Name: 成像核内作用棒在活热应力 果蝇 胚胎 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 学习利用显微注射技术将罗丹明标记的球状肌动蛋白注入黑腹果蝇胚胎，研究热应激条件下肌动蛋白棒组装过程。该方法为细胞应激反应和发育生物学研究提供了可靠的实验方案。

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作者们衷心感谢刘柳郑和增辉薛在Sokac实验室中对该技术的早期探索工作，同时也感谢Hasan Seede在数据分析方面的协助。本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：R01 GM115111）。

1. 准备胚胎收集杯和苹果汁琼脂平板
<ol>
	<li>在注射实验前五天，构建28或准备至少两个小型&#160;胚胎收集杯。制备新鲜的60 mm苹果汁琼脂平板，用于与小型收集杯配合使用28。将平板置于塑料盒中，并用湿润的纸巾覆盖，于4 °C保存。 
	注意：使用如步骤1.3所述数量的果蝇填充的小型胚胎收集杯，可为每次实验提供足够的胚胎数量，同时确保胚胎处理和注射能在足够短的时间内完成，以便对早期发育阶段进行成像。</li>
	<li>将苹果汁平板预热至18 °C，并在平板中央添加少量酵母糊。酵母糊由活性酵母与蒸馏水简单混合而成。</li>
	<li>为促进最大程度的产卵，应在实验前两天设置装有果蝇的收集杯。每个收集杯中加入至少100只雌蝇和50只雄蝇，并加盖一个预先准备好的苹果汁平板（图1，步骤1）。在注射实验前的每一天，至少更换两次苹果汁平板，分别在早晨和傍晚各一次。 
	注意：当胚胎收集杯在18 °C环境下保持12小时光照/12小时黑暗的循环条件时，可获得最佳的注射和成像效果。</li>
</ol>
2. 为显微注射制备G-actinRed 的工作液
注意：此步骤仅制备 2 μL 浓度为 5 mg/mL 的 G-actinRed 工作液，因此如果操作者对显微注射技术尚不熟练，建议跳过此步骤直接进入步骤 3，先使用中性 pH 缓冲液进行显微注射练习，以节省珍贵的工作液。供应商提供的 10 μg G-actinRed 原装品可置于原包装中，放入带有约 500 g 干燥剂的 16 盎司螺口瓶内，于 4 °C 保存，最长可保存 6 个月。
<ol>
	<li>提前配制G缓冲液储存液：5 mM Tris-HCl，0.2 mM CaCl₂，1 mM MgCl₂，50 mM 咪唑，5 mM 巯基乙醇，pH 7.0。2，pH 8.0。过滤后室温保存。</li>
	<li>在注射当天，于冰上使用2.1步骤中的G缓冲液原液，在新的带盖离心管中配制1 mL G缓冲液工作液，其中添加以下成分至指定终浓度：1 mM 二硫苏糖醇（DTT）和0.2 mM ATP，pH 8.0。 
	注意：G缓冲液工作溶液的1 mL体积超出了实验所需用量，但为简化配制过程而设定。实验后多余的溶液可弃去，或用户可根据需要自行调整用量。
	<ol>
		<li>保持10 μg G-actin红色 将储存的样品置于冰上，首先向G-actin粉红色液滴顶部加入1 μL过滤后的蒸馏水红色 管内</li>
		<li>接下来，加入1 μL来自步骤2.2的冷的、 freshly prepared G缓冲液工作溶液。用移液器将溶液上下吹打约20次，充分混匀，移液器体积设为1 μL。G-actin红色 储备液的最终稀释浓度为 5 mg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育制备好的G-actin红色 在冰上静置30分钟。</li>
	<li>离心制备的G-actin红色 在16,000时 x g 在4 °C下以微量离心机离心20分钟，以去除任何沉淀物。</li>
	<li>小心吸取1.5 μL上清液，加入预冷的干净带盖微量离心管中，置于冰上，避免触碰深粉红色沉淀。</li>
	<li>储存制备好的G-actin红色 冰上保存上清液，最长可保存6小时，直至准备将其装入微针。 
	注意：微针可提前使用微玻璃毛细管拉制仪从毛细管中拉制而成，随后置于盛有100 × 20 mm培养皿中的一条造型粘土上，于室温下保存。微针拉制的建议参数详见《移液管烹饪书》（Pipette Cookbook）。29.</li>
</ol>
3. 收集胚胎并制备显微注射
<ol>
	<li>让果蝇在18 °C条件下，在含酵母糊的苹果汁培养基上产卵30分钟。</li>
	<li>果蝇产卵时，提前将苹果汁琼脂平板预热 不含酵母膏 将苹果汁琼脂恢复至室温，用剃刀切下一小块4 cm × 1 cm的矩形楔形块，置于25 mm × 75 mm的玻璃载片上。
	<ol>
		<li>收集30分钟的培养板，通过将新鲜的漂白剂（用蒸馏水按1:1稀释）倒入培养板中，并轻轻摇晃培养板1分钟，对胚胎进行去壳处理，具体步骤如所述28 (图1，步骤2). 
