Name: 验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-06T15:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的方法，通过HAT活性测定、免疫印迹和ChIP-qPCR技术评估其效力与选择性。该方案为癌症表观遗传学研究提供可重复的标准化流程。

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本研究得到了佛罗里达州卫生部詹姆斯和埃丝特·金生物医学研究计划（6JK03 和 20K07）、班克黑德-科利癌症研究计划（4BF02 和 6BC03）、佛罗里达乳腺癌基金会以及佛罗里达大学健康癌症中心的资助。此外，我们谨向 Zachary Osking 博士和 Andrea Lin 博士致以感谢，感谢他们在论文发表过程中提供的支持。

1. 体外HAT活性检测
<ol>
	<li>缓冲液配制 
	注意：缓冲液配方见表1。
	<ol>
		<li>配制5×检测缓冲液和6×十二烷基硫酸钠（SDS），于-20 °C保存。将SDS分装为1 mL每份。</li>
		<li>配制10×SDS凝胶电泳缓冲液和10×TBST，室温保存。</li>
		<li>配制1×转膜缓冲液，于4 °C保存。 
		警告：请查阅本实验方案中所用所有化学品的安全数据表。SDS、DTT和溴酚蓝具有毒性，不得摄入、吸入，或接触皮肤及眼睛。请参阅安全数据表以了解正确的操作方法。操作危险化学品时请使用化学通风橱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HAT反应 
	注意：阿纳卡酸是一种已知的p300抑制剂3，本实验中用作示例，以展示HAT检测如何鉴定新型p300抑制剂。有关步骤1.2.1的示意图，请参见补充实验方案（示意图1）。
	<ol>
		<li>在0.2 mL PCR管中配制以下酶反应体系：2 μL 5×检测缓冲液、1 μL纯化的p300（0.19 μg/μL）、1 μL阿纳卡酸（HATi）或用1×检测缓冲液稀释的DMSO对照，以及2 μL经高压灭菌的ddH2O。室温预孵育10分钟。然后向反应体系中加入3 μL 100 μM乙酰辅酶A和1 μL纯化的H3.1（0.2 μg/μL）。</li>
		<li>将完整反应混合物置于PCR仪中，30 °C孵育1小时。</li>
		<li>按1:10比例向6×SDS上样缓冲液中加入2-巯基乙醇。</li>
		<li>从PCR仪中取出样品，向反应混合物中加入2 µL含2-巯基乙醇的6×SDS缓冲液。 
		警告：2-巯基乙醇有毒，应在化学通风橱内操作。请参阅安全数据表以了解正确的操作方法。</li>
		<li>将样品在95 °C金属浴中加热5分钟，随后置于冰上冷却。样品可于-20 °C或-80 °C保存，或按以下说明进行凝胶电泳和免疫印迹分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶电泳与免疫印迹 
	注意：若不熟悉凝胶电泳和免疫印迹操作，可参考此标准实验流程27，以获取步骤1.3.1–1.3.17的更多细节。其他相关信息可参见此处28,29,30,31,32,33。
	<ol>
		<li>将10 μL样品（来自步骤1.2.5）加入4–20%梯度聚丙烯酰胺凝胶的加样孔中。在其中一个加样孔中加入5 μL蛋白分子量标记物作为参照。使用电泳槽在120 V电压下电泳90分钟。</li>
		<li>使用转膜装置，在100 V电压下将凝胶中的蛋白转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续70分钟。</li>
		<li>从转膜装置中取出膜，放入塑料容器中。加入含5%脱脂奶粉的1×TBST封闭液，室温下轻轻摇动封闭1小时。</li>
		<li>弃去步骤1.3.3中的1×TBST。加入特异性乙酰化抗体（例如H3K18ac或H3K27ac一抗，用含5%脱脂奶粉的1×TBST按1:5,000稀释），4 °C轻轻摇动孵育过夜。</li>
		<li>弃去一抗溶液。用不含脱脂奶粉的1×TBST在室温下轻轻摇动洗涤2次，每次15分钟。</li>
		<li>将二抗用含5%脱脂奶粉的1×TBST按1:20,000稀释，室温轻轻摇动孵育1小时。</li>
		<li>弃去二抗溶液。用不含脱脂奶粉的1×TBST在室温下轻轻摇动洗涤2次，每次15分钟。</li>
		<li>沥干膜上的1×TBST。按1:1比例混合HRP底物过氧化物溶液与HRP底物鲁米诺溶液（各1 mL），取2 mL混合液滴加至膜表面。</li>
		<li>室温孵育5分钟。</li>
		<li>将膜上多余的化学发光底物液体沥至纸巾上，将膜包裹于保鲜膜中，放入X光片暗盒内。</li>
		<li>转移至专用于X光片处理的暗室。将X光片覆盖于膜上，关闭暗盒，曝光30秒。 
		注意：X光片与膜的接触时间需根据实验确定。强信号需短时间曝光（数秒），弱信号可能需要更长时间曝光。</li>
		<li>从暗盒中取出X光片，使用X光片处理器进行显影。具体操作步骤请参阅制造商说明书。</li>
		<li>从保鲜膜中取出膜，用ddH2O在室温下轻轻摇动洗涤5分钟。</li>
		<li>用0.2 M NaOH在室温下轻轻摇动孵育5分钟。</li>
		<li>用ddH2O在室温下轻轻摇动洗涤5分钟。</li>
