Name: 2D-HELS MS Seq:一种基于 LC-MS 的通用方法，用于对具有不同核苷酸修饰的 RNA 混合物进行直接和从头测序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 了解基于LC-MS的2D-HELS MS Seq方法，用于直接测序含多种核苷酸修饰的RNA混合物。该技术无需cDNA中间体，可同时检测多种修饰，为表观转录组学研究提供可靠工具。

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作者感谢美国国立卫生研究院提供的R21资助项目&#160;(1R21HG009576) 项目资助了 S. Z. 和 W. L.，以及纽约理工学院（NYIT）的研究与创造性活动机构资助项目对 S. Z. 的支持，为本工作提供了资助。作者谨此感谢哥伦比亚大学博士生 Xuanting Wang 在制图方面的协助，并感谢纽约理工学院 Michael Hadjiargyrou 教授、哥伦比亚大学 Jingyue Ju 教授、James Russo 博士、Shiv Kumar 博士、Li Xiaoxu 博士、Steffen Jockusch 博士及 Ju 实验室（哥伦比亚大学）其他成员、Cerno Bioscience 的 Yongdong Wang 博士、NYIT 的 Meina Aziz 和 Wenhao Ni 在本手稿撰写过程中提供的有益讨论和建议。

1. 设计RNA寡核苷酸
<ol>
	<li>设计不同长度（19 nt、20 nt 和 21 nt）的合成 RNA 寡核苷酸，其中一条（RNA #6）包含标准核苷酸和修饰核苷酸。ψ 作为不改变质量的修饰模型，因其与 U 质量相同，对质谱测序具有挑战性。m5C 作为改变质量的修饰模型，用于验证该方法的稳健性。 
	 