		注意：不同品牌的漂白剂浓度各异。此处使用的漂白剂原液为6%次氯酸钠，需稀释至终浓度为3%次氯酸钠。其他浓度略低的漂白剂品牌同样适用。</li>
		<li>将漂白液和去壳胚胎倒入收集篮（70 μm 细胞滤筛）中，并用喷瓶中的蒸馏水冲洗培养板两次，将冲洗液一并加入收集篮中。</li>
		<li>用蒸馏水彻底冲洗去壳的胚胎，直至收集篮中无可见的酵母团块，且用纸巾轻压收集篮时不再留下过量次氯酸钠产生的粉红色痕迹。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用毛刷（刷毛用蒸馏水润湿）将脱膜并清洗后的胚胎从收集篮转移至载玻片上预先准备好的苹果汁琼脂楔块上。</li>
	<li>使用精细尖头镊子或解剖针，将十个胚胎沿矩形琼脂楔的长轴方向排列成一条直线（图1第3步）。将胚胎按头尾相接的方式排列，使其前端朝向右侧，背侧朝向研究人员（图1，步骤3，放大).</li>
	<li>用剃刀切下P200枪头末端0.5 cm，然后浸入“胚胎胶”（见下文描述）中28）。将一区域均匀涂覆，宽度为5 mm（图1，步骤4沿24 mm × 50 mm矩形盖玻片的长边涂抹胶水，胶面朝上，静置干燥。干燥过程约需30秒，当整个涂胶区域呈现哑光而非湿润或反光时，即表示干燥完成。 
	注意：至少提前 48 小时制备“胚胎胶”。按照所述方法，将正庚烷（n-Heptane）加入闪烁瓶中的双面胶条上28.</li>
	<li>“胚胎胶”干燥后，将盖玻片有胶的一面朝下，轻轻放置在琼脂上排列整齐的胚胎行上方，盖玻片边缘与胚胎行之间保留2-3 mm的间距。 
	注意：将胚胎贴附在盖玻片边缘过近可能导致实验过程中胚胎过度干燥。</li>
	<li>将盖玻片翻转，使胚胎朝上。胚胎应沿盖玻片的一条长边呈直线排列，其腹侧朝向盖玻片的最近边缘。图1，第4步，放大).</li>
	<li>将带有胚胎的盖玻片轻轻放置在装有150 g 新鲜蓝色干燥剂的16盎司螺旋盖瓶上，盖紧瓶盖，于8–10分钟内干燥胚胎。图1第5步).</li>
	<li>干燥后，将盖玻片从干燥剂罐中取出，并用胶带将盖玻片的两侧短边固定在显微镜载玻片上。 胚胎朝上，用两条4 cm2 双面胶带碎片，以便胚胎盖玻片能够固定在注射台上（图1，步骤6).</li>
	<li>用巴氏吸管加入2-3滴Halocarbon 27油，覆盖已排列的胚胎，防止其进一步脱水（图1，步骤6).</li>
</ol>
4. 注射胚胎并进行热激处理以促进肌动蛋白杆状结构的形成
注意：所有注射均在温度控制为 18 °C 的房间内进行。
<ol>
	<li>使用尺寸至少为 100 mm × 20 mm 的玻璃培养皿制备湿润的孵育室，并在室内铺上用蒸馏水润湿的实验室擦拭纸条（图1，步骤8）。在注射胚胎前，将孵育室预热至 32 °C 或所需的孵育温度。</li>
	<li>打开显微注射仪的气流阀，并开启显微注射仪（压缩空气或管道空气，压力至少为 90 psi 即可）。</li>
	<li>在胚胎脱水的同时，使用微量加样吸头将先前制备的 G-actinRed 上清液反向加载至微针中。设置移液器吸取 1–1.5 μL。 
	注意：由于肌动蛋白具有黏性，加载体积可能不准确，且可能残留足够的肌动蛋白用于再加载至少一到两根微针。若微针校准得当且在实验过程中未发生堵塞，每根加载的微针最多可注射 60 个胚胎。</li>