		<li>加入含5%脱脂奶粉的1×TBST封闭液，室温轻轻摇动封闭1小时。</li>
		<li>加入下一抗体稀释液（例如，若首次使用H3K18ac抗体，则此次检测H3K27ac），4 °C轻轻摇动孵育过夜。重复步骤1.3.4–1.3.17，直至完成所有抗体检测。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. ChHAI 检测
<ol>
	<li>体外药物处理及乙酰化组蛋白分析 
	注：A-485 是一种高效且特征明确的 p300 组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）2,4。由于其在细胞培养中的高效性和特异性，该抑制剂将在后续实验中使用。MS-275（Entinostat）24 是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi），可显著提高组蛋白乙酰化水平，有助于通过标准免疫印迹法更易检测乙酰化探针。有关步骤 2.1 中所用药物稀释方案的示意图，请参见补充方案（示意图 2）。
	<ol>
		<li>在 12 孔板中接种 100,000 个 MCF-7 细胞，并在 1 mL 细胞培养基中培养至 80–90% 汇合度。按以下实验设计标记各孔：第 1 孔：DMSO 对照（参考点）；第 2 孔：A-485（3 μM）；第 3 孔：A-485（10 μM）；第 4 孔：MS-275（3 μM）；第 5 孔：MS-275（3 μM）+ A-485（3 μM）；第 6 孔：MS-275（3 μM）+ A-485（10 μM）。 
		注：培养 MCF-7 细胞时，使用完全 DMEM 培养基，并将细胞置于 37 °C、5% CO2 条件下培养。完全 DMEM 配方见表 1。</li>
		<li>接种后 24 小时，用移液器将 4 mL 完全 DMEM 培养基转移至无菌 15 mL 锥形管中。向 4 mL 培养基中加入 2 μL MS-275（6 mM 溶于 DMSO），终浓度为 3 μM MS-275。</li>
		<li>另取一个无菌 15 mL 锥形管，向 4 mL 培养基中加入 2 μL DMSO。 
		注意：请查阅安全数据表以正确操作 DMSO。某些类型的手套不适合处理 DMSO。</li>
		<li>吸除第 4–6 孔中的细胞培养基，向每孔加入 1 mL 含 3 μM MS-275 的培养基（步骤 2.1.2 配制），未使用的稀释 MS-275 应弃去。</li>
		<li>吸除第 1–3 孔中的细胞培养基，向每孔加入 1 mL 稀释的 DMSO（步骤 2.1.3 配制），未使用的稀释 DMSO 应弃去。</li>
		<li>将细胞放回培养箱，孵育 4 小时，使暴露于 MS-275 的细胞（第 4–6 孔）中乙酰化组蛋白得以积累。 
		注：MS-275 是一种 HDACi，可导致组蛋白超乙酰化24。此 4 小时预孵育步骤是必要的，以确保在加入可降低组蛋白乙酰化水平的 A-485 之前，MS-275 已诱导出超乙酰化状态2,4。</li>
		<li>与 MS-275 孵育 4 小时后，在不同的无菌 1.5 mL 离心管中分别配制以下稀释液：向 1 mL DMEM 培养基中加入 1.0 μL DMSO；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL DMSO 和 0.5 μL A-485（6 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL DMSO 和 0.5 μL A-485（20 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL DMSO 和 0.5 μL MS-275（6 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL A-485（6 mM）和 0.5 μL MS-275（6 mM）；向 1 mL DMEM 培养基中加入 0.5 μL A-485（20 mM）和 0.5 μL MS-275（6 mM）。</li>
		<li>吸除第 1–6 孔中的细胞培养基，向第 1 孔加入 1 mL 稀释液 1，第 2 孔加入 1 mL 稀释液 2，第 3 孔加入 1 mL 稀释液 3，第 4 孔加入 1 mL 稀释液 4，第 5 孔加入 1 mL 稀释液 5，第 6 孔加入 1 mL 稀释液 6。 
		注：一般原则是平衡各实验组之间的 DMSO（溶剂）含量，并确保细胞培养基中 DMSO 含量不超过 0.1%，以避免细胞毒性及增殖变化。</li>
		<li>将细胞放回培养箱，继续培养 20 小时。</li>
		<li>20 小时后，吸除第 1–6 孔中的细胞培养基。</li>
		<li>向第 1–6 孔中各加入 1 mL PBS 洗涤细胞，随后吸除 PBS。</li>
		<li>向第 1–6 孔中各加入 100 μL 1× 被动裂解缓冲液（见表 1）。将细胞培养板（含被动裂解缓冲液中的样品）于 −80 °C 保存过夜，以实现冻融及细胞裂解。 
		注意：配制缓冲液前，请查阅所有化学品的安全数据表。CDTA 可引起严重的眼部损伤和刺激。</li>
		<li>在室温下轻轻振荡 10 分钟以解冻样品，将样品转移至不同的 1.5 mL 离心管中，并立即置于冰上。</li>
