Name: 在结肠直肠癌细胞的三维球体培养物中使用无细胞益生菌超常剂评估细胞死亡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 探索使用无细胞益生菌超常剂在三维球体培养物中诱导结肠直肠癌细胞死亡的实验方法。该技术优化了球体生成流程，可分析细胞凋亡信号通路，为癌症治疗研究提供新思路。

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本研究由韩国标准科学研究院资助的“化学与辐射计量标准建立”项目（项目编号：KRISS-2020-GP2020-0003）和“生物材料与医疗融合计量标准及技术开发”项目（项目编号：KRISS-2020-GP2020-0004）支持。本研究还得到了韩国科学技术信息通信部（MSIT）国家研究基金会（NRF-2019M3A9F3065868）、韩国保健福祉部（MOHW）韩国健康产业发展研究院（KHIDI, HI20C0558）以及产业通商资源部的支持。 &amp;#38; 能源部（MOTIE）以及韩国产业技术评价院（KEIT，20009350）。ORCID 编号（Hee Min Yoo：0000-0002-5951-2137；Dukjin Kang：0000-0002-5924-9674；Seil Kim：0000-0003-3465-7118；Joo-Eun Lee：0000-0002-2495-1439；Jina Lee：0000-0002-3661-3701）。&#160;我们感谢Chang Woo Park在实验方面提供的帮助。