	RNA #1: 5´-HO-CGCAUCUGACUGACCAAAA-OH-3´ 
	RNA #2: 5´-HO-AUAGCCCAGUCAGUCUACGC-OH-3´ 
	RNA #3: 5´-HO-AAACCGUUACCAUUACUGAG-OH-3´ 
	RNA #4: 5´-HO-GCGUACAUCUUCCCCUUUAU-OH-3´ 
	RNA #5: 5´-HO-GCGGAUUUAGCUCAGUUGGGA-OH-3´ 
	RNA #6: 5´-HO-AAACCGUψACCAUUAm5CUGAG-OH-3´ 
	&#160;</li>
	<li>将每种合成 RNA 溶解于无核酸酶的焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水中（除非另有说明，下文简称为 DEPC 处理 H2O），配制成 100 mM 的 RNA 储存液。储存液长期保存于 -20 °C。</li>
	<li>为避免 RNA 样品可能降解，使用无 RNase 的实验耗材，包括 DEPC 处理水、微量离心管和移液器吸头。频繁使用&#160;RNase 去除湿巾擦拭实验设备表面。</li>
</ol>
2. 用生物素标记RNA的3´端
<ol>
	<li>两步反应流程（腺苷酰化和连接）
	<ol>
		<li>在无RNase的薄壁0.2 mL PCR管中加入1 µL 10x腺苷酰化反应缓冲液（含50 mM醋酸钠，pH 6.0，10 mM MgCl2，5 mM二氯二苯基三氯乙烷（DTT），0.1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）），1 µL 1 mM ATP，1 µL 100 µM生物素化胞苷二磷酸（pCp-生物素），1 µL 50 µM Mth RNA连接酶，以及6 µL经DEPC处理的H2O（总体积为10 µL）。 
		注意：在进行两步反应前，将试剂储存于-20 °C。使用前在室温下解冻，并通过涡旋振荡和离心充分混匀后再加入反应体系。</li>
		<li>将反应体系置于PCR仪中，在65 °C孵育1小时，随后在85 °C灭活5分钟。</li>
		<li>在无RNase的薄壁0.2 mL PCR管中进行连接步骤，向上述步骤所得10 µL反应液中加入3 µL 10x T4 RNA连接酶反应缓冲液（含50 mM三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）-HCl，pH 7.8，10 mM MgCl2，1 mM DTT），1.5 µL待测序RNA的100 mM样品储备液，3 µL无水二甲基亚砜（DMSO）以达到10%（v/v），1 µL T4 RNA连接酶（10单位/µL），以及11.5 µL经DEPC处理的H2O（总体积为30 µL）。将反应体系置于PCR仪中，在16 °C过夜孵育。 
		注意：由于DMSO的凝固点较高（18.45 °C），所有反应组分应在室温下混合。</li>
		<li>将反应体系在16 °C过夜孵育。</li>
		<li>通过柱纯化法淬灭并纯化反应产物，以去除酶和游离的pCp-生物素，使用Oligo Clean &amp;#38; Concentrator试剂盒（Zymo Research，Irvine，CA，美国）。该试剂盒提供寡核苷酸结合缓冲液、DNA洗涤缓冲液、离心柱和收集管。在加入结合缓冲液前，向反应液中加入20 µL经DEPC处理的H2O，使样品体积达到50 µL。</li>
		<li>向每份反应液中加入100 µL结合缓冲液。加入400 µL乙醇，用移液器吹打混匀，然后将混合物转移至离心柱中。在10,000 x g条件下离心30秒，弃去穿流液。</li>
		<li>向离心柱中加入750 µL DNA洗涤缓冲液。分别在10,000 x g和最大转速下离心30秒和1分钟。</li>
		<li>将离心柱转移至1.5 mL微量离心管中。向柱中加入15 µL经DEPC处理的H2O，于10,000 x g离心30秒，以洗脱RNA产物。 
		注意：此阶段样品可在-20 °C保存，直至进行下一步操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>一步反应流程
	<ol>
		<li>在1.5 mL无RNase的微量离心管中进行一步标记反应，加入2 µL 150 μM腺苷-5´-5´-二磷酸-{5´-(胞苷-2´-O-甲基-3´-磷酸-TEG}C-生物素（AppCp-生物素），3 µL 10x连接酶反应缓冲液，1.5 µL待测序RNA的100 mM样品储备液，3 µL无水DMSO以达到10%（v/v），1 µL T4 RNA连接酶（10单位/µL），以及19.5 µL经DEPC处理的H2O（总体积为30 µL）。</li>
		<li>将反应体系置于PCR仪中，在16 °C过夜孵育。</li>
		<li>按照上述步骤2.1.5–2.1.8所述进行柱纯化。 
		注意：每个RNA样品（150 pmol规模）应使用独立专用的反应管。可能需要使用磺化花青素3（Cy3）或Cy3对RNA的5´-端进行标记（例如，用于双向测序验证）。该方法不同于3´-生物素标记，已在先前发表的研究中描述9。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 在链霉亲和素磁珠上捕获生物素标记的 RNA 样本
<ol>
