微量和外显子的纸基预集中和分离

在此协议中，我们描述了一种简单的方法来制造一种称为XO Pad的纸基设备，该器件设计用于分离细胞外囊泡进行有效浓缩。XO Pad 是一种简单的设备，无需使用任何化学品或工作机器即可预浓缩和分离细胞外囊泡，同时显示比传统方法更高的回收率。首先定义要使用打印机软件打印的区域。

设计应有12个蜡图案层，其中圆形样品区域的直径逐渐从5毫米缩小到2毫米。然后，在纤维素纸两侧的指定区域上打印疏水蜡。将蜡印纸在实验室烤箱中放置 80 秒，温度为 120 摄氏度，然后用切割机切割蜡印纸，以制作单独的 XO Pad 设备。

将五升和两微升的渗透选择性膜分别滴到最左侧和最右边最层的样品区域。将用渗透选择性膜编码的层在70摄氏度的热板上放置30分钟，以蒸发溶剂。然后用压力敏感胶带密封涂层层最外层，用压力敏感胶带密封缓冲液，留下一个小孔。

沿白线来回折叠 XO Pad 设备，以收敛连接所有采样区域。在收敛样品区域中移液 15 微升微升微量和外显体样品，等待几秒钟以确保完全润湿。将两个丙烯酸腔室放在 XO 垫的两端，用小粘结夹将其牢固地夹住以防止展开。

在腔室中填充 110 微升 0.1X PBS，并插入两个银电极。然后使用电流电压源测量系统对电极施加 30 伏，20 分钟。要分离富集的微囊和外体，请将折叠的 XO Pad 从丙烯酸室中分离，并展开设备，将富集的颗粒与其他层分离。

冲出第8层和第9层的样品区域，其中微囊和外显体被丰富用于下游分析。对荧光标记的微囊和外显子进行了延时迁移测定，以优化操作时间，最大限度地回收富集颗粒。所有样品区域的荧光强度都用 ImageJ 软件进行量化。

在富集过程之前，微囊和外显子分散在所有样品区，强度逐渐降低。经过10分钟的处理，颗粒以电基方式迁移，第七层出现即时预浓缩插头。当时间达到20分钟时，微囊和外体强烈聚焦在8层和9层，并基于荧光强度丰富了5倍。

用SEM对第8层富集微囊和外显体的完整性进行了调查，在富集过程后观察到更多的非损伤颗粒。还分析了富集微囊和外显子的大小分布。

随后，对6层、8层和10层样品区富集微囊和外显体的实际浓度进行了分析。在第8层，微囊和外体预浓缩5.58，但在其他层中未观察到明显的预浓度。为确保本程序的可重复性，在设备验证和设备运行时间期间精确遵循烤箱孵育时间和温度协议，因为这些是优化的条件。

XO Pad 还可用于使用碳酸盐缓冲液将细胞外囊泡从富含蛋白质的样品（如血清或血浆）分离和分离。该协议可以提供高效、简单的制备工具，具有临床研究所需的预集中和隔离功能，如诊断、药物输送、免疫治疗和其他治疗。