1. 细菌培养及Lactobacillus&#160;无细胞上清液（LCFS）的制备
注意：步骤 1.2 – 1.9 需在厌氧环境中进行。
<ol>
	<li>制备含 L-半胱氨酸的 MRS 琼脂平板和肉汤，并通过高压灭菌器灭菌。</li>
	<li>将MRS琼脂平板预孵育于H2 37 ˚C、20 ppm 氧气条件下维持的厌氧培养箱</li>
	<li>解冻 Lactobacillus 细菌菌种并用细菌培养物接种琼脂平板（图1A (i)).</li>
	<li>在 H 中将细菌孵育 2 - 3 天2 在37 ˚C、20 ppm氧气的厌氧培养箱中培养，直至获得单菌落。</li>
	<li>清洗并干燥 Hungate 型厌氧培养管。将培养管在 121 ˚C 下高压灭菌 15 分钟。</li>
	<li>然后将试管置于 H2 在37 ˚C、20 ppm氧气的厌氧培养箱中去除氧气。</li>
	<li>将2 - 3 mL MRS肉汤加入试管中。用丁基橡胶塞密封试管，并拧紧盖子。</li>
	<li>用接种环挑取单个菌落，放入含有500 µL 1x PBS的1.5 mL离心管中。图1A (ii)).</li>
	<li>使用1 mL注射器悬浮菌落（图1A (iii)）。操作方法为：将1 mL注射器的针头插入试管盖中心，吸取悬浮菌落，然后将其重新悬浮于MRS肉汤培养基中。图1A （iv）).</li>
	<li>在摇床培养箱中孵育MRS肉汤培养基2天（37 °C，5% CO₂）2，200 转/分钟）。</li>
	<li>使用分光光度计测量光密度（OD）以监测细菌生长曲线，直至 OD 处的吸光度达到目标值620 达到 2.0。</li>
	<li>通过在 1,000 x g 条件下离心，分离细菌沉淀和条件培养基。 g 孵育15分钟。用1×PBS洗涤收集的细菌沉淀，并重悬于4 mL添加了10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。培养基中不要加入任何抗生素。</li>
	<li>将细菌沉淀物维持在RPMI中，并在37 °C、5% CO₂条件下于摇床培养箱中孵育4小时2 以100 rpm的速度。</li>
	<li>用于制备益生菌上清液时，以1000 × g离心去除细菌沉淀 x&#160;g，4 °C 下孵育 15 分钟。使用 0.22 μm 滤器对收集的上清液进行无菌过滤，保存于 −80 °C，直至使用。</li>
</ol>
2. 类球体的生成
<ol>
	<li>准备结直肠癌细胞系
	<ol>
		<li>将 DLD-1、HT-29 和 WiDr 细胞系以单层培养至 70–80% 汇合度，并在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育（培养基：含 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素的 RPMI 培养基）。</li>
		<li>对于在 100 mm 培养皿中培养的细胞，用 4 mL 1× PBS 洗涤两次。加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 2 分钟，以解离细胞。</li>
		<li>孵育后，在显微镜下观察细胞解离情况，并加入 5 mL 培养基中和胰蛋白酶-EDTA。</li>
		<li>将解离后的细胞转移至 15 mL 圆锥形离心管中，以 300 x&#160;g 离心 3 分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用 3 mL 培养基轻柔重悬细胞。</li>
		<li>使用台盼蓝染色并通过血细胞计数板计数细胞，以确定活细胞数量。（图 1B (i)）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类球体形成
	<ol>
		<li>在 15 mL 圆锥形离心管中，将步骤 2.1.5 中的细胞稀释至 1–2 × 105 个细胞/mL（图 1B (ii)）</li>
		<li>向细胞悬液中加入终浓度为 0.6% 的甲基纤维素，并将稀释后的细胞转移至无菌储液槽中。 
		注意：每种细胞系所需的甲基纤维素用量应通过滴定确定。</li>
		<li>使用多通道移液器将 200 µL 细胞悬液加入超低吸附 96 孔圆底微孔板的每个孔中。（图 1B (iii)）</li>
		<li>将微孔板置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 24–36 小时。</li>
		<li>孵育 24–36 小时后，在光学显微镜下观察微孔板，确认类球体的形成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用 LCFS 处理三维结直肠癌细胞
<ol>
	<li>按照步骤 2 和 3 所述方法生成球状体。</li>
	<li>在进行 LCFS 处理前，将冷冻的 LCFS 在室温（RT）下解冻 10 - 20 分钟。</li>
	<li>将 LCFS 储备液接种至生长培养基中，并在生长培养基中连续稀释至 25%、12.5% 和 6%（例如，25% LCFS = 150 µL 生长培养基 + 50 µL LCFS）。</li>
	<li>从培养箱中取出含有球状体的细胞培养板，使用 200 μL 移液器尽可能吸除每个孔中的生长培养基。</li>
	<li>向细胞中加入含 LCFS 的生长培养基，在 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 24 - 48 小时。 
	注意：所用体积取决于培养板规格，具体如下：6 孔板每孔 2 mL；96 孔板每孔 200 μL。</li>
</ol>
4. 类球体的细胞活力
<ol>
	<li>在不透光多孔板中准备8至10个经LCFS处理的结直肠癌类球体（细胞活力检测在LCFS处理后48小时进行）。</li>
	<li>将细胞活力检测试剂（见材料表）在4 °C条件下过夜解冻。</li>