	<li>将微针安装到针夹上并拧紧螺丝。将气管连接至显微注射仪，并确保微针的回流压力平衡至 30 hPa。</li>
	<li>校准显微注射仪参数，使其在载物台测微尺上排出直径为 100 μm 的 G-actinRed 气泡（约 500 pL）。调节显微注射仪上的压力旋钮（500–1500 hPa）和注射脉冲时间旋钮（0.1–0.5 s），以获得合适的气泡大小。每次更换新的微针时均需调整这些参数，以补偿肌动蛋白黏度和微针尖端尺寸的差异。 
	注意：制备好的 G-actinRed 具有黏性，微针尖端可能存在气泡，应在注射胚胎前将其排出。若 G-actinRed 无法顺利从微针尖端排出，可轻轻将微针尖端在载物台测微尺边缘轻碰以打破阻塞。</li>
	<li>将固定有胚胎的载玻片置于显微镜载物台上。 
	注意：每次注射装置的设置可能不同，研究人员需相应调整注射方法。此处采用移动胚胎而微针保持静止的方式，通过推动胚胎接触微针完成逐个注射。</li>
	<li>调节显微操作器载物台及光学显微镜 10x 物镜的焦距，使胚胎清晰可见。当卵黄膜轮廓最清晰且胚胎看起来最大时，表明胚胎处于正确的焦平面。选择处于合适发育阶段的胚胎进行注射，以确保在注射后孵育结束时，大部分胚胎达到目标发育阶段（例如，在 Bownes 发育阶段 2–330 时注射胚胎，以便在 32 °C 热激后观察细胞化阶段的棒状结构）。</li>
	<li>使用微针控制装置将微针移至与胚胎相同的焦平面。 
	注意：若在移动载物台或微针时微针触碰到盖玻片，则说明微针距离载玻片过近，未处于正确焦平面。微针应与盖玻片平行，不得有明显倾斜角度（图1，步骤7）。</li>
	<li>将微针插入胚胎，使其击中胚胎腹侧中部，即胚胎“赤道”位置。当微针尖端可见于胚胎中部时，踩下脚踏开关或按下“注射”按钮触发注射（图1，步骤7）。</li>
	<li>注射一次 G-actinRed 后缓慢拔出微针。移动载物台，对每个处于合适发育阶段的胚胎重复此操作。 
	注意：注射 G-actinRed 时胚胎膨胀属正常现象，可能会有少量细胞质从胚胎中渗出。</li>
	<li>完成所有胚胎注射后，将载有胚胎的载玻片放入已准备好的湿润孵育室中并盖上盖子（图1，步骤8）。若需获得达到细胞化阶段的胚胎，需在湿润孵育室中于 32 °C 进行 60–75 分钟的热激处理。 
	注意：此处注明的孵育时间适用于观察细胞化阶段经热激处理胚胎中的棒状结构。对于未经热激的对照组胚胎，由于在较低温度下发育较慢，所需孵育时间将更长31。这些对照组胚胎可根据具体实验设计和研究问题，在 18 °C 或 25 °C 等温度下的湿润孵育室中孵育。G-actinRed 在胚胎内充分扩散所需的最短孵育时间为 30 分钟。</li>
</ol>
5. 通过共聚焦显微镜观察热应激胚胎中的肌动蛋白棒状结构
<ol>
	<li>在对胚胎进行热激处理的同时，打开共聚焦显微镜并选择561 nm激光通道。</li>
	<li>将物镜（推荐使用25倍、40倍或63倍）移至工作位置。</li>
	<li>若对受热应激的胚胎进行成像，请将加热载物台培养箱设置为内部温度32 °C。可使用点温计或红外测温仪检测物镜处或其附近的温度。</li>
	<li>孵育结束后，从湿润的孵育室中取出带有已注射胚胎的载玻片图1，步骤9).</li>
	<li>快速操作，小心地撬下用于将带有固定胚胎的盖玻片粘附在载玻片上的双面胶带碎片图1，步骤9). 