		<li>测定各样品的蛋白浓度。蛋白浓度可通过多种成熟的方法测定34。</li>
		<li>根据需要，使用 1× 被动裂解缓冲液调整样品 1–6 的蛋白浓度，使其在相同体积下蛋白浓度一致。</li>
		<li>按 1:10 比例向 6× SDS 上样缓冲液中加入 2-巯基乙醇。</li>
		<li>向样品 1–6 中加入含 2-巯基乙醇的 6× SDS 上样缓冲液，使终浓度为 1× SDS 上样缓冲液。</li>
		<li>将样品在 95 °C 金属浴中加热 5 分钟，随后置于冰上冷却。样品可保存于 -20 °C 或 -80 °C，直至进行步骤 2.1.19。</li>
		<li>向 4–20% 梯度聚丙烯酰胺凝胶的各孔中加入含 30 μg 蛋白的样品体积。按照方案 1 中描述的程序进行免疫印迹分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 染色质免疫共沉淀定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）
注意：以下方案以 p300 抑制剂为例进行说明。
<ol>
	<li>缓冲液制备 
	注意：缓冲液配方见表1。以下ChIP实验流程的通用步骤（如缓冲液配方、洗涤时间及离心时间）已根据市售试剂盒的生产商推荐（参见材料表）以及文献35,36进行了修改和优化。
	<ol>
		<li>配制ChIP稀释缓冲液、细胞核膨胀缓冲液、低盐洗涤缓冲液、高盐洗涤缓冲液、LiCl洗涤缓冲液和TE缓冲液。4 °C保存。</li>
		<li>配制SDS裂解缓冲液、10x甘氨酸缓冲液和ChIP洗脱缓冲液。室温保存。 
		注意：配制缓冲液前，请查阅所有化学品的安全数据表，确保正确操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>药物处理 
	注意：步骤3.2中所用药物稀释方案的示意图见补充实验方案（示意图3）。
	<ol>
		<li>将MCF-7细胞接种于两个15 cm培养皿中，使用12 mL完全DMEM培养基培养至90%融合度。标记培养皿以对应以下实验设计：培养皿1：DMSO对照组（参考点）；培养皿2：A-485（3 μM）。 
		注意：培养MCF-7细胞时，使用完全DMEM培养基，并在37 °C、5% CO2条件下培养。完全DMEM配方见表1。</li>
		<li>在无菌的15 mL锥形管中，加入12 mL DMEM培养基，再加入6 μL DMSO。充分混匀。</li>
		<li>在另一无菌的15 mL锥形管中，加入12 mL DMEM培养基，再加入6 μL A-485（DMSO中6 mM），终浓度为3 µM A-485。充分混匀。</li>
		<li>吸除培养皿1和2中的培养基。</li>
		<li>将12 mL稀释后的DMSO DMEM溶液（步骤3.2.2）加入培养皿1。</li>
		<li>将12 mL含3 µM A-485的DMEM溶液（步骤3.2.3）加入培养皿2。</li>
		<li>将细胞培养皿放回培养箱，孵育24小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞固定
	<ol>
		<li>向完全培养基中加入330 μL（每毫升培养基27.5 µL）37%甲醛，轻轻摇动培养板以混匀。 
		注意：甲醛具有毒性，请查阅安全数据表以了解正确的操作程序。</li>
		<li>室温孵育10分钟。</li>
		<li>向培养板中加入2 mL 10x甘氨酸，轻轻摇动以混匀。</li>
		<li>室温孵育5分钟。</li>
		<li>孵育结束后，将培养皿置于冰上，并解冻一份蛋白酶抑制剂混合物。</li>
		<li>使用步骤3.1中配制的缓冲液，为DMSO和A-485样品分别配制以下溶液：
		<ol>
			<li>含1:1,000稀释蛋白酶抑制剂混合物的PBS溶液2 mL</li>
			<li>含1:1,000稀释蛋白酶抑制剂混合物的细胞核膨胀缓冲液1 mL</li>
			<li>含1:1,000稀释蛋白酶抑制剂混合物的SDS裂解缓冲液0.5 mL</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸除细胞培养皿中的培养基，用15 mL冷PBS洗涤细胞两次。</li>
		<li>向细胞培养皿中加入2 mL含蛋白酶抑制剂混合物的PBS溶液（步骤3.3.6.1），用细胞刮刀将细胞刮下并悬浮于溶液中。</li>
		<li>将细胞悬液转移至微量离心管中。如有必要，用额外PBS收集残留细胞。</li>
		<li>在4 °C下以800 x g离心5分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>吸除上清液，向沉淀中加入1 mL含蛋白酶抑制剂混合物的细胞核膨胀缓冲液（步骤3.3.6.2），重悬沉淀并在冰上孵育10分钟。</li>
		<li>在4 °C下以2,700 x g离心5分钟，沉淀细胞核。</li>
		<li>吸除上清液，向沉淀中加入0.5 mL含蛋白酶抑制剂混合物的SDS裂解缓冲液（步骤3.3.6.3），重悬沉淀并在冰上孵育10分钟。</li>
		<li>将染色质样品保存在-80 °C，直至进行步骤3.4.1，或立即进入步骤3.4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DNA超声破碎
	<ol>