	<li>使用前将细胞活力检测试剂平衡至室温。</li>
	<li>进行检测前，移除类球体中50%的培养基。</li>
	<li>向每孔加入100 µL细胞活力检测试剂。 
	注意：试剂使用体积取决于板的规格，96孔细胞培养板每孔加100 μL。</li>
	<li>剧烈震荡混合5分钟，以促进细胞裂解。</li>
	<li>在37 °C下孵育30分钟至2小时。</li>
	<li>记录发光信号。</li>
</ol>
5. 类球体的定量实时聚合酶链式反应分析
<ol>
	<li>每种条件下，在2 mL离心管中准备10 - 15个类球体，并在400 × g 条件下离心3分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并用1 mL预冷的1× PBS将类球体洗涤两次。 
	注意：避免离心，让类球体自然沉降。</li>
	<li>尽可能吸除1× PBS，并使用市售试剂盒提取RNA。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用市售试剂盒从1 μg RNA中合成cDNA。</li>
	<li>配制主混合液，以便对所有样本进行三复孔检测（见表1和表2）。</li>
	<li>将20 µL模板主混合液加入每个qPCR板孔中进行扩增反应。</li>
	<li>充分混匀反应体系，必要时进行短暂离心。</li>
	<li>按照仪器制造商的建议运行样本（表3）。</li>
</ol>
6. 从球状体进行蛋白质印迹分析
注意：收集球状体时，使用 200 μL 移液器，并剪去吸头末端，以避免破坏其结构。
<ol>
	<li>每种条件下，在 2 mL 离心管中准备 30 - 40 个球状体。</li>
	<li>将离心管置于冰上，让球状体沉降至 2 mL 离心管底部。</li>
	<li>弃去上清液，并用 1 mL 冰冷的 1× PBS 洗涤球状体两次。 
	注意：避免离心，让球状体自然沉降。</li>
	<li>尽可能吸除 1× PBS，加入含有蛋白酶抑制剂混合物的 RIPA 裂解缓冲液（10 个球状体 = 30 µL RIPA 缓冲液）。</li>
	<li>通过移液吹打使细胞裂解，并进行超声处理，每次超声 30 秒，冰上静置 30 秒，共重复 10 个循环。</li>
	<li>在 4 °C 条件下，以 15000 x g 离心 15 分钟，收集蛋白裂解液。</li>
	<li>测定每种细胞裂解液的蛋白浓度。</li>
	<li>上样前，将每种细胞裂解液在样品缓冲液中于 100 °C 煮沸 10 分钟。</li>
	<li>将等量蛋白上样至 SDS-PAGE 凝胶的加样孔中，在 100 V 条件下电泳 1 - 2 小时。</li>
	<li>将凝胶中的蛋白转移至 PVDF 膜上。</li>
	<li>转膜后，使用封闭缓冲液（5% 脱脂奶粉 + 含 0.05% Tween-20 的 TBS）在室温下封闭膜 1 小时。</li>
	<li>将膜在含 5% BSA 的 1× TBST 缓冲液中，于 4 °C 过夜孵育一抗（稀释比例为 1:1,000）（见表 4）。</li>
	<li>用 TBST 洗涤膜三次，每次 15 分钟。</li>
	<li>将膜在封闭缓冲液中，室温孵育二抗（稀释比例为 1:2,500）2 小时（参见材料表）。</li>
	<li>用 TBST 洗涤膜三次，每次 15 分钟。</li>
	<li>使用化学发光底物对膜进行 HRP 检测前处理。</li>
	<li>采集化学发光图像。</li>
</ol>
7. 类球体的碘化丙啶（PI）染色
<ol>
	<li>按照步骤4.1所述制备5-10个球状体，并将球状体置于37 °C、5% CO2的培养箱中。</li>
	<li>用1×PBS将1 mg/mL的PI储备液稀释1:100。</li>
	<li>从96孔板的每孔中移除50%的培养基。</li>
	<li>向每孔中加入100 µL PI溶液，并将孔板置于37 °C、5% CO2的培养箱中孵育10–15分钟。</li>
	<li>用1×PBS洗去PI溶液。</li>
	<li>每孔加入200 µL生长培养基，使用荧光显微镜拍摄图像。使用Image J分析荧光强度，以获得球状体的存活率计数。</li>
</ol>
8. 类球体的流式细胞术分析
<ol>
	<li>按照先前所述方法生成球状体。</li>
	<li>针对每种条件，在 FACS 管中准备 30 - 40 个球状体，并在室温下以 400 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，用 3 mL 的 1× PBS 清洗球状体，然后在 4 °C 下以 400 x&#160;g 离心 3 分钟。</li>
	<li>吸除上清液，加入 200 µL 的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，室温孵育 2 - 3 分钟。 
	注意：孵育时间取决于球状体大小和细胞类型。</li>
	<li>加入 1 mL FACS 缓冲液，使用 200 μL 移液器轻轻吹打使球状体解离。</li>
	<li>将解离后的细胞在 4 °C 下以 400 x&#160;g 离心 3 分钟。 
	注意：FACS 缓冲液 = 1× PBS + 2.5% FBS，使用 0.22 µm 滤器过滤。</li>
	<li>弃去上清液，加入 7-AAD/Annexin V 试剂（每样本加入 7AAD (5 µL) 和 Annexin V (5 µL)）。</li>
	<li>轻轻涡旋混匀细胞，并在室温避光条件下孵育 13 - 30 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 500 µL FACS 缓冲液，并使用锥形聚苯乙烯试管过滤细胞，以去除细胞聚集体。</li>
	<li>在 4 °C 下以 400 x&#160;g 离心 3 分钟。</li>
	<li>向每管中加入 500 µL Annexin V 结合缓冲液并重悬细胞。</li>
	<li>使用流式细胞仪进行分析。</li>
</ol>

