Name: X射线晶体学研究热木体马里蒂玛M42氨基肽TmPep1050的寡聚态过渡 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 了解X射线晶体学方法研究TmPep1050氨基肽酶的寡聚态过渡机制。本方案涵盖蛋白质纯化、晶体生长及数据处理流程，适用于研究依赖寡聚化的酶功能。

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感谢 Martine Roovers 对本文进行校对并提出建设性意见。Proxima 2 光束线（SOLEIL 同步辐射光源）的使用权限属于 20151139 区块分配组。

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述方案可在结构水平上揭示TmPep1050从二聚体向十二聚体转变的过程。此前已应用该方法成功解析TmPep1050两种寡聚体的结构11。其中最具挑战性的步骤是寻找能够促使十二聚体解离为稳定二聚体的条件，这些条件必须足够温和，以便在加入金属离子辅因子后，二聚体可重新组装为十二聚体。寡聚体的分离也是一个关键步骤，因为它直接影响后续的结构研究和生化表征（例如，在不同浓度Co2+条件下研究十二聚体的重新组装）。采用分子置换法——一种已被验证的相位确定方法——来解析TmPep1050寡聚体及其变体的结构。本方案可推广应用于研究其他寡聚状态依赖于金属辅因子可用性的金属酶。
为说明该实验方案，本文展示了一个研究案例：TmPep1050H60A H307A，其金属结合位点因将His-60和His-307突变为丙氨酸而受损。这两个残基分别在M2和M1位点结合Co2+。干扰金属结合可能会影响其寡聚化状态，并导致完全解离为单体。此前已有文献报道，分别来自P. horikoshi...

寡聚化是一种主要过程，决定了许多蛋白质的生物学功能。在Escherichia coli中，据估计仅有35%的蛋白质为单体形式1。某些蛋白质被称为morpheeins，甚至可以形成多种寡聚状态，且在每种寡聚状态中，其亚基具有不同的结构2。它们在不同寡聚状态之间的转换通常是调控蛋白质活性的一种机制，因为每种寡聚状态可能具有不同的特异性活性或功能。文献中已有多个morpheeins的实例被充分记录，尤其是δ-氨基乙酰丙酸合酶3、HPr激酶/磷酸酶4、Lon蛋白酶5、乳酸脱氢酶6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶7、丙酮酸激酶8、柠檬酸合酶9以及核糖核酸酶A10。最近，我们描述了M42氨肽酶TmPep1050，这是另一种具有类似morpheein行为的酶，其活性依赖于其寡聚状态11。其寡聚状态之间的转换由金属辅因子介导，这些辅因子可诱导亚基发生多种结构变化。
M42 氨基肽酶家族属于 MH 超家族12,13，且在细菌和古菌中广泛分布14M42 氨肽酶是真正的双核酶，可降解长度达 35 个氨基酸残基的肽段15它们采用一种由12个亚基组成的独特四面体结构，其活性位点位于其中&#160;朝向一个内部空腔。这种排列通常被称为活性的纳米区室化，以避免不受控制的蛋白水解。M42 氨肽酶的生理功能可能与蛋白酶体相关，负责水解产生的肽段&#160;来自蛋白质降解16,17. Pyrococcus horikoshii 具有四种M42氨肽酶，每种均表现出独特但互补的特异性18,19,20,21由两种不同类型亚基组成的异源复合物已有报道 P. horikoshii，表明存在肽酶体复合物22,23.
文献中已报道了多种M42氨肽酶的结构11,16,18,19,20,24,25,26。其亚基由两个不同的结构域组成：催化结构域和二聚化结构域。催化结构域采用一种在MH家族中保守的典型α/β折叠&#160;，该结构域的原型为Vibrio proteolyticus的氨肽酶Ap127。二聚化结构域则采用一种类似PDZ的折叠结构16，除了在寡聚化中发挥作用外，还可能参与调控底物进入和结合到内部空腔的过程11。由于其基本结构单元是二聚体，十二聚体通常被描述为六个二聚体的结合体，每个二聚体位于四面体的一条边上16。M42氨肽酶的寡聚化依赖于其金属辅因子的可用性。二价金属离子（通常是Zn2+和Co2+）在肽的结合与水解过程中具有催化作用。这些金属离子结合于两个不同的位点，即M1位点和M2位点。这两个金属离子还驱动并精细调节寡聚化过程，这已在PhTET2、PhTET3、PfTET3和TmPep1050中得到证实11,24,28,29。当金属辅因子缺失时，十二聚体会解离为二聚体，如PhTET2、PhTET3和TmPep1050所示11,16,28；甚至进一步解离为单体，如PhTET2和PfTET3中所观察到的24,29。
本文介绍了一种用于研究TmPep1050寡聚体结构的实验方案。该方案包含一系列常用方法，如蛋白质纯化、蛋白酶活性筛选、结晶、X射线衍射以及分子置换法。文中特别强调了在处理金属酶、蛋白质寡聚化、蛋白质结晶及分子置换过程中所涉及的关键技术细节。此外，本文还提供了一个研究案例，旨在探讨TmPep1050十二聚体是否能够进一步解离为单体。为回答这一问题，研究人员对一种TmPep1050突变体TmPep1050H60A H307A进行了研究，该突变体通过将His-60（M2位点）和His-307（M1位点）突变为丙氨酸残基，从而破坏了其金属离子结合位点。本实验方案可适用于研究其他M42家族氨肽酶，或具有类似morpheein行为的金属酶。