	<li>在1.5 mL无RNase的微量离心管中，加入200 µL 1× B&amp;#38;W缓冲液（5 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.5 mM EDTA，1 M NaCl），以活化200 µL链霉亲和素C1磁珠。涡旋混匀该溶液，并将其置于磁力架上静置2分钟，随后小心吸取并弃去上清液。</li>
	<li>用200 µL溶液A（DEPC处理的0.1 M NaOH和DEPC处理的0.05 M NaCl）洗涤磁珠两次，再用200 µL溶液B（DEPC处理的0.1 M NaCl）洗涤一次。每次洗涤时，均需涡旋混匀溶液，置于磁力架上静置2分钟，然后弃去上清液。最后加入100 µL 2× B&amp;#38;W缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）。</li>
	<li>向生物素标记的RNA样品中加入1× B&amp;#38;W缓冲液，使总体积达到100 µL。将此溶液加入盛有100 µL 2× B&amp;#38;W缓冲液的已洗涤磁珠中，在室温下于摇床（100 rpm）中孵育30分钟。将离心管置于磁力架上静置2分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1× B&amp;#38;W缓冲液洗涤包被磁珠3次，每次洗涤后使用Nanodrop测定上清液的最终浓度，用于回收率分析，以确认目标RNA分子仍保留在磁珠上。</li>
	<li>将磁珠置于PCR仪中，在65 °C条件下用含95%甲酰胺的10 mM EDTA（pH 8.2）溶液孵育5分钟。将离心管置于磁力架上静置2分钟，用移液器收集上清液（其中含有从链霉亲和素磁珠上释放的生物素化RNA）。 
	注意：此步骤为酸降解前的物理分离步骤，仅用于图1c中RNA#1的测序，在2D-HELS MS测序中并非必需，因为疏水性生物素标签会导致3´端标记的梯形片段在LC-MS检测中保留时间（tR）显著延迟，从而可在二维质荷比-保留时间（mass-tR）图谱中清晰区分标记的3´端梯形片段与未标记的5´端梯形片段。</li>
</ol>
4. RNA 的酸水解以生成用于测序的质谱阶梯
<ol>
	<li>将每个RNA样品均分为三份等量的等分试样。例如，将体积为15 µL的RNA样品分为三份，每份5 µL。</li>
	<li>加入等体积的甲酸，使反应混合物中甲酸的终浓度为50%（v/v）8,9。</li>
	<li>在PCR仪中于40 °C孵育反应体系，分别进行2 min、5 min和15 min的反应。</li>
	<li>每次反应结束后，立即将样品置于干冰上冷冻，以终止酸降解反应。</li>
	<li>使用离心真空浓缩仪干燥样品。样品通常在30 min内完全干燥，甲酸在干燥过程中随H2O一同被去除，因为甲酸的沸点（100.8 °C）与H2O（100 °C）相近。</li>
	<li>将总共三个干燥样品重悬并合并于20 µL的DEPC处理过的H2O中，用于LC-MS检测。 
	注意：此阶段样品可在-20 °C保存，等待LC-MS检测。</li>
</ol>
5. 将 ψ 转化为 CMC-ψ 加合物
<ol>
	<li>在含有 0.0141 g N-环己基-Nʹ-(2-吗啉乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐（CMC）和 0.07 g 尿素的 1.5 mL 无 RNase 微量离心管中加入 80 µL 经 DEPC 处理的 H2O。加入 10 µL 浓度为 100 µM 的待测序 RNA 样品储备液、8 µL 1 M bicine 缓冲液（pH 8.3）和 1.28 µL 0.5 M EDTA。再加入经 DEPC 处理的 H2O，使总体积达到 160 µL。最终反应体系中各组分浓度为：0.17 M CMC、7 M 尿素、4 mM EDTA，溶于 50 mM bicine 缓冲液（pH 8.3）11。 
	注意：本方案适用于单一合成 RNA 序列或 RNA 混合物。</li>
	<li>将 160 µL 反应溶液均分为四份，分别加入四个无 RNase 的薄壁 0.2 mL PCR 管中，并在 PCR 仪中于 37 °C 孵育 20 分钟。 
	注意：每个 PCR 管中最大反应体积为 50 µL。</li>
	<li>每管反应液中加入 10 µL 1.5 M 醋酸钠和 0.5 mM EDTA（pH 5.6），以终止反应。</li>
	<li>使用四个并行的离心柱进行柱纯化，以去除过量反应物，操作步骤参照 2.1.5–2.1.8。将纯化后的产物分别溶解于 15 µL 经 DEPC 处理的 H2O 中，置于 1.5 mL 无 RNase 微量离心管中。</li>
	<li>将纯化产物转移至四个无 RNase 的薄壁 0.2 mL PCR 管中。向每份 15 µL 纯化产物中加入 20 µL 0.1 M Na2CO3&#160;缓冲液（pH 10.4），并加入经 DEPC 处理的 H2O 至每管总体积为 40 µL（共四管）。将反应液置于 PCR 仪中，在 37 °C 孵育 2 小时。</li>
	<li>按照步骤 2.1.5 所述方法，使用四个并行的离心柱对反应产物进行淬灭和纯化。将 CMC-ψ 转化产物分别用 15 µL 经 DEPC 处理的 H2O 洗脱至 1.5 mL 无 RNase 微量离心管中。</li>
	<li>将来自四个收集管的纯化 CMC-ψ 转化样品合并至同一管中。按照步骤 4.1–4.6 所述方法进行 50%（v/v）甲酸降解，以生成用于测序的质谱梯度片段。</li>
</ol>
6. 液相色谱-质谱检测
<ol>
