Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

该方案已经过优化，可以更轻松地研究乳酸菌无细胞上清液在多种类型的结肠癌细胞球体中的抗癌作用。该技术是在体内模拟条件下研究 LCFS 对结肠癌球体的抗癌作用的第一种方法。首先将高压灭菌灭菌的 MRS 琼脂平板置于 37 摄氏度的氢气厌氧室中，氧气含量为百万分之 20，并用新鲜解冻的乳酸杆菌细菌原液接种平板。

向试管中加入 2 至 3 毫升 MRS 肉汤，补充有 l-半胱氨酸，并用丁基橡胶塞和试管盖密封试管。接下来，使用定量环收集单个菌落，并将菌落放入含有 500 μL PBS 的 1.5 mL培养管中。在盐水中均匀地重悬菌落，并将整个细菌悬浮液装入 1 毫升注射器中。

将针头插入培养管盖的中心，并将菌落输送到培养基中。将培养物置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳和每分钟 200 转的振荡培养箱中。两天后，在分光光度计上测量培养物的 OD 620 。

当 OD 620 等于 2 时，通过离心沉淀细菌并用 PBS 洗涤细菌沉淀。第二次离心后，将细菌重悬于 4 毫升 RPMI 1640 中，补充有 10% 不含抗生素的胎牛血清，并将细菌以每分钟 100 转的速度放入振荡培养箱中 4 小时。在孵育结束时，通过离心沉淀细菌，并通过 0.22 微米过滤器无菌过滤回收的上清液，在零下 80 摄氏度下储存。

为了制备用于球状体形成的结直肠癌细胞系，在细胞培养箱的 100 毫米培养皿中将目标细胞作为单层培养。当细胞达到 70% 至 80% 汇合度时，用每次洗涤 4 毫升 PBS 洗涤培养物两次，然后用每皿 1 毫升 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 分离细胞。两分钟后，在光学显微镜下检查解离情况。

如果细胞已分离，则用 5 毫升生长培养基中和酶促反应。通过在每个细胞培养物的一个 15 ml 锥形管中离心来收集细胞，然后用每管 3 ml 生长培养基轻轻重悬沉淀。然后，通过台盼蓝排除计算活细胞的数量。

计数后，在新鲜培养基中将细胞稀释至每毫升浓度 10 至 5 个细胞的 1 至 2 倍，并向细胞中加入甲基纤维素至最终浓度为 0.6%。将细胞转移到无菌储液槽中，并使用多通道移液器将 200 微升细胞分配到超低附着 96 孔圆底微孔板的每个孔中。然后，将板置于细胞培养箱中 24 至 36 小时，然后通过光学显微镜检查球状体的形成。

对于 LCFS 处理，在新鲜生长培养基中将制备的解冻 LCFS 储备溶液连续稀释至 25、12.5 和 6% 浓度，并使用 200 微升移液器小心地从铺板的结直肠癌细胞系培养物的每个孔中去除尽可能多的上清液。然后，向每组癌细胞中轻轻加入 200 μL 补充了 LCFS 的生长培养基，一式三份，并将板放回培养箱中再放置 24 至 48 小时。0.6% 的甲基纤维素浓度将测试的癌细胞系细胞转化为致密的球体，表明使用该方案可以从多种类型的结直肠癌中产生球体。

用 25% LCFS 培养的球体表现出表面破坏和细胞活力降低，呈剂量依赖性。事实上，与活的对照细胞相比，LCFS 共培养细胞表现出更高水平的碘化丙啶表达。还可以进行逆转录酶 PCR 分析、蛋白质印迹和流式细胞术膜联蛋白 V/7-AAD 分析，以评估 LCFS 对癌细胞凋亡的影响。

去除生长培养基时，请务必轻拿轻放球体，因为球体很容易破裂，从而无法观察到 LCFS 处理的效果。在此程序之后，可以进行细胞活力测定、定量实时 PCR、Western 印迹和 FACS 分析，以更详细地表征 LCFS 的抗癌作用。