	注意：操作这些步骤时需轻柔，因为盖玻片在受力过大时容易破碎。</li>
	<li>将两段2.5 cm长的双面胶带粘合在一起，沿长度方向对半切割，得到两条尺寸为2.5 × 0.5 cm的胶带条（图1，步骤10).</li>
	<li>将每条胶带长度的三分之二粘贴到第一块盖玻片上，置于卤代烃油27中的胚胎两侧图1第10步，橙色），使三分之一的胶带条悬挂在胚胎所附着的第一块盖玻片边缘外。操作时需戴手套，并注意避免触碰胚胎。</li>
	<li>轻轻将第二块矩形盖玻片置于胶带条上方，使胚胎夹在两块盖玻片之间（图1，第10步，蓝色）。对齐25 mm的边，但使50 mm的边在宽度上相互偏移1 cm。 
	注意：这第二块盖玻片的整个表面将成为新的成像面，朝向物镜镜头。 因此请注意，不要让指纹或氟化碳27油沾到第二块盖玻片表面偏移是必要的，以便添加额外的Halocarbon 27油，使胚胎完全均匀浸没。如有需要，可在夹心结构顶部两片盖玻片相接的接缝处加入Halocarbon 27油，油将通过毛细作用覆盖胚胎（见图中虚线所示） 图1，步骤10).</li>
	<li>用剃刀的钝边轻轻按压盖玻片上正对胶带条的区域，使盖玻片贴附于胶带上。</li>
	<li>将盖玻片夹心结构翻转，放置在实验室擦镜纸上，以保持成像表面清洁，并将其转移至共聚焦显微镜图1，步骤11确保在成像前胶带已完全粘附于两张盖玻片上。</li>
	<li>确认加热载物台已达到设定温度，若使用倒置显微镜，则在所选物镜上添加浸没液。</li>
	<li>将盖玻片夹心结构小心地放置在载物台上，以确保新的成像表面（2nd 盖玻片）是接触浸油液体的那个面（图1，步骤11). 