	<li>为LC-MS检测配制流动相。流动相A为含25 mM六氟异丙醇和10 mM二异丙基胺的LC-MS级水溶液；流动相B为甲醇。</li>
	<li>将样品转移至液相色谱-质谱（LC-MS）样品瓶中用于分析。每次进样体积为 20 µL，包含 100–400 pmol 的 RNA。</li>
	<li>使用以下液相色谱条件：柱温 35 °C，流速 0.3 mL/min；流动相 B 从 2% 线性梯度升至 20% 持续 15 分钟，随后用 90% 流动相 B 洗脱 2 分钟。 
	注意：对于第2节中提到的疏水性更强的末端标记物（如Cy3和sulfo-Cy3），样品洗脱可能需要更高比例的有机溶剂即，可使用类似的梯度，但增加流动相B的百分比范围。例如，在30分钟内流动相B从2%升至38%，随后用90%流动相B冲洗2分钟。</li>
	<li>使用配备自动进样器和液相色谱-高相液相色谱（MS HPLC）系统的Agilent Q-TOF（四极杆飞行时间）质谱仪分离并分析样品。液相色谱柱为C18柱，规格50 mm × 2.1 mm，粒径1.7 μm。质谱参数设置如下：负离子模式；扫描范围350 m/z至3200 m/z；扫描速率2张谱图/秒；干燥气流速17 L/min；干燥气温度250 °C；雾化器压力30 psig；毛细管电压3500 V；碎裂电压365 V。请注意，这些参数针对所使用的质谱仪型号或类型而设定。</li>
	<li>使用安捷伦 MassHunter 采集软件获取数据。采用安捷伦分子特征提取（MFE）工作流程提取化合物信息，包括质荷比、保留时间、丰度（相应离子种类的 MFE 丰度值）、质量评分等. 使用以下MFE设置：“centroid数据格式，小分子（色谱法），峰高≥100，最多保留1000个峰，质量评分≥50”。 
	注意：优化MFE设置以尽可能提取更多潜在化合物，最多可提取1000种，且质量评分需≥50。</li>
</ol>
7. 通过计算算法自动产生RNA序列
注意：此操作步骤仅针对 图1c 中的 RNA #1 进行展示。
<ol>
	<li>按体积（峰强度）从大到小的顺序对MFE提取的化合物进行排序，并R. 执行数据预筛选 通过 1）设置 tR 4到10分钟，以选择生物素标记的RNA片段，因为tR生物素标记的质量阶梯组分的条带在此处发生偏移R 窗口（4 分钟至 10 分钟），以及 2）在算法计算中使用比梯形片段数量高一个数量级的输入化合物数量，以基于体积减少数据量。例如，对于一条 20 nt 的 RNA，20 个标记的质量-R 测序20 nt RNA需要使用ladder组分，因此将根据体积从MFE数据文件中选择200种化合物。请注意，tR 当使用不同类型或型号的质谱仪时，窗口可能会有所不同。</li>
	<li>使用已发表算法的修订版本对RNA #1进行数据处理和序列生成8. 修订后算法的源代码此前已有描述（https://academic.oup.com/nar/article/47/20/e125/5558343#supplementary-data)9.</li>
	<li>除了使用算法自动生序列外，还可通过手动计算测序梯度中相邻组分之间的质量差来进行碱基判读。RNA中的所有碱基均可手动判读，并与RNA核苷酸及修饰数据库中的理论值进行比对。8；因此，RNA链的完整序列可以被手动准确读取，用于验证算法报告的序列读段的准确性。更多RNA修饰的结构信息可参见RNA修饰数据库12，其相应的理论质量由 ChemBioDraw 获得。在表 S1–S2 中，列出了特定 ladder 组分的实测质量与其理论质量之间的 ppm（百万分之一）质量差异，每条碱基判读的差异值若小于 10 ppm，则视为良好匹配。</li>
</ol>
8. 测序RNA混合物
<ol>
	<li>使用2.2步骤中所述的一步法，将五种RNA链（RNA #1至#5）的混合物在其3´端标记A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin。在总体积为150 µL的反应体系中，加入15 µL 10x T4 RNA连接酶反应缓冲液、每种RNA链各1.5 µL（RNA #1至#5分别为100 µM储备液，共7.5 µL）、10 µL 150 µM A(5´)pp(5´)Cp-TEG-biotin、15 µL无水DMSO、5 µL T4 RNA连接酶（10单位/µL）以及97.5 µL DEPC处理的H₂O。2O. 将反应溶液均分为五份，每份加入一个无RN酶的微量离心管中，每管含有30 µL反应溶液。</li>
	<li>在PCR仪中于16 °C过夜孵育反应。</li>
	<li>按照步骤 2.1.5-2.1.8 中所述的程序进行柱纯化&#160;使用五个平行的自旋柱。将3´-生物素标记的5种RNA链混合样品（RNA #1至#5的混合物）分别用15 µL DEPC处理的H₂O洗脱至各1.5 mL无RNase的微量离心管中2O.</li>
	<li>将五个收集管中的纯化混合样品合并至一个试管中。按照第4节所述步骤进行甲酸降解。</li>
	<li>按照第6节所述方法通过液相色谱-质谱法（LC-MS）测定样品，并使用数据分析软件结合优化的MFE参数设置对数据进行分析，以提取包含质荷比、保留时间R，以及步骤6.5中所述的体积。由于混合物导致数据复杂性显著增加，因此不采用常规的信号处理与碱基识别算法。混合样本RNA中的所有碱基均参照第7.3节所述方法进行人工判读，并与RNA核苷酸及修饰数据库中的理论序列高度匹配。8因此，混合样品中所有五条RNA链的完整序列被准确读取。在 表 S7–S11，列出所有信息，包括观测质量、tR体积、质量评分和 ppm 质量差异。</li>
</ol>