		<li>使用移液器将DMSO样品的染色质（步骤3.3.14）130 µL分别转移至两个DNA超声破碎管中（每管130 µL）。</li>
		<li>使用移液器将A-485样品的染色质（步骤3.3.14）130 µL分别转移至两个DNA超声破碎管中（每管130 µL）。</li>
		<li>使用以下超声参数将DNA破碎为约150–200 bp的片段：峰值入射功率（W）175，占空比10%，每脉冲200个循环，处理时间430秒。 
		注意：不同型号的超声仪参数可能不同，需根据具体仪器调整参数，以获得适用于不同细胞系的合适片段大小。</li>
		<li>超声处理后将样品置于冰上。</li>
		<li>使用移液器将超声处理后的染色质转移至1.5 mL离心管中，在4 °C下以10,000 x g离心10分钟，沉淀碎片。</li>
		<li>将上清液（含超声破碎后的染色质）转移至新管中，弃去沉淀物。超声破碎后的染色质可保存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>染色质免疫沉淀（ChIP） 
	注意：步骤3.5中免疫沉淀组的示意图见补充实验方案（示意图3）。
	<ol>
		<li>测定步骤3.4.6中DMSO和A-485样品超声破碎后染色质的蛋白含量。可使用成熟的实验方法进行测定34。 
		注意：为简化操作，本实验方案假设蛋白含量相等，每份样品使用100 µL超声破碎染色质。否则，需在相同体积下平衡各样品的蛋白含量。</li>
		<li>将DMSO样品的超声破碎染色质100 µL分别加入两个1.5 mL离心管中（每管100 µL）。每管加入400 µL ChIP稀释缓冲液（含1:1,000稀释的蛋白酶抑制剂混合物），使总体积达到500 µL。从其中一管中取出5 µL溶液，于-20 °C保存，作为DMSO输入样品（Input）。</li>
		<li>将A-485样品的超声破碎染色质100 µL分别加入两个1.5 mL离心管中（每管100 µL）。每管加入400 µL ChIP稀释缓冲液（含1:1,000稀释的蛋白酶抑制剂混合物），使总体积达到500 µL。从其中一管中取出5 µL溶液，于-20 °C保存，作为A-485输入样品（Input）。</li>
		<li>使用移液器向DMSO和A-485样品对应的离心管中加入免疫沉淀（IP）抗体（如非特异性IgG对照抗体或H3K27ac特异性抗体）：IP #1 DMSO染色质加IgG抗体（5–10 µg）；IP #2 DMSO染色质加H3K27ac抗体（5–10 µg）；IP #3 A-485染色质加IgG抗体（5–10 µg）；IP #4 A-485染色质加H3K27ac抗体（5–10 µg）。</li>
		<li>向每管中加入20 µL蛋白A磁珠，确保磁珠充分重悬。</li>
		<li>在4 °C下旋转孵育过夜。</li>
		<li>使用磁力架沉淀蛋白A磁珠，吸除上清液。注意不要扰动磁珠。</li>
		<li>用500 µL至1 mL低盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，使用磁力架沉淀磁珠，吸除上清液。</li>
		<li>用500 µL至1 mL高盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，使用磁力架沉淀磁珠，吸除上清液。</li>
		<li>用500 µL至1 mL LiCl洗涤缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，使用磁力架沉淀磁珠，吸除上清液。</li>
		<li>用500 µL至1 mL TE缓冲液洗涤磁珠，在4 °C下旋转5分钟。短暂离心后，将磁珠保留在TE缓冲液中，直至进行步骤3.5.14。</li>
		<li>从冰箱中取出输入样品（步骤3.5.2和3.5.3），置于冰上。</li>
		<li>解冻一份蛋白酶K。</li>
		<li>使用磁力架沉淀磁珠，吸除磁珠中的TE缓冲液（来自步骤3.5.11）。</li>
		<li>向每个样品（包括输入样品）中加入100 µL ChIP洗脱缓冲液和1 µL蛋白酶K。使用PCR仪在62 °C下振荡孵育2小时。</li>
		<li>2小时后，使用PCR仪将样品加热至95 °C，持续10分钟。</li>
		<li>将样品冷却至室温。</li>
		<li>使用磁力架沉淀磁珠，将上清液（含目标DNA）转移至新的1.5 mL离心管中。</li>
		<li>使用标准PCR纯化试剂盒纯化DNA。</li>
		<li>纯化后的DNA可保存于-20 °C，并作为模板用于标准qPCR实验。请遵循试剂盒说明书进行qPCR操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ChIP-qPCR数据分析 
	注意：分析ChIP-qPCR结果的两种常用方法为相对于IgG抗体的富集倍数法和1%输入法。某商业来源提供了一个优秀的分析模板，可用于快速计算每种IP抗体/目标的富集倍数37。
	<ol>
		<li>为计算富集倍数和%输入值，将qPCR实验获得的各抗体（非特异性IgG、IP H3K27ac抗体和1%输入）的ΔCt值复制并粘贴至分析模板的相应区域，富集倍数和%输入值将自动计算生成。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突或需要披露的事项。