	注意：如果盖玻片夹层在加热载物台上贴合不紧密，在成像过程中可能发生不必要的移动，此时可用两小块双面胶将盖玻片夹层固定在载物台上以防止移动。</li>
	<li>聚焦于处于细胞化阶段的胚胎（Bownes 4a期）30）或所需发育阶段，可使用透射光或荧光进行观察。</li>
	<li>一旦胚胎处于聚焦状态，切换至共聚焦显微镜的激光采集模式，并根据需要调整激光功率、增益、帧尺寸、拼图及投影设置。</li>
	<li>通过胚胎细胞核的焦平面获取表面视图图像，以寻找核内肌动蛋白棒状结构。这些棒状结构应在相对较暗的细胞核内呈现为明亮的条纹或点状，且具有多种取向。图2A，2C).</li>
</ol>
6. 替代成像实验
<ol>
	<li>通过FRAP技术研究核内肌动蛋白束沿其全长或细胞质中肌动蛋白结构（如细胞化过程中质膜沟槽尖端）的肌动蛋白 turnover 情况。</li>
	<li>在成像软件中，选择围绕沟槽尖端或肌动蛋白束的矩形区域以进行实验采集。</li>
	<li>在矩形采集区域内，选取肌动蛋白束中心的一个小方形区域进行漂白。确保肌动蛋白束的两端在实验过程中保持可见且不被漂白，以便准确追踪核内肌动蛋白束的位置。</li>
	<li>将漂白激光设置为重复50次，并将漂白激光功率设为最大值。</li>
	<li>设置时间序列，以最高像素驻留速度每秒采集一次图像，总时长最多120秒，并在图像采集开始后的前两秒后启动激光漂白。</li>
	<li>对数据进行量化分析，以确定荧光恢复的半衰期1。</li>
</ol>

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</ol>

无利益冲突声明。

该方法的意义在于，它利用了在果蝇（Drosophila）胚胎中已建立完善的显微注射技术21,22,23,24,25,26,27，从而推动关于ASR及其伴随的肌动蛋白杆状结构组装的新研究。将G-actinRed注射入活体胚胎的主要优势在于，可以在多种不同条件下研究ASR。在后续研究中，这些条件可包括向其他基因型的胚胎注射以进行突变体筛选，或将已注射的胚胎暴露于不同的应激环境（如氧化应激）4,32。尽管此处未详细描述，该注射技...

本方案描述了如何注射G-actinRed以可视化热应激胚胎中核内肌动蛋白棒状结构的组装过程，这些胚胎正处于可诱导的肌动蛋白应激反应（ASR）1。我们开发该方案旨在促进对ASR的研究，因为在胚胎中，ASR会导致形态发生紊乱和存活率降低；而在成人的人类细胞类型中，ASR则与多种病理状态相关，包括肾功能衰竭2、肌肉肌病3以及阿尔茨海默病和亨廷顿病4,5,6,7,8。ASR可由多种细胞应激诱导，包括热休克9,10,11、氧化应激4,6、ATP合成减少12以及异常亨廷顿蛋白或β-淀粉样蛋白寡聚化4,5,6,7,9,13,14,15,16。ASR的一个典型特征是，在受影响细胞的胞质或细胞核内形成异常的肌动蛋白棒状结构，这一过程由应激诱导的肌动蛋白结合蛋白Cofilin过度活化所驱动1,5,6,10。然而，目前关于ASR仍存在若干关键的知识空白。例如，肌动蛋白棒状结构的功能尚不清楚；我们也不了解为何某些细胞类型的棒状结构形成于胞质，而其他细胞类型则形成于细胞核内。此外，尚不明确ASR对于经历应激的细胞或胚胎而言是保护性反应还是适应不良性反应。最后，Cofilin过度活化及肌动蛋白棒状结构组装的详细机制仍不清楚。因此，本方案提供了一种快速且多功能的检测方法，可通过在活体果蝇胚胎这一高度可操作的实验系统中观察肌动蛋白棒状结构的形成与动态变化来深入探究ASR。
将G-actinRed显微注射到活体Drosophila胚胎中的实验方案最初是为了研究组织形成过程中正常胞质肌动蛋白结构的动力学17。在这些研究中，我们发现G-actinRed注射对胚胎早期发育过程（包括胞质分裂或原肠作用）没有不利影响17,18。随后我们对该方案进行了改进，调整了胚胎处理和G-actinRed注射步骤，以便对经历热应激并发生ASR的胚胎中的肌动蛋白棒状结构进行成像1。除G-actinRed注射外，还有其他方法可用于在胚胎中可视化肌动蛋白。这些方法依赖于表达荧光蛋白（FPs）标记的肌动蛋白或肌动蛋白结合蛋白结构域，例如Utrophin-mCherry、Lifeact、F-tractin-GFP和Moesin-GFP（综述见19）。然而，使用这些荧光蛋白探针需谨慎，因为它们可能稳定或破坏某些肌动蛋白结构，不能均等地标记所有肌动蛋白结构20，而对于actin-GFP而言，其表达水平往往过高——这给棒状结构组装的分析带来问题，因为棒状结构的形成不仅依赖于应激，也依赖于肌动蛋白浓度1。因此，在果蝇胚胎的棒状结构研究中，G-actinRed是首选探针，且由于胚胎体积较大，易于进行显微注射。
本实验方案的工作流程与其他已建立的显微注射技术类似，这些技术已被用于将蛋白质、核酸、药物和荧光指示剂注入Drosophila胚胎21,22,23,24,25,26,27。然而，在本实验中，显微注射G-actinRed后，胚胎会经历轻度热应激处理，以诱导ASR及核内肌动蛋白杆状结构的组装。对于具备果蝇资源和显微注射装置的实验室而言，该方法可直接实施，并可根据ASR相关研究的具体需求进行调整，例如研究不同应激条件下的ASR诱导，或在不同遗传背景下ASR的调控机制。