<ol><li>Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+ribonuclease+activity+of+cusativin+from+Cucumis+sativus+for+mapping+nucleoside+modifications+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).</li>
<li>Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+confirmation+of+chemically+modified+RNAs+using+exonuclease+digestion+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).</li>
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<li>Bjorkbom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+direct+sequencing+of+noncanonical+RNA+by+two-dimensional+analysis+of+mass+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+LC-MS-based+RNA+sequencing+method+for+direct+analysis+of+multiple-base+modifications+in+RNA+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures.</a> Nucleic Acids Research. 47 (20), 125(2019).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+tRNA+by+2D-HELS-AA+MS+Seq+reveals+its+different+isoforms+and+dynamic+base+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications.</a> ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).</li>
<li>Bakin, A., Ofengand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+newly+located+pseudouridylate+residues+in+Escherichia+coli+23S+ribosomal+RNA+are+all+at+the+peptidyltransferase+center%3A+analysis+by+the+application+of+a+new+sequencing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique.</a> Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Modification+Database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).</li>
</ol>

作者已就本论文中讨论的技术提交了临时专利申请。

与基于串联的质谱碎裂方法不同，2D-HELS MS Seq 方法在对RNA进行质谱分析之前，采用高度可控的酸性水解对RNA进行片段化。9,10因此，每个酸降解片段均可被仪器检测，形成相当于测序梯的图谱。在最佳条件下，该方法可从RNA产生一条“理想”的序列梯。 通过平均而言，每个分子在磷酸二酯键处发生一次位点特异性的RNA切割8,9,10每次降解片段在单次运行中被质谱仪测量后，两个相邻阶梯片段之间的质量差对应于该位置RNA核苷酸或修饰的确切质量。每种RNA修饰要么具有可帮助在RNA中识别和定位它的固有独特质量，要么可以转化为具有独特质量的形式。因此，理论上，该方法可报告标准核苷酸和修饰核苷酸的身份与位置 从头合成 以及对任何RNA进行直接测序。然而，不同的序列梯度可能相互重叠，使质谱数据分析复杂化，从而...

基于质谱（MS）的测序方法，包括自上而下质谱法和串联质谱法1,2,3,4，已开发用于RNA的直接测序。然而 原位 目前尚无法将用于在质谱仪中高效生成高质量RNA梯度的碎裂技术应用于 从头合成 测序5,6此外，分析传统的二维（1D）质谱数据也并非易事 从头合成 即使是单一纯化RNA序列的测序也具有挑战性，而对于混合RNA样品的质谱测序则更加困难7,8因此，已开发出一种基于二维（2D）液相色谱-质谱（LC-MS）的RNA测序方法，该方法结合了二维质谱保留时间（tR）梯子以替代一维质量梯子，从而更易于识别所需梯子组分 从头合成 RNA测序8然而，基于二维液相色谱-质谱的RNA测序方法主要局限于纯化的合成短链RNA，因其无法仅依靠单一的片段梯阵读取完整序列，而必须依赖两个共存且相邻的梯阵（5´-和3´-梯阵）8更具体而言，该方法需要双向末端配对读长，以读取低分子量区域的末端核碱基8配对末端测序的额外复杂性导致该方法不适用于RNA混合物的测序，因为在未知样品中难以确定哪个梯形条带属于哪个梯形。&#160;
为克服上述基于质谱的RNA测序方法中的障碍，并拓展其在直接RNA测序中的应用，必须解决两个问题：1）如何生成高质量的质谱阶梯图谱，以用于读取RNA链中从第一个核苷酸到最后一个核苷酸的完整序列&#160;以及2）如何在复杂的质谱数据集中有效识别每一条RNA/质量梯度。结合严格控制的酸降解，我们通过将疏水性末端标记策略（HELS）引入基于质谱的测序技术，开发出一种新的测序方法，并通过在待测序RNA的5´端和/或3´端添加疏水性标签，成功解决了上述两个问题9该方法可从RNA生成一条“理想”的序列梯形图谱——每条梯形片段均来源于RNA在各个磷酸二酯键位点特异性切割，且相邻两个梯形片段之间的质量差 precisely 等于该位置核苷酸或核苷酸修饰的确切质量。 8,9,10这成为可能的原因是，我们在将RNA注入仪器之前，加入了一个高度可控的酸性水解步骤，该步骤可使每个RNA分子平均断裂一次，从而实现片段化。因此，每个降解产生的片段产物均可在质谱仪上被检测到，所有这些片段共同构成一个测序梯形图谱8,9,10该新策略能够对一条RNA链的单个梯状图谱进行完整测序，无需通过RNA另一条梯状图谱的配对端读取，同时还可实现对包含组合性核苷酸修饰的多种不同RNA链混合物进行质谱测序。9通过在RNA的5´端和/或3´端添加标签，标记的梯形片段表现出明显的迁移延迟R，这有助于区分两个质量梯度彼此之间以及与噪声较大的低质量区域。质量-tR 由添加疏水标签引起的偏移有助于质量阶梯的识别，并简化了序列生成的数据分析。此外，添加疏水标签可通过防止对应阶梯片段落入噪声较高的低质荷比区域，从而帮助识别链末端的碱基。R 由于标签导致的质量和疏水性增加，该区域得以被识别，从而能够从单个片段梯中确定RNA的完整序列，无需使用双端测序读段。因此，我们此前已成功实现了对多达12种不同RNA链的复杂混合物进行测序，且无需使用任何高级测序算法。9，这为 从头合成 含有标准核苷酸和修饰核苷酸的RNA的质谱测序，使混合及更复杂RNA样本的测序变得更加可行。事实上，利用二维高效率连接介导的质谱测序技术（2D-HELS MS Seq），我们已成功对混合的tRNA样本群体进行了测序10 并积极将其应用扩展到其他复杂的RNA样本。&#160;
为促进2D-HELS MS Seq技术直接测序更广泛的RNA样本，本文将聚焦该测序方法的技术细节，涵盖应用该技术对RNA样本进行直接测序所需的全部关键步骤。将通过具体示例说明该测序技术，包括合成的单一RNA序列、多种不同RNA序列的混合物，以及含有标准核苷酸和修饰核苷酸（如假尿嘧啶（ψ）和5-甲基胞嘧啶（m5C)。由于所有RNA都含有磷酸二酯键，在适当条件下，任何类型的RNA均可通过酸水解生成适用于2D-HELS MS Seq的理想序列梯状图谱。8,9然而，检测特定RNA的所有梯状片段依赖于仪器。在标准高分辨率LC-MS（40K）上，对纯化的短RNA样品进行测序所需的最低上样量为&#60;35 nt）为每轮100 pmol。然而，当需要进行额外实验时，所需材料更多（每RNA样本最多可达400 pmol）例如，以区分具有相同质量的异构碱基修饰。对模型合成修饰RNA测序所采用的方案同样适用于更广泛的RNA样本测序，包括含有未知碱基修饰的生物来源RNA样本。然而，若使用标准液相色谱-质谱（LC-MS）仪器对完整的tRNA（约76个核苷酸）进行全修饰测序，则需要更大的样本量（例如1000 pmol），并需开发先进的算法以实现其分析 从头合成 测序10.