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<li>Michalovich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+disease+severity+magnify+disturbed+microbiome-immune+interactions+in+asthma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Obesity and disease severity magnify disturbed microbiome-immune interactions in asthma patients.</a> Nature Communications. 10, 5711(2019).</li>
<li>Ansaldo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akkermansia+muciniphila+induces+intestinal+adaptive+immune+responses+during+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Akkermansia muciniphila induces intestinal adaptive immune responses during homeostasis.</a> Science. 364 (6446), 1179-1184 (2019).</li>
</ol>

作者没有相关的财务披露。

组织微环境，包括邻近细胞和细胞外基质（ECM），对组织生成至关重要，并在调控细胞生长和组织发育中起关键作用13。然而，二维培养存在多种缺点，例如细胞间相互作用的破坏，以及细胞形态、细胞外环境和分裂方式的改变14。三维细胞培养系统已被广泛研究，以更真实地模拟体内效应，并已被证实是体外肿瘤药物测试中更为精确的系统15,16。目前亟需建立能够更准确预测个体对化疗药物反应的模型系统17。
为组织工程开发了三维支架，其可作为细胞外基质（ECM）缺失的替代物，代表肿瘤细胞可用的空间。此外，该支架为细胞黏附和增殖提供物理相互作用，并促使细胞形成适当的空间分布以及细胞-ECM或细胞-细胞间的相互作用18。甲基纤维素（MC）聚合物已被持续研究，以评估其在构建适用于三维细胞培养工程的MC基水凝胶系...

益生菌是肠道中有益的微生物，可改善免疫稳态和宿主能量代谢1。其中，来源于乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）的益生菌是肠道中最常见且研究最深入的种类2,3。先前的研究表明，乳杆菌属（Lactobacillus）对多种癌症（包括结直肠癌）具有抑制和抗增殖作用4。此外，益生菌还能预防炎症性肠病、克罗恩病以及溃疡性结肠炎5,6。然而，大多数益生菌相关研究是在固体表面培养的二维（2D）单层细胞模型中进行的。
人工培养系统缺乏癌症细胞所处的自然环境特征。为克服这一局限，已开发出三维（3D）培养系统7,8。在三维培养中，癌细胞在多种基本生物学机制方面表现出改善，例如细胞活力、增殖能力、形态学特征、细胞间通讯、药物敏感性以及与体内环境的相关性9,10。此外，结直肠癌的多细胞类型可形成类球体结构，其形成依赖于细胞间的相互作用以及细胞外基质（ECM）11。我们先前的研究报道，利用Lactobacillus fermentum产生的益生菌无细胞上清液（CFS）对结直肠癌（CRC）细胞的三维培养模型具有抗肿瘤作用12。我们提出，CFS是一种适用于在三维类球体模型中检测益生菌效应的替代策略12。
本文介绍了一种可容纳多种细胞类型的三维结直肠癌模型的方法，用于分析益生菌无细胞上清液（CFS）对多种三维结直肠癌模拟系统治疗效果的影响。该方法为体外研究相关益生菌及其抗肿瘤效应提供了可行手段。

