和质量评分。
在小分子设置中使用质心数据格式。将峰高设置为至少100，但小于1,000，质量评分设置为至少50。最后，将数据导出为Excel文件。
在此处的二维质谱保留时间图上展示了3'梯形条带与5'梯形条带及其他非目标片段的分离情况。还可以对包含两条不同长度RNA链的混合样品进行测序，每条RNA均带有5'生物素标记。为了区分尿苷与假尿苷，对RNA进行了CMC处理，该处理可将假尿苷转化为CMC-假尿苷加合物。
该加合物在尿苷中具有不同的质量，可在二维-HELS MS测序中加以区分。通过分析假尿苷转化为其CMC加合物反应的粗产物的HPLC谱图，计算出转化率为42%。采用带有3'端标记的二维-HELS MS测序法对五种不同RNA链的混合物进行测序，并进行了归一化处理，以便更清晰地显示多种RNA序列。若不进行归一化处理，这五种RNA序列的字母编码将会过于密集而难以分辨。
进行该实验操作时，应仔细设置标记反应，以获得高产量的标记RNA样本。同时，需精确控制降解时间，以生成可靠的分子量梯度条带，并用20微升水收集最大量的干燥样本。完成本实验方案后，可提出的一个问题是：如何提高测序方法的长度分辨率和通量？
更优的算法以及分辨率和灵敏度更高的先进仪器可提供帮助。该实验方案开发完成后，即可直接测序更广泛的RNA样本，包括含有标准核苷酸和修饰核苷酸的样本，且不会产生与基于CDA的RNA测序相关的任何错误。
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概述
本文介绍了一种基于液相色谱-质谱（LC-MS）的短链RNA测序新方法，该方法无需依赖cDNA中间体。该实验方案可实现多种RNA修饰的同步测序，并达到单碱基精度。
关键研究组成部分
科学领域
- RNA测序
- 表观转录组学
- 生物技术
背景
- 目前的RNA测序方法通常依赖于cDNA中间体。
- 酶促错误可能影响测序的准确性。
- 同时测序RNA修饰具有挑战性。
- 理解RNA修饰对于研究人类疾病至关重要。
研究目的
- 介绍一种用于RNA的直接测序方法。
- 实现在一次分析中研究多种RNA修饰。
- 为表观转录组学研究提供一种可靠的工具。
使用的方法
- 基于液相色谱-质谱联用的测序技术。
- 直接对单链、混合或修饰的RNA进行测序。
- 无需cDNA合成步骤。
- 专为高精度和高准确性设计的工作流程。
主要结果
- 该方法无需cDNA即可成功测序短RNA（<35 nt）。
- 实现了多种RNA修饰的同步检测。
- 该技术表现出对酶促错误的强抗性。
- 已识别出其在人类疾病诊断中的潜在应用。
结论
- 这种新的测序方法可能成为修饰RNA分析的标准方法。
- 它为研究RNA修饰提供了一种全面的方法。
- 该实验方案对未来的RNA生物学研究具有重要意义。
常见问题
行业应用价值
这种基于液相色谱-质谱（LC-MS）的RNA测序方法能够直接对修饰RNA混合物进行从头测序，无需合成cDNA，从而解决了表观转录组学靶点验证中的一个关键瓶颈。该方法可提供定量的、分辨修饰位点的测序数据，有助于RNA生物标志物的早期发现，并降低治疗性寡核苷酸的机制风险。通过生成序列确认的、特异性针对修饰的输出结果，该方法可直接应用于筛选和检测开发流程，从而提高先导分子鉴定的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过在天然环境中直接测序假尿苷和5-甲基胞嘧啶等RNA修饰，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：提供一种通用方案，可同时检测经典核苷酸与修饰核苷酸，减少对连续进行的修饰特异性检测实验的需求。
- 预测价值：通过修饰碱基的直接质谱保留时间相关性支持靶点置信度，有助于准确进行位点特异性的修饰定位。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：生成定量的质量和保留时间数据，能够可靠地区分包含多达12种不同寡核苷酸的混合物中的RNA序列。
- 操作价值：提供可重复、可直接用于归一化处理的数据，兼容标准的高分辨率液相色谱-质谱（LC-MS）系统，支持短链RNA检测面板的检测标准化。
- 可扩展性：通过生成序列经验证且具有明确修饰模式的RNA标准品，有助于构建经验证的生物系统，用于下游筛选。
转化与临床前研究
- 转化连续性：支持对经修饰的治疗性RNA寡核苷酸进行序列验证，将发现阶段的修饰与临床前候选分子的评估相衔接。
- 机制性风险降低：能够检测由修饰引起的质荷变化（例如CMC-假尿苷加合物），从而在复杂样本中区分真实信号与降解产物的干扰。
- 基于风险评估的推进：提供无酶学偏倚的序列确认，减少修饰筛选中的假阴性结果，提高“推进/终止”决策的可靠性。
流程与工作流整合
该方法可整合到早期发现工作流程中，作为假设驱动型RNA分析的前端测序工具，在功能筛选前通过确认合成或内源性RNA靶标的序列及修饰状态，进而推动先导分子的鉴定。
- 发现生物学：通过提供天然或合成混合物中RNA序列与修饰共存的直接证据，支持假设验证和通路解析。
- 筛选：通过生成质荷比-保留时间梯度图谱，作为化合物诱导的RNA修饰或降解谱分析的定量参考，实现检测就绪。
- 分析：生成基于质心的分子特征数据（质量、保留时间、峰面积、质量评分），可导出至Excel，支持跨条件比较及对修饰稳定性的统计评估。
- 转化研究：通过提供经序列验证的修饰RNA标准品，适用于与疾病相关体系中的生物标志物比对和功能验证，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：作为基于液相色谱-质谱（LC-MS）的可复用技术，能够快速测序短RNA变体（<35 nt），减少对外包测序的依赖，并加快内部修饰筛选周期。
运营与企业影响
- 科学价值：通过消除cDNA介导的错误并实现对修饰特异性质谱信号的直接观察，为目标验证提供可预测的置信度。
- 操作价值：通过标准化标记、酸淬灭和归一化步骤，确保在复杂RNA混合物中最小化不同运行间的变异性，从而保证实验可重复性。
- 战略价值：通过支持在内部完成修饰RNA测序，减少对外部供应商的依赖，加快先导化合物优化中的迭代周期，提高资本使用效率。
- 项目组合影响：提供明确的序列和修饰信息，支持基于风险调整的优先级排序，降低因未检测到的RNA异质性或错误注释导致的后期候选分子淘汰率。
实施注意事项
- 准确解读数据需要具备RNA操作、液相色谱-质谱（LC-MS）仪器操作以及基于MassHunter的分子特征提取方面的专业知识。
- 依赖于可获取高分辨率LC-MS系统，该系统需具备中心化数据采集能力，并满足特定的峰高（100–1000）和质量评分（≥50）阈值要求。
- 为确保不同用户和平台间质量阶梯图谱的一致性，需在团队间对标记效率、降解时间及归一化流程进行标准化。
- 当研究范围扩展至短RNA（<35 nt）以外或复杂生物样本时，需考虑方法适应性问题，有待未来算法和仪器的进一步优化。
- 存在若干实际限制，包括当前通量有限，以及依赖于对标记反应（如AppCp-生物素、T4连接酶、DMSO）的手动优化，以最大化产率和阶梯图谱分辨率。