<table><tbody><tr><td>5' DNA 腺苷酸化试剂盒</td><td>新英格兰生物实验室</td><td>E2610S</td><td>50 μM 浓度</td></tr><tr><td>6550 Q-TOF 质谱仪</td><td>安捷伦科技</td><td>5991-2116EN</td><td>与1290 Infinity LC系统联用</td></tr><tr><td>A(5&amp;acute;)pp(5&amp;acute;Cp-TEG-生物素-3&amp;acute;</td><td>ChemGenes</td><td>91718</td><td>HPLC 纯化</td></tr><tr><td>ATP&amp;gamma;S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11162306001</td><td>锂盐</td></tr><tr><td>Bicine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8660</td><td>BioXtra &amp;ge;99%（滴定）</td></tr><tr><td>生物素马来酰亚胺</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1501</td><td>长臂</td></tr><tr><td>C18 色谱柱</td><td>沃特斯</td><td>186003532</td><td>50 mm &amp;times; 2.1 mm Xbridge C18 色谱柱，填料粒径为 1.7 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>离心式真空浓缩仪</td><td>Labconco</td><td>Refrig 115v/60hz 7310022</td><td>Labconco CentriVap</td></tr><tr><td>ChemBioDraw</td><td>PerkinElmer</td><td>ChemDraw Prime</td><td>生成化合物结构及其性质数据 &amp;和片段</td></tr><tr><td>CMC（N-环己基-N'-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺甲基对甲苯磺酸盐）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2491-17-0</td><td>95% 纯化</td></tr><tr><td>氰基3马来酰亚胺（Cy3）</td><td>Lumiprobe</td><td>11080</td><td>水不溶性</td></tr><tr><td>DEPC处理水</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>AM9906</td><td>经高压灭菌、认证无核酸酶</td></tr><tr><td>二异丙胺（DIPA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>108-18-9</td><td>99% Alfa Aesar</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>无水二甲基亚砜，99.9%</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>无水，结晶状，生物试剂，适用于细胞培养</td></tr><tr><td>甲酸</td><td>默克</td><td>64-18-6</td><td>98-100%，ACS试剂，符合欧洲药典标准</td></tr><tr><td>六氟异丙醇（HFIP）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>920-66-1</td><td>99% Acros Organics</td></tr><tr><td>LC-MS 样品瓶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C4000-11</td><td>塑料螺纹瓶</td></tr><tr><td>LC-MS 小瓶瓶盖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C5000-54A</td><td>自动进样瓶螺旋盖</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88975</td><td>BioUltra &gt;0.1 M Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, &gt;0.2 M NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Oligo Clean &amp;和浓缩器</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>离心柱</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td>OriginLab</td><td>OriginPro</td><td>数据分析与绘图软件</td></tr><tr><td>pCp-生物素</td><td>TriLink BioTechnologies</td><td>NU-1706-BIO</td><td>20 μl (1 mM)</td></tr><tr><td>RNA #1--#6</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>定制RNA寡核苷酸</td><td>19nt-21nt单链RNA，未经进一步纯化直接使用</td></tr><tr><td>摇床平台振荡器</td><td>VWR</td><td>Orbital Shaker Standard 1000</td><td>转速范围 40 至 300 rpm</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>88816</td><td>每毫克磁珠结合约 55 微克生物素化兔 IgG</td></tr><tr><td>磺化氰基3马来酰亚胺</td><td>Lumiprobe</td><td>11380</td><td>水溶性</td></tr><tr><td>T4 DNA连接酶 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>400 单位/微升</td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4PNK-RO</td><td>来自感染了T4 am N81 pse T1噬菌体的大肠杆菌BB</td></tr><tr><td>Tris-HCl 缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6455</td><td>Tris-HCl 缓冲液，pH 10，10&amp;times;，抗原修复剂</td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81871</td><td>尿素，用于合成。CAS号：57-13-6，EC编号：200-315-5</td></tr></tbody></table>