<table><tbody><tr><td>三磷酸腺苷（ATP）</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>G缓冲液组分</td></tr><tr><td>苹果汁，Mott's，64液盎司</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>苹果汁培养基板组分</td></tr><tr><td>Bacto琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td>苹果汁培养基板组分</td></tr><tr><td>漂白剂，PureBright杀菌型，6.0%次氯酸钠</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>用于胚胎去壳</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C1016500G</td><td>G缓冲液组分</td></tr><tr><td>细胞筛网，70 &amp;mu;m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>用于收集去壳胚胎</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜，LSM 880 34通道带Airyscan</td><td>Zeiss</td><td>0000001994956</td><td>用于成像核内肌动蛋白棒状结构</td></tr><tr><td>干燥剂</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>用于胚胎干燥处理</td></tr><tr><td>解剖显微镜，Stemi 508体视显微镜，8:1变焦</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>用于在琼脂楔上排列胚胎</td></tr><tr><td>解剖针，5英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>用于在琼脂楔上排列胚胎</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>G缓冲液组分</td></tr><tr><td>双面胶带，Scotch永久型，0.5英寸×250英寸</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>用于制备胚胎胶</td></tr><tr><td>胚胎收集笼</td><td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>用于饲养成虫果蝇并收集胚胎</td></tr><tr><td>精细镊子，Dumont镊子，5号型号</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>用于在琼脂楔上排列胚胎</td></tr><tr><td>玻璃毛细管，硼硅酸盐玻璃，细型1 mm × 0.75 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>用于制作显微注射针</td></tr><tr><td>卤代烃油27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>用于胚胎保湿</td></tr><tr><td>加热载物台培养箱</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>用于共聚焦成像</td></tr><tr><td>实验室擦拭纸，KimWipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td>实验室擦拭纸</td></tr><tr><td>倒置显微镜，Invertoskop 40C倒置相差显微镜，翻新</td><td>Zeiss</td><td>已停产</td><td>注射用显微镜</td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>苹果汁培养基板组分</td></tr><tr><td>显微注射仪，FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>显微注射仪</td></tr><tr><td>微量加样枪头，epT.I.P.S. 20 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>用于向显微注射针中加样</td></tr><tr><td>显微操作仪及带x、y、z调节旋钮的注射载物台</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>定制</td><td>用于进行显微注射</td></tr><tr><td>微电极拉制仪，P-97型，Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>用于拉制毛细管以制作显微注射针</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片 24×50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>用于固定胚胎</td></tr><tr><td>显微镜载玻片，Lilac Colorfrost，预清洁，25 × 75 × 1 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>用于注射前固定胚胎</td></tr><tr><td>正庚烷（n-Heptane）</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>胚胎胶组分</td></tr><tr><td>物镜，10倍</td><td>Zeiss</td><td>已停产</td><td>注射显微镜用10倍物镜</td></tr><tr><td>物镜，C-Apochromat 40x/1.2 W