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可乙酰化组蛋白尾部和转录因子上的多个赖氨酸残基，从而调控基因转录2,3。过去二十年的研究表明，KATs（如CBP/p300、PCAF和GCN5）可与致癌转录因子相互作用，并在多种实体瘤中促进肿瘤生长4,5,9,15,16,17,18。由于KATs在促进肿瘤生长中的作用日益凸显，它们正被作为癌症治疗中的新型靶点进行研究。在将新型KAT抑制剂（KATi）推进临床应用之前，必须对其效力、选择性和安全性进行仔细而严格的测试。最近的研究证据表明...

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可催化组蛋白和非组蛋白上赖氨酸残基的乙酰化修饰1,2,3,4。近期研究表明，KATs 及其乙酰转移酶功能可促进实体瘤的生长4,5,6,7,8,9。例如，CREB结合蛋白（CBP）/p300 是两个同源的 KATs，可调控癌症中的多种信号通路2,3。CBP/p300 具有明确的组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性，可催化组蛋白H3第27位赖氨酸的乙酰化（H3K27ac）2,4,5,10,11，该修饰是活性增强子、启动子区域以及活跃基因转录的重要标志12,13,14。CBP/p300 通过乙酰化组蛋白及其他转录因子，激活癌基因的转录，从而作为实体瘤中促生长信号通路的关键共激活因子4,9,15,16,17,18。由于其在肿瘤进展中的作用，CBP/p300 及其他 KATs 正被研究用于开发可阻断其致癌功能的新型抑制剂4,5,6,7,8,9,18,19,20。A-485 和 GNE-049 是成功开发高效且特异性靶向 CBP/p300 抑制剂的两个范例4,9。目前，针对 CBP/p300 及其他 KATs 的更多抑制剂正处于研究阶段。
先前所描述的KAT抑制剂（KATi）的质量正受到质疑，许多抑制剂表现出脱靶效应且表征不充分21。因此，对新型药物候选分子进行严格表征和验证，对于开发高质量的化学探针至关重要。本文概述了三项构成筛选与严格验证新型KATi效力及特异性的流程方案，重点在于抑制KAT的组蛋白乙酰转移酶功能（HATi）。以CBP/p300及其抑制剂为例进行说明，但这些方案可适用于其他具有HAT功能的KAT7。
第一种方案是一种体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性检测方法，该方法在受控的试管反应中使用纯化的重组p300蛋白和组蛋白。该检测操作简便、成本低廉，可用于低通量条件下的化合物筛选，且无需使用放射性材料。在此方案中，重组p300在短暂孵育期间催化组蛋白尾部赖氨酸残基的乙酰化，随后通过标准的免疫印迹技术检测组蛋白乙酰化水平。该酶促反应可在存在或不存在CBP/p300抑制剂的条件下进行，以筛选能够降低组蛋白乙酰化的化合物。此外，可通过检测待测化合物对其他纯化的赖氨酸乙酰转移酶（如PCAF）的活性影响，利用HAT检测验证新化合物是否对CBP/p300具有选择性。由于该方法操作简单、成本低，并可评估抑制剂的效价和选择性，因此是研究新型抑制剂的理想起点。事实上，该方案在文献中常被用作体外筛选手段5,10。然而，在HAT检测中鉴定出的抑制剂并不总是在细胞培养体系中有效，因为试管反应系统远比活细胞体系简单。因此，有必要在细胞培养实验中进一步表征这些抑制剂的生物学活性22,23。
流程中的第二个方案是染色质高乙酰化抑制（Chromatin Hyperacetylation Inhibition, ChHAI）检测。该基于细胞的检测利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）作为工具，在与HATi共孵育之前诱导染色质中组蛋白的高乙酰化24。在细胞培养中，基础组蛋白乙酰化水平可能较低，若不添加HDACi以提高乙酰化水平，则难以通过免疫印迹进行检测。ChHAI检测的目的是鉴定能够减弱由HDAC抑制所引起的组蛋白乙酰化增加的新型HATi。该检测的优点包括成本低、操作相对简便，以及使用培养细胞，相比试管中的HAT检测具有更高的生理相关性。与HAT检测类似，本方案也采用标准的免疫印迹法进行数据采集。
HAT 和 ChHAI 检测可提供有关新型化合物抑制整体组蛋白乙酰化的效力数据，但无法揭示这些化合物对特定基因组区域修饰的影响方式。因此，最后一个实验方案——染色质免疫沉淀-定量聚合酶链式反应（ChIP-qPCR）是一种细胞培养实验，用于研究基因组特定区域的 DNA-蛋白质相互作用。在 ChIP 实验中，首先对染色质进行交联以保留 DNA-蛋白质相互作用。随后从细胞中提取染色质，对 DNA-蛋白质复合物进行针对目标蛋白的选择性免疫沉淀（例如，使用特异性识别 H3K27ac 的抗体）。然后纯化 DNA，并通过 qPCR 进行分析。例如，ChIP-qPCR 可用于确定一种新型 HAT 抑制剂是否下调特定癌基因（如 Cyclin D125）位点的组蛋白乙酰化水平。尽管 ChIP-qPCR 是该领域常用的实验技术，但其优化过程可能较为困难4,10,26。本实验方案提供了在执行 ChIP-qPCR 过程中避免潜在问题的建议，并包含了应对数据进行的质量控制检查。
当联合使用时，这三种实验方案可对新型组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）进行严格的表征与验证。此外，这些方法具有多种优势，因其操作简便、成本相对较低，并可提供有关全基因组及区域特异性组蛋白乙酰化的数据。