2d-hels ms seq：一种基于液相色谱-质谱的通用方法，用于直接从头测序含不同核苷酸修饰的rna混合物

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

基于质谱（MS）的测序方法已被证明在&#160;直接&#160;测序&#160;无需互补DNA（cDNA）中间体的RNA检测方法。然而，此类方法很少被应用，因为 从头合成 RNA测序方法，但主要用作一种辅助质量控制的工具，以确认纯化的单链RNA样本的已知序列。最近，我们开发了&#160;一种通过将二维质荷比-保留时间疏水性末端标记策略整合到基于质谱的测序技术中的直接RNA测序方法（2D-HELS MS Seq）。该方法能够准确测定单条RNA序列以及包含多达12种不同RNA序列的混合物。除了四种标准核糖核苷酸（A、C、G和U）外，该方法还可用于测序含有修饰核苷酸的RNA寡核苷酸。这得益于修饰碱基本身具有独特的质荷比，有助于其在RNA序列中的鉴定与定位，或可被转化为具有独特质荷比的产物。在本研究中，我们使用了含有两种代表性修饰核苷酸的RNA&#160;假尿苷（Ψ）和5-甲基胞嘧啶（m5C）），以说明该方法的应用 从头合成 单个RNA寡核苷酸测序&#160;以及一组RNA寡核苷酸混合物，每种均具有不同的序列和/或修饰的核苷酸。本文所述用于测序这些模型RNA的实验步骤和方案同样适用于其他短RNA样本（&#60;35 nt）时，使用标准的高分辨率液相色谱-质谱联用系统即可检测，并且也可用于&#160;修饰治疗性RNA寡核苷酸的序列验证&#160;未来，随着更强大的算法的发展以及更先进仪器的出现，该方法有望实现对更复杂的生物样本进行测序。&#160;

在RNA的3´端引入生物素标签，以生成易于识别的质量-Rt梯形图谱。 2D-HELS MS Seq方法的工作流程如图1a所示。在RNA的3´端引入疏水性生物素标记（见第2节）后，与未标记的对应片段相比，3´端标记的梯形组分的质量和Rt值均增加。因此，在二维质量-Rt图谱中，3´端梯形曲线沿y轴方向向更大值偏移（由于Rt值增加），同时沿x轴方向也向更大值偏移（由于质量增加）。图1b展示了样品制备流程，包括为2D-HELS MS Seq在RNA的3´端引入生物素标签的步骤。图1c展示了基于RNA #1的3´端生物素标记质量-Rt梯形片段系统性Rt变化，在二维质量-Rt图谱中将3´端梯形与5´端梯形及其他非目标片段分离开。仅凭3´端梯形曲线即可获得RNA #1的完整序列，而未显示<...

本文介绍了一种基于液相色谱-质谱（LC-MS）的测序方法的详细实验方案，该方法可作为直接测序短链RNA（&#60;35 nt每轮）的手段，无需经过cDNA中间步骤；同时，也可作为在单个研究中以单碱基精度对多种核苷酸修饰进行测序的通用方法。

2D-HELS MS Seq：一种基于液相色谱-质谱的通用方法，用于直接从头测序含不同核苷酸修饰的RNA混合物

基于质谱（MS）的测序方法已被证明可用于直接测序RNA，无需进行...