<table><tbody><tr><td>1,10-邻菲啰啉</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 ml 离心滤膜 Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 离心滤膜 Ultracel 30K</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>苯并核酸酶（Benzonase Nuclease）</td><td>Merck Millipore</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>N/A</td><td></td><td>访问 http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr><tr><td>cOmplete 无EDTA蛋白酶抑制剂</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Coot</td><td>N/A</td><td></td><td>访问 https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr><tr><td>Crystal Screen I</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen II</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR 预混液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal 15孔工具</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>大肠杆菌PPY菌株</td><td>N/A</td><td></td><td>参见参考文献31</td></tr><tr><td>大肠杆菌XL1-blue菌株</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤校准试剂盒 HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤校准试剂盒 LMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>凝胶过滤标准品</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 质粒小提试剂盒</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Index</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td><td>Molecular Dimensions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸对硝基苯胺</td><td>Bachem AG</td><td>40010720025</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Neggia插件</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>访问 https://www.dectris.com/</td></tr><tr><td>NeXtal JCSG核心试剂盒I型管</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal JCSG核心试剂盒II型管</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal JCSG核心试剂盒III型管</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal JCSG核心试剂盒IV型管</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phenix</td><td>N/A</td><td></td><td>访问 https://www.phenix-online.org/</td></tr><tr><td>Phusion高保真DNA聚合酶</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin透析管，3.5K截留分子量</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>Source 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>Source 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 制备级</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8菌株</td><td>美国模式培养物集存库</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>DNASU质粒库</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>XDS</td><td>N/A</td><td></td><td>访问 http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr><tr><td>xdsme</td><td>N/A</td><td></td><td>访问 https://github.com/legrandp/xdsme</td></tr></tbody></table>

x射线晶体学研究寡聚态转变 thermotoga maritima m42 氨基肽酶 tmpep1050

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

M42 氨肽酶可形成由 12 个亚基组成的、具有功能活性的复合物。其组装过程似乎受到金属离子辅因子的调控，可触发二聚体向十二聚体的转变。金属离子结合后，活性位点及相互作用界面会发生多种结构改变，从而促使二聚体构象调整以促进自身组装。为观察此类结构变化，需在开展结构研究前分离获得稳定的寡聚体。本文报道了一种方法，可用于纯化来源于中国台湾甲烷球菌（*Methanococcus thermolithotrophicus*）的 M42 氨肽酶 TmPep1050 的稳定十二聚体和二聚体。 T. maritima，以及通过X射线晶体学对其结构的测定。二聚体是通过螯合剂去除十二聚体中的金属离子而制备的。在缺乏这些金属离子的情况下&#160;辅因子存在时，十二聚体稳定性降低，并在加热后完全解离。寡聚结构通过直接的分子置换法解析。为说明该方法，展示了一种TmPep1050突变体的结构，该突变体完全丧失金属离子结合能力，结果显示其二聚体未进一步分解为单体。

为了研究TmPep1050中十二聚体可能解离为单体的情况，使用合成基因将His-60和His-307密码子替换为丙氨酸密码子。随后将该基因克隆至pBAD载体中，用于表达和纯化相应的TmPep1050变体，该变体被命名为TmPep1050H60A H307A。凝胶过滤色谱（图3B）显示，纯化后的蛋白表观分子量为56 kDa（单体分子量为36.0 kDa）。已有研究报道TmPep1050二聚体的表观分子量为52 kDa11。因此，可推断TmPep1050H60A H307A的寡聚状态为二聚体。在比活性方面，TmPep1050H60A H307A在L-Leu-pNA作为底物时完全无活性，即使在钴离子存在条件下亦如此。该结果强烈提示该变体无法结合任何金属离子。
通过在二聚体条件（即 0.1 M 柠檬酸钠 pH 6.0，10% PEG3350）附近调整 pH 与 PEG 浓度，对 TmPep1050<s...