<table><tbody><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>适用于所有方法</td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Sarstedt AG &amp; Co.</td><td>83.3902</td><td>用于 MCF-7 细胞的细胞培养</td></tr><tr><td>10 µl 吸头</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-454</td><td>适用于所有方法</td></tr><tr><td>1000 µl 吸头</td><td>Corning</td><td>4846</td><td>适用于所有方法</td></tr><tr><td>10X 甘氨酸缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>10X 电泳缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 1 和 2。配方见表 1。</td></tr><tr><td>10X TBST</td><td></td><td></td><td>用于方法 1 和 2。配方见表 1。</td></tr><tr><td>12 孔板</td><td>Corning</td><td>3513</td><td>用于方法 2</td></tr><tr><td>15 cm 培养皿</td><td>Sarstedt AG &amp; Co.</td><td>83.3903</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>15 ml 圆锥形离心管</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-200249</td><td>用于方法 2 和 3</td></tr><tr><td>含 5% 脱脂奶粉和 0.02% 叠氮化钠的 1X TBST</td><td></td><td></td><td>用于方法 1 和 2。可用于稀释需多次使用的初级抗体，允许初级抗体稀释液短期保存。不可用于稀释二抗。注意：叠氮化钠有毒。</td></tr><tr><td>含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST</td><td></td><td></td><td>用于方法 1 和 2。用于封闭 PVDF 膜及抗体稀释。配方见表 1。</td></tr><tr><td>200 µl 吸头</td><td>Corning</td><td>4844</td><td>适用于所有方法</td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>用于 SDS 样品缓冲液的配制</td></tr><tr><td>4-20% 聚丙烯酰胺凝胶</td><td>Thermo Fisher: Invitrogen</td><td>XP04205BOX</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>5X 检测缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 1。配方见表 1。</td></tr><tr><td>5X 被动裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 2。配方见表 1。</td></tr><tr><td>6X 十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td></td><td></td><td>用于方法 1 和 2。配方见表 1。</td></tr><tr><td>A-485</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-107455</td><td>CBP/p300 抑制剂，用于方法 2 和 3。以 DMSO 溶解。</td></tr><tr><td>乙酰化-CBP(K1535)/p300(K1499) 抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4771</td><td>用于方法 1</td></tr><tr><td>乙酰辅酶 A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2056</td><td>用于方法 1</td></tr><tr><td>乙酰化组蛋白 H3 (Lys 27) 抗体 (H3K27ac)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 8173</td><td>用于免疫印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP) 的 H3K27ac 抗体</td></tr><tr><td>乙酰化组蛋白 H3 (Lys18) 抗体 (H3K18ac)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>CST 9675</td><td>用于免疫印迹和染色质免疫沉淀 (ChIP) 的 H3K18ac 抗体</td></tr><tr><td>α-微管蛋白抗体</td><td>Millipore Sigma</td><td>T5168</td><td>用于方法 2。稀释比例 1:20,000</td></tr><tr><td>阿那卡酸</td><td>Cayman Chemical</td><td>13144</td><td>用于方法 1</td></tr><tr><td>抗小鼠 IgG HRP 偶联二抗</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076</td><td>用于方法 1 和 2。稀释比例 1:10,000</td></tr><tr><td>抗兔 IgG 二抗</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-152</td><td>用于方法 1 和 2。稀释比例 1:10,000 至 1:20,000</td></tr><tr><td>放射自显影胶片</td><td>MIDSCI</td><td>BX810</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>Belly Dancer 旋转平台</td><td>Stovall Life Science Incorporated</td><td>无货号</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>新生牛血清 (BCS)</td><td>HyClone</td><td>SH30072.03</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>用于 SDS 样品缓冲液配制</td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Spectrum Chemical</td><td>125572-95-4</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3010</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>ChIP 稀释缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>ChIP 洗脱缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>MCF-7 细胞完全 DMEM 培养基</td><td></td><td></td><td>用于方法 2 和 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>Covaris 130 &amp;micro;l 微量管</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>用于方法 3 中与 Covaris S220 配合的超声破碎管</td></tr><tr><td>Covaris S220 聚焦式超声破碎仪</td><td>Covaris</td><td>S220</td><td>用于方法 3 的 DNA 超声破碎</td></tr><tr><td>二甲基亚砜 (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>41639</td><td>用于药物稀释和溶剂对照处理</td></tr><tr><td>DL-二硫苏糖醇 (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td>用于 SDS 样品缓冲液配制</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-1</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>示例转膜槽和转膜装置</td><td>Bio-rad</td><td>1704070</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>EZ-Magna ChIP A/G 染色质免疫沉淀试剂盒</td><td>Millipore Sigma</td><td>17-10086</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>FK228 (Romidepsin)</td><td>Cayman Chemical</td><td>128517-07-7</td><td>用于方法 2 的 HDAC 抑制剂</td></tr><tr><td>甲醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>用于细胞固定</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>高盐洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>IGEPAL (NP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3021</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>Immobilon 化学发光 HRP 底物</td><td>Millipore Sigma</td><td>WBKLS0500</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>LiCl 洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>低盐洗涤缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>磁力分离器</td><td>Promega</td><td>Z5341</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>小型凝胶电泳槽</td><td>Invitrogen</td><td>A25977</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>MS-275 (Entinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>209783-80-2</td><td>用于方法 2 的 HDAC 抑制剂。以 DMSO 溶解。</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td>用于方法 1 和 2 的缓冲液配制</td></tr><tr><td>正常兔 IgG</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>P120-101</td><td>用于方法 3 的对照兔抗体</td></tr><tr><td>细胞核膨胀缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液 (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>用于方法 2 和 3</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80635</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>脱脂奶粉</td><td>Nestle Carnation</td><td></td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>用于 Western 印迹转膜的 Power Pac 200</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>用于 SDS 凝胶电泳的 Power Pac 3000</td><td>Bio-rad</td><td></td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>预染蛋白 Marker</td><td>Thermo Fisher</td><td>26616</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PI8340</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>蛋白 A 磁珠</td><td>New England BioLabs</td><td>S1425S</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>蛋白酶 K</td><td>New England BioLabs</td><td>P8107S</td><td>用于方法 3</td></tr><tr><td>PTC-100 可编程热循环仪</td><td>MJ Research Inc.</td><td>PTC-100</td><td>用于方法 1</td></tr><tr><td>PVDF 转膜膜</td><td>Millipore Sigma</td><td>IEVH00005</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>重组 H3.1</td><td>New England BioLabs</td><td>M2503S</td><td>用于方法 1</td></tr><tr><td>重组 p300</td><td>ENZO Life Sciences</td><td>BML-SE451-0100</td><td>用于方法 1</td></tr><tr><td>SAHA (Vorinostat)</td><td>Cayman Chemical</td><td>149647-78-9</td><td>用于方法 2 的 HDAC 抑制剂</td></tr><tr><td>SDS 裂解缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>26628-22-8</td><td>用于方法 1 和 2。注意：叠氮化钠有毒。请参阅 SDS 以获取正确操作方法。</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71725</td><td>用于 SDS 样品缓冲液配制</td></tr><tr><td>标准加热块</td><td>VWR Scientific Products</td><td>MPN: 949030</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>适用于所有方法</td></tr><tr><td>TE 缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 3。配方见表 1。</td></tr><tr><td>转膜缓冲液</td><td></td><td></td><td>用于方法 1 和 2。配方见表 1。</td></tr><tr><td>曲古抑菌素 A</td><td>Cayman Chemical</td><td>58880-19-6</td><td>用于方法 2 的 HDAC 抑制剂</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>用于缓冲液配制</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td>用于方法 1 和 2 的缓冲液配制</td></tr><tr><td>X 光胶片处理器</td><td>Konica Minolta Medical &amp; Graphic, Inc.</td><td>SRX-101A</td><td>用于方法 1 和 2</td></tr></tbody></table>