<table><tbody><tr><td>&lt;br/&gt; Mini-PROTEAN TGX 预制蛋白凝胶（10%，15 孔，15 &amp;micro;l）</td><td>Biorad</td><td>4561036</td><td>每包 10 块</td></tr><tr><td>Applied Biosystems MicroAmp 光学粘性密封膜</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>100 片盖膜</td></tr><tr><td>10x 转膜缓冲液</td><td>Intron</td><td>IBS-BT031A</td><td>1 L</td></tr><tr><td>10X Tris-甘氨酸（含 SDS）</td><td>Intron</td><td>IBS-BT014</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Axygen 2.0 mL MaxyClear 扣盖微量离心管，聚丙烯材质，透明，非无菌，每包 500 支，每箱 10 包</td><td>Corning</td><td>SCT-200-C</td><td>每包 500 支，每箱 10 包</td></tr><tr><td>BD Difco Bacto 琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td>500 g</td></tr><tr><td>BD Difco 乳酸杆菌 MRS 肉汤</td><td>BD</td><td>DF0881-17-5</td><td>500 g</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 细胞活力检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>96 孔板中每检测使用 100&amp;mu;l</td></tr><tr><td>完全蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td>每瓶 20 片</td></tr><tr><td>Corning 磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4 &amp;plusmn; 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon-P PVDF 转印膜</td><td>fisher Scientific</td><td>IPVH00010</td><td>26.5 cm × 3.75 m 卷装；孔径：0.45 µm</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 圆底聚苯乙烯试管，带细胞筛网扣盖</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>每包 25 支，每箱 500 支</td></tr><tr><td>胎牛血清，经认证，美国来源</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂盒，25 × 20 &amp;micro;l 反应 #1708890</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>25 × 20 &amp;micro;L 反应</td></tr><tr><td>iTaq 通用 SYBR Green Supermix</td><td>Biorad</td><td>1725121</td><td>5 × 1 mL</td></tr><tr><td>Lactobacillus fermentum</td><td>Korean Collection for Type Cultures</td><td>KCTC 3112</td><td></td></tr><tr><td>盐酸半胱氨酸一水合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6852-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>甲基纤维素（3500–5600 mPa&amp;middot;s，2% 水溶液，20&amp;deg;C）</td><td>TCI</td><td>M0185</td><td>500 g</td></tr><tr><td>MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（带条形码，0.1 mL）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>20 块</td></tr><tr><td>Millex-GS 注射器滤器，0.22 &amp;micro;m，混合纤维素酯，33 mm，环氧乙烷灭菌</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>250 个</td></tr><tr><td>PE Annexin V 凋亡检测试剂盒（含 7-AAD）</td><td>Biolegend</td><td>640934</td><td>100 次检测</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/mL）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Introgen</td><td>P1304MP</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>RIPA 裂解与提取缓冲液</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89901</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini 试剂盒（250）</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>250 次</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料/设备/软件名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注/说明&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗 - p-I&amp;kappa;B&amp;alpha; (B-9)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-8404</td><td>200 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗-BclxL (H-5)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-8392</td><td>200 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>抗-PARP 1 (C2-10)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-53643</td><td>50 &amp;micro;l 腹水</td></tr><tr><td>抗-&amp;beta;-肌动蛋白 (C4)</td><td>Santa cruze</td><td>sc-47778</td><td>200 &amp;micro;g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>美国加利福尼亚州圣地亚哥</td></tr><tr><td>Synergy HTX 多功能微孔板读板仪</td><td>BioT</td><td>S1LFA</td><td></td></tr><tr><td>CO2 培养箱</td><td>Thermo fisher</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形离心管</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形离心管</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低吸附多孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7007</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低吸附多孔板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Costar 50 mL 试剂储液槽，每袋 5 个，无菌</td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Countess 细胞计数专用载玻片</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 全自动细胞计数仪</td><td>invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>EnSpire 多功能读板仪</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Enspire 2300</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 多通道移液器，8 通道</td><td>Eppendorf</td><td>3122000051</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件</td><td>TreeStar</td><td></td><td>美国俄勒冈州阿什兰</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-035-062</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td>2.0 mL</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>美国加利福尼亚州圣地亚哥</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 mini</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>日本东京</td></tr><tr><td>恒温摇床</td><td>Lab companion</td><td>SIF-6000R</td><td></td></tr><tr><td>Multi Gauge Ver. 3.0</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>日本东京</td></tr><tr><td>光密度（OD）LAMBDA 紫外/可见光分光光度计</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td></tr><tr><td>相差显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td>日本东京</td></tr><tr><td>SPL 微量离心管 1.5 mL</td><td>SPL</td><td>60015</td><td></td></tr><tr><td>SPL 多通道储液槽，12 通道，聚苯乙烯，无菌</td><td>SPL</td><td>21012</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td></tr><tr><td>Vibra-Cell 超声波液体处理器</td><td>SONICS-vibra cell</td><td>VC 505</td><td>500 瓦超声处理器</td></tr><tr><td>乙烯基厌氧培养箱</td><td>COY LAB PRODUCTS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用益生菌无细胞上清液在结直肠癌细胞三维球体培养中评估细胞死亡