本方案涵盖了使用新开发的直接测序RNA方法时所需的所有关键步骤，无论RNA样本是单链、混合的还是经过修饰的。该方法不受酶促错误或碱基互补性的影响，提供了一种直接的工作流程和通用解决方案，使得能够同时测序多种RNA修饰，而非一次仅检测一种特定修饰。该技术可开发为一种诊断工具，用于确定与人类疾病相关的特征性RNA片段，同时可作为研究表观转录组水平RNA修饰的精确工具。该方法不依赖于任何先前的测序技术，而是一种全新的方法，我们的目标是使其成为测序任何修饰RNA的首选方法。本实验方案的某些部分包含一些关键步骤，通过视觉演示可以更准确地传达，例如对RNA进行3'端标记、LC-MS数据采集以及使用MassHunter软件进行数据分析。我将演示该操作流程，并设置LC-MS仪器以检测我们的RNA样品。进行一步法标记反应时，将2微升150微摩尔的AppCp-生物素、3微升10倍浓度的连接酶反应缓冲液、1.5微升100微摩尔的RNA样品、3微升无水DMSO、10单位T4 RNA连接酶以及19.5微升DEPC处理水混合，总体积为30微升。将反应物在16摄氏度下孵育过夜，然后根据手稿说明进行柱纯化。将RNA分为三等份，加入等体积甲酸后，在40摄氏度下孵育反应体系。每个反应完成后，立即用干冰冷冻样品，以终止酸降解反应。使用离心真空浓缩仪将样品干燥约30分钟。用20 µL经DEPC处理的水重悬干燥后的样品，并将其混合。在LC-MS检测前，将样品储存在20 °C条件下。在配制好流动相后，将RNA样品转移至LC-MS进样小瓶中。每次进样应包含100至400皮摩尔的RNA，体积为20微升。数据采集完成后，使用分子特征提取工作流程提取化合物信息，包括质荷比、保留时间、峰面积和质量评分。在小分子设置中使用质心数据格式。将峰高设置为至少100，但小于1,000，质量评分设置为至少50。最后，将数据导出为Excel文件。在此处的二维质谱保留时间图上展示了3'梯形条带与5'梯形条带及其他非目标片段的分离情况。还可以对包含两条不同长度RNA链的混合样品进行测序，每条RNA均带有5'生物素标记。为了区分尿苷与假尿苷，对RNA进行了CMC处理，该处理可将假尿苷转化为CMC-假尿苷加合物。该加合物在尿苷中具有不同的质量，可在二维-HELS MS测序中加以区分。通过分析假尿苷转化为其CMC加合物反应的粗产物的HPLC谱图，计算出转化率为42%。采用带有3'端标记的二维-HELS MS测序法对五种不同RNA链的混合物进行测序，并进行了归一化处理，以便更清晰地显示多种RNA序列。若不进行归一化处理，这五种RNA序列的字母编码将会过于密集而难以分辨。进行该实验操作时，应仔细设置标记反应，以获得高产量的标记RNA样本。同时，需精确控制降解时间，以生成可靠的分子量梯度条带，并用20微升水收集最大量的干燥样本。完成本实验方案后，可提出的一个问题是：如何提高测序方法的长度分辨率和通量？更优的算法以及分辨率和灵敏度更高的先进仪器可提供帮助。该实验方案开发完成后，即可直接测序更广泛的RNA样本，包括含有标准核苷酸和修饰核苷酸的样本，且不会产生与基于CDA的RNA测序相关的任何错误。

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科研

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遗传学

2D-HELS MS Seq:一种基于 LC-MS 的通用方法，用于对具有不同核苷酸修饰的 RNA 混合物进行直接和从头测序

microRNA（miRNA）是一类广泛保守的调控分子。本文介绍一种miRNA克隆方法，该方法依赖于两个高效的连接步骤，随后进行高通量测序。本方法可实现miRNA的全基因组范围内精确量化。...

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我们介绍一种基于靶向RNA测序的方法，包括制备带索引的cDNA文库、使用定制探针进行杂交与捕获，以及数据分析，以检测特定转录本的基因表达、突变和基因融合。靶向RNA测序可在台式测序仪上对选定转录本进行经济高效且快速的评估。...

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利用 CyVerse 资源进行 从头合成 非模式生物的比较转录组学

了解基于LC-MS的2D-HELS MS Seq方法，用于直接测序含多种核苷酸修饰的RNA混合物。该技术无需cDNA中间体，可同时检测多种修饰，为表观转录组学研究提供可靠工具。

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