本方案旨在从结构层面研究TmPep1050（一种M42型氨肽酶）从二聚体到十二聚体的转变过程。该流程简明清晰，涵盖从蛋白质纯化到X射线数据处理的全过程。通过TmPep1050H60A H307A变体这一研究实例，重点阐述了晶体生成、数据集指标化以及分子置换等关键步骤。

X射线晶体学研究寡聚态转变 Thermotoga maritima M42 氨基肽酶 TmPep1050

M42 氨肽酶形成由 12 个亚基组成的具有功能活性的复合物。其组装过程似乎受到金属离子的调控……

该方案有助于研究具有不同寡聚状态以及寡聚化依赖性活性的氨肽酶，这些活性在无活性二聚体与有活性十二聚体之间保持平衡。这种常规技术可在任何实验室中轻松实施，除了需要使用同步辐射光束线或X射线晶体学设施外，无需特殊设备。经过适当调整，该方法可适用于任何其他功能或活性依赖于其寡聚化程度的蛋白质。在处理X射线数据时，使用者需具备晶体学的基本知识。我们建议使用者参加相关培训，访问XDS Wiki，并观看Phenix教程。进行活性测定实验时，将25微升100 mM L-亮氨酸对硝基苯胺加入到965微升50毫摩尔MOPS缓冲液、250微摩尔氯化钴(II)和10%甲醇中。在将酶稀释至1微摩尔终浓度（使用额外的50毫摩尔MOPS缓冲液）之前，先将反应混合物于75摄氏度干浴中预孵育。接着，向反应混合物中加入10微升1微摩尔的酶溶液，涡旋混匀后，将反应体系放回75摄氏度干浴中继续孵育，时间不超过一小时。当溶液变为黄色时，加入1毫升20%乙酸终止反应，涡旋混匀后，静置至室温冷却。然后取部分反应混合物转移至分光光度计比色皿中，以不含酶的孵育反应混合物作为阴性对照，在410纳米处测定吸光度。制备脱辅基酶时，向890微升含50毫摩尔MOPS、0.5摩尔硫酸铵的溶液中加入10微升1,10-菲咯啉储备液以及100微升纯化的TmPep1050。使用活性测定方法检测活性损失，但不添加氯化钴（II）。检测结束后，将样品转移至透析管中，并在4 °C条件下，用200毫升50毫摩尔MOPS缓冲液含0.5摩尔硫酸铵进行透析。在48小时透析过程中，更换三次新鲜缓冲液，然后从透析管中收集样品。使用截留分子量为30千道尔顿的超滤装置，将样品浓缩至100微升，并在280纳米波长下用微量体积分光光度计测定其浓度。为制备二聚体，将脱辅基酶用含有50毫摩尔MOPS和0.5摩尔硫酸铵的溶液稀释至1微摩尔浓度，并在75摄氏度干浴中孵育反应2小时。随后将酶样品浓缩至体积至少为50微升，并通过尺寸排阻色谱检测其分子量。为改善蛋白质晶体的形态、大小和结晶度，向晶体液滴中加入适量优化后的结晶溶液，使晶体液滴总体积达到10微升。将液滴转移至一个1.5毫升的微量离心管中，并向接种孔中加入90微升更多的结晶溶液。对于每种种子稀释液，向结晶板中相应数量的孔中每孔加入500微升结晶试剂，并在每个结晶支撑体中将2微升蛋白样品与2微升结晶试剂及0.2微升种子混合。然后将支撑体固定在每孔的结晶试剂上。进行晶体挑选时，将液氮倒入杜瓦瓶中，并将用于样品处理的任何小瓶或篮子浸入液氮中。操作液氮具有危险性，可能导致严重冻伤。务必穿戴适当的个人防护装备，如低温手套和护目镜。根据晶体大小设置不同尺寸的样品挑取环，使用双目镜选择含有晶体的液滴。然后用环轻轻挑取一个孤立的晶体，立即将其浸入液氮中，再将环放入合适的样品管中。为了测量衍射斑点强度，创建一个用于运行XD

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