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

本论文描述了一种利用多细胞类型癌细胞的三维（3D）球状体及其上清液评估癌细胞死亡的实验方案 Lactobacillus fermentum 细胞培养, 被视为益生菌培养物。使用三维培养来测试 乳酸杆菌 无细胞上清液（LCFS）是比二维单层培养检测更优的选择，尤其是当 L. fermentum 可在肠道内产生抗癌作用。 L. fermentum 上清液被证实对多种结直肠癌（CRC）细胞在三维培养条件下具有增强的抗增殖作用。有趣的是，这些效应与培养模型密切相关，显示出该模型显著的能力 L. fermentum 诱导癌细胞死亡。采用下述方案，从多种结直肠癌细胞（CRCs）成功生成了稳定的球状体。该三维球状体构建方案具有节省时间与成本的优势。本系统旨在便于研究LCFS对多种类型CRC球状体的抗肿瘤作用。正如预期，经LCFS处理的CRC球状体在实验过程中显著诱导了细胞死亡，并通过qRT-PCR、蛋白质印迹（western blotting）和FACS分析检测到特定的凋亡分子标志物表达。因此，该方法在探索细胞活力及评估抗癌药物疗效方面具有重要价值。

我们描述了从多种结直肠癌细胞系获得类球体的实验方案。生成类球体需要添加甲基纤维素。我们还介绍了一种LCFS的制备方法，并提出了一种用于研究益生菌与结直肠癌之间相关性的模型。类球体形成和LCFS制备的实验流程在图1A、B中以示意图形式展示。如图2A所示，0.6%的甲基纤维素浓度可使癌细胞转变为致密的类球体。该结果表明，利用我们的甲基纤维素方案可以从多种类型的结直肠癌细胞中生成类球体。随后，将类球体用25%的LCFS处理，并在48小时后通过光学显微镜观察其形态变化。如图3A所示，经LCFS处理的各组类球体表面出现破坏。为了研究LCFS在合适浓度下的抗肿瘤作用，将类球体分别用不同浓度的LCFS（0（对照）、6%、12.5%和25%）处理48小时。在使用25% LCFS处理的类球体中观察到类球体形态的破坏，如图3B所示。此外，类球体分别用25% LCFS处理24小时和48小时...