验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的实验方法

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）可催化组蛋白及其他蛋白质上赖氨酸残基的乙酰化，从而调控染色质动态和基因表达。由于CBP/p300等KATs在多种癌症发生中具有关键作用，目前正被广泛研究作为潜在的治疗靶点。针对KATs组蛋白乙酰转移酶（HAT）功能的新型小分子抑制剂的开发具有挑战性，需要可靠的检测方法来验证潜在抑制剂的特异性和效力。
本文概述了一套包含三种方法的流程，可用于对新型组蛋白乙酰转移酶抑制剂（HATi）进行严格的体外验证。这些方法包括试管组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性检测、染色质高乙酰化抑制（ChHAI）检测以及染色质免疫沉淀-定量PCR（ChIP-qPCR）检测。在HAT活性检测中，将重组的HAT酶与组蛋白在试管反应体系中共同孵育，使组蛋白尾部特定的赖氨酸残基发生乙酰化修饰。该反应可被HATi所阻断，通过免疫印迹法可检测特定位点组蛋白乙酰化水平的相对变化。在HAT活性检测中鉴定出的抑制剂需进一步在细胞环境中加以验证。
ChHAI 检测利用免疫印迹法筛选新型组蛋白乙酰化转移酶抑制剂（HATi），这些抑制剂可减弱组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）所诱导的强烈组蛋白高乙酰化现象。使用 HDACi 具有帮助作用，因为通过免疫印迹法检测组蛋白乙酰化的基础水平通常较为困难。
HAT 和 ChHAI 检测可测量组蛋白乙酰化的整体变化，但无法提供特定基因组区域乙酰化状态的信息。因此，采用 ChIP-qPCR 来研究 HATi 对基因调控元件处组蛋白乙酰化水平的影响。该方法通过特异性免疫沉淀组蛋白-DNA 复合物，并利用 qPCR 分析纯化的 DNA 实现。这三种检测方法结合使用，可对新型 HATi 的特异性、效力及作用机制进行严谨验证。

体外组蛋白乙酰转移酶（HAT）检测可用于筛选能够抑制p300 HAT活性对组蛋白底物作用的化合物。图1A展示了HAT检测的实验示意图。本实验中使用了一种已知的HAT抑制剂——阿纳卡酸（anacardic acid）3,38，浓度范围为12.5–100 µM。在100 µM浓度下，阿纳卡酸相较于对照组DMSO处理，显著下调了组蛋白H3第9位和第18位赖氨酸（Histone 3, Lysines 9 and 18）的p300催化乙酰化水平（图1B，第5泳道与第1泳道对比）。本实验采用浓度梯度设置，因为较低药物剂量可能对p300 HAT活性抑制作用不明显（图1B，第2–4泳道与第1泳道对比）。第6泳道反应体系中未添加乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），作为p300催化活性以及重组H3.1组蛋白基础乙酰化水平的阴性对照（<strong class="x...

组蛋白乙酰转移酶（HATs，也称为赖氨酸乙酰转移酶）抑制剂（如CBP/p300）是治疗癌症的潜在药物。然而，目前亟需严谨的方法来验证这些抑制剂的有效性。三种体外验证方法包括：使用重组乙酰转移酶进行HAT活性检测、通过免疫印迹法检测细胞培养物中的组蛋白乙酰化水平，以及染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）。