本文介绍了研究抗癌作用的方法 Lactobacillus 无细胞上清液（LCFS）。在三维培养条件下，结直肠癌细胞系经LCFS处理后出现细胞死亡。类球体的生成过程可根据支架材料进行优化，所采用的分析方法有助于评估相关信号通路的激活情况。

本文描述了一种利用多细胞类型癌细胞的三维（3D）球状体评估癌细胞死亡的实验方案。

本方案经过优化，可更便捷地研究乳酸杆菌无细胞上清液对多种结肠癌细胞球体的抗癌作用。该技术是首个在模拟体内条件下探究乳酸杆菌无细胞上清液对结肠癌球体抗癌效应的方法。首先，将经高压灭菌的MRS琼脂平板置于37摄氏度、含20 ppm氧气的厌氧氢气培养箱中，并接种新鲜解冻的乳酸杆菌菌种。向试管中加入2至3毫升MRS肉汤，并添加L-半胱氨酸，然后用丁基橡胶塞和试管盖密封试管。接下来，用接种环挑取单个菌落，将其放入含有500微升PBS的1.5毫升培养管中。将菌落在盐水中充分重悬，然后将整个细菌悬液转移至1毫升注射器中。将针头插入培养管盖的中心，并将菌落接种到培养基中。将培养物置于摇床培养箱中，在37摄氏度、5%二氧化碳及200转/分钟的条件下培养。两天后，使用分光光度计测定培养物在620 nm处的光密度（OD620）。当OD620达到2时，通过离心沉淀细菌，并用PBS洗涤细菌沉淀。第二次离心后，将细菌重悬于4毫升RPMI 1640培养基中，该培养基添加有10%胎牛血清且不含抗生素，然后将细菌置于摇床培养箱中，在100转/分钟条件下孵育4小时。孵育结束后，通过离心收集细菌沉淀，将上清液经0.22微米滤器无菌过滤，保存于-80摄氏度。为进行类球体形成实验，将目标结直肠癌细胞系在细胞培养箱中以单层形式培养于100毫米的培养皿中。当细胞融合度达到70%至80%时，用4毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，每次洗涤后加入1毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化细胞。消化2分钟后，在光学显微镜下观察细胞是否已解离。如果细胞已脱落，加入五毫升培养基以中和酶反应。将每份细胞培养物中的细胞收集至一个15毫升锥形管中，通过离心分离细胞，并每管加入三毫升培养基轻轻重悬细胞沉淀。随后，采用台盼蓝排斥法计数活细胞数量。计数后，用新鲜培养基将细胞稀释至每毫升含1×10⁵至2×10⁵个细胞，并向细胞中加入甲基纤维素，使其终浓度为0.6%。将细胞转移至无菌储液槽中，使用多通道移液器将200 µL细胞悬液分配至超低吸附96孔圆底微孔板的每个孔中。随后，将培养板置于细胞培养箱中孵育24至36小时，然后通过光学显微镜检查球形细胞团（spheroids）的形成情况。对于LCFS处理，将制备好的解冻LCFS储备液用新鲜培养基连续稀释至25%、12.5%和6%的浓度，并使用200微升移液器小心吸出每孔贴壁培养的结直肠癌细胞系中尽可能多的上清液。随后，轻柔地向每组癌细胞中加入200微升含有LCFS的培养基，每个浓度设三个重复，然后将培养板放回培养箱继续培养24至48小时。0.6%的甲基纤维素浓度可使被测癌细胞系形成致密的球状体，表明使用本方案可从多种类型的结直肠癌细胞中生成球状体。使用25% LCFS培养的类球体表现出表面结构紊乱，并以剂量依赖性方式降低细胞活力。事实上，与存活的对照细胞相比，LCFS共培养细胞表现出更高水平的碘化丙啶表达。还可通过逆转录PCR分析、蛋白质印迹以及流式细胞术Annexin V/7-AAD分析，评估LCFS对癌细胞凋亡的影响。在更换培养基时务必轻柔操作类球体，因为类球体容易破碎，从而无法观察LCFS处理的效应。完成此步骤后，可进行细胞活力检测、定量实时PCR、蛋白质印迹和FACS分析，以更详细地表征LCFS的抗癌作用。

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