赖氨酸乙酰转移酶（KATs）催化组蛋白及其他蛋白质上赖氨酸残基的乙酰化，以调控染色质动态和基因表达。

这些实验方案具有重要意义，因为它们为验证新型组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂的效价和选择性提供了详细步骤，而HAT抑制剂是重要的研究工具和潜在的治疗药物。本视频展示的技术易于操作，可提供HAT抑制剂对全基因组及区域组蛋白乙酰化影响的相关信息，有助于理解基因表达的表观遗传调控机制。关注细节至关重要。必须严格遵循实验方案的每一步操作。根据手稿说明，在0.2毫升PCR管中配制10微升体积的酶促反应体系。然后将完整的反应混合物置于PCR扩增仪中，在30摄氏度下孵育1小时。同时，按1:10的比例向6X SDS上样缓冲液中加入β-巯基乙醇。从PCR扩增仪中取出样品，并向每份反应混合物中加入2微升已配制好的SDS上样缓冲液。将样品在加热块上 95 摄氏度加热 5 分钟，然后置于冰上冷却。将样品储存在 -20 或 -80 摄氏度，或直接进行凝胶电泳和免疫印迹。在 12 孔板的每个孔中加入 1 毫升细胞培养基，接种 100,000 个 MCF-7 细胞，并让细胞生长至 80% 至 90% 汇合度。当细胞达到所需的汇合度时，吸出第四、第五和第六孔中的细胞培养基，并向每孔加入一毫升含三微摩尔 MS275 的培养基。随后吸出第一、第二和第三孔中的细胞培养基，并向每孔加入一毫升稀释的 DMSO。将细胞放回培养箱中孵育四小时，以使暴露于 MS275 的细胞内乙酰化组蛋白得以积累。在细胞孵育的同时，根据论文中的指示，用DMSO配制A-485的系列稀释液。孵育结束后，吸去孔中的培养基，加入配制好的稀释液。将细胞放回培养箱继续培养20小时，然后吸去各孔中的细胞培养基，并用1 mL PBS洗涤细胞。吸去 PBS，加入 100 微升裂解缓冲液。将培养板于 -80 摄氏度保存过夜。用移液器将经 DMSO 处理的细胞中 100 微升超声破碎后的染色质加入两个 1.5 毫升离心管中，然后向每管加入 400 微升 ChIP 稀释缓冲液，使总体积达到 500 微升。从其中一个试管中取出五微升溶液，于-20摄氏度保存，作为DMSO对照组。另准备两支试管，分别装入经A-485处理且以相同方式超声处理的细胞染色质。使用移液器将IgG和H3K27乙酰化抗体分别加入DMSO和A-485样品中。然后向每个试管中加入20 µL蛋白A磁珠，确保磁珠充分重悬。在4°C下旋转孵育样品过夜。使用磁力分离器沉淀蛋白A磁珠，并移除上清液，注意不要扰动磁珠沉淀。用 500 微升至 1 毫升低盐洗涤缓冲液洗涤磁珠，并在 4 摄氏度下旋转孵育 5 分钟。短暂离心，使用磁力架收集磁珠并弃去上清液。随后依次用高盐洗涤缓冲液、氯化锂洗涤缓冲液和 TE 缓冲液重复洗涤步骤。用 TE 缓冲液洗涤后，从冷冻箱中取出输入样品并置于冰上。解冻一份蛋白酶 K，然后使用磁力架收集磁珠，并移除磁珠上的 TE 缓冲液。向每个样品（包括输入样品）中加入 100 微升 ChIP 洗脱缓冲液和 1 微升蛋白酶 K，并在热循环仪中于 62 摄氏度振荡孵育两小时。孵育结束后，将样品在95摄氏度加热10分钟，然后冷却至室温。使用磁力架沉淀磁珠，并将含有DNA的上清液转移至新的1.5毫升离心管中。使用标准PCR纯化试剂盒纯化DNA，并进行qPCR检测。采用体外组蛋白乙酰转移酶活性检测方法，研究漆树酸对p300组蛋白乙酰转移酶活性在组蛋白底物上的影响。实验测试了不同浓度梯度，并且在阴性对照反应中未添加乙酰辅酶A。使用ImageJ对免疫印迹结果进行定量分析，结果显示，与DMSO对照组相比，在100 µM漆树酸处理下，乙酰化H3K18和乙酰化H3K9水平明显降低。在染色质高乙酰化抑制检测中，使用HDAC抑制剂MS275处理MCF-7细胞显著上调了组蛋白3多个赖氨酸位点的乙酰化水平。乙酰化H3K18和乙酰化H3K27的基础水平较低，表明在ChHAI检测中加入HDAC抑制剂具有优势。在经MS275预处理的细胞中加入A-485可减弱H3K18和H3K27位点组蛋白乙酰化的升高，但对H3K9位点无此作用。免疫印迹结果也使用 ImageJ 进行了定量分析。染色质免疫沉淀定量 PCR（ChIP qPCR）用于研究组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂在调控原癌基因表达的基因调控元件上的作用。在 DMSO 处理样本中，IgG 对照抗体沉淀的 DNA 在细胞周期蛋白 D1（cyclin D1）启动子区域的 qPCR 反应中产生的 Ct 值高于乙酰化 H3K27 抗体，表明在该启动子区域，非特异性 IgG 对照抗体沉淀的 DNA-组蛋白复合物少于特异性识别乙酰化 H3K27 的抗体。与DMSO对照组相比，A-485降低了细胞周期蛋白D1启动子区域H3K27乙酰化的富集水平。值得注意的是，已知A-485在细胞培养中可显著降低H3K27乙酰化水平。在实施本方案时，需注意体外HAT和ChHAI实验的预孵育步骤至关重要，切勿遗漏。还需要注意在进行染色质免疫沉淀（ChIP）时保存输入样品，并避免磁珠的丢失。完成这些步骤后，可进一步采用染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）方法，以获得全基因组范围内调控元件上组蛋白乙酰化状态的全局信息。这些实验方案有助于科研人员严谨地验证新型组蛋白乙酰转移酶（HAT）抑制剂，避免在文献中发表低质量的化学探针。经过验证的HAT抑制剂可进一步开发为潜在的治疗药物。

assays-for-validating-histone-acetyltransferase-inhibitors

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

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验证组蛋白乙酰转移酶抑制剂的实验方法

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