Korr. FCS</td><td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>共聚焦用40倍水镜</td></tr><tr><td>物镜，LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27，适用于油、水、硅油或甘油浸没（D=0-0.17mm）（WD=0.57mm，当D=0.17mm时）</td><td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>共聚焦用25倍混合浸没物镜</td></tr><tr><td>物镜，Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>共聚焦用63倍油镜</td></tr><tr><td>画笔，Robert Simmons Expression E85尖头圆头2号</td><td>Daler-Rowney</td><td>038372016954</td><td>用于转移胚胎</td></tr><tr><td>纸巾，Kleenex C型折叠纸巾，白色</td><td>Kimberly-Clark</td><td>884266344845</td><td>用于吸干细胞筛网</td></tr><tr><td>巴斯德吸管，5又3/4英寸</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>用于覆盖胚胎的油层</td></tr><tr><td>培养皿，玻璃，100 × 20 mm</td><td>Corning</td><td>3160102</td><td>用作保湿培养室</td></tr><tr><td>培养皿，塑料，60 × 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>用于苹果汁培养基板</td></tr><tr><td>移液器，Eppendorf Reference 0.5–10 &amp;mu;L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>用于向显微注射针中加样</td></tr><tr><td>移液枪头，xTIP4 250 &amp;mu;L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>用于向盖玻片添加胚胎胶</td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>用于切割琼脂楔、胶带和移液枪头</td></tr><tr><td>罗丹明标记的球状肌动蛋白，人血小板来源（非肌肉型；4×10 &amp;mu;g）</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>闪烁瓶，20 mL 硼硅酸盐玻璃瓶，带聚乙烯衬垫和脲盖</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>用于制备胚胎胶</td></tr><tr><td>螺口瓶，16盎司</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>用于胚胎干燥处理</td></tr><tr><td>载物台测微尺</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>602104PG</td><td>用于校准G-肌动蛋白注射体积</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>苹果汁培养基板组分</td></tr><tr><td>Trizma碱</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>G缓冲液组分</td></tr><tr><td>酵母，Lesaffre酵母公司，Red Star活性干酵母，32盎司</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>酵母糊组分</td></tr></tbody></table>

活细胞热应激下核内肌动蛋白杆状结构的成像 果蝇 胚胎

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

本实验方案的目的是观察活细胞内形成的核内肌动蛋白束 黑腹果蝇 热激后的胚胎。肌动蛋白棒状结构是保守的、可诱导的肌动蛋白应激反应（Actin Stress Response, ASR）的标志性特征，该反应与包括神经退行性疾病在内的多种人类病理状态相关。此前，我们已证明ASR会导致发育中胚胎的形态发生失败和存活率降低。本实验方案使得在一种非常适合成像、遗传学和生物化学研究的模式系统中，持续深入研究肌动蛋白棒状结构组装及ASR的潜在机制成为可能。胚胎被收集后固定在盖玻片上，以准备显微注射。使用罗丹明标记的球状肌动蛋白（G-actin）红色) 被稀释后加载至微针中，对每个胚胎的中心进行单次注射。注射后，将胚胎在较高温度下孵育，随后通过共聚焦显微镜观察细胞核内的肌动蛋白束。可对肌动蛋白束进行光漂白后荧光恢复（FRAP）实验；细胞质中其他富含肌动蛋白的结构也可被成像。我们发现，G-肌动蛋白红色 像内源性G-actin一样发生聚合，且本身不会干扰正常胚胎发育。该方案的一个局限性在于注射过程中需格外小心，以避免对胚胎造成严重损伤。然而，经过练习后，注射G-actin红色 进入 黑腹果蝇 胚胎是可视化肌动蛋白杆状结构的一种快速可靠的方法，可轻松用于任何基因型的果蝇，也可结合缺氧和氧化应激等其他细胞应激条件使用。

胚胎操作的示意图见图1，典型实验的时间安排见表1。对良好实验结果的预估是：每注射10个胚胎，至少有一半被观察的胚胎处于正确的发育阶段、无损伤，并在32 °C热应激条件下表现出强烈的ASR反应。这种ASR反应的特征是细胞核内肌动蛋白棒状结构的形成，如图2A（右图）中胚胎代表性表面图像所示。肌动蛋白棒可在细胞核内以多种方向（平行或垂直于成像平面）存在，并可通过多个焦平面进行成像。相比之下，在18 °C孵育的对照组胚胎则不会出现肌动蛋白棒（Figure 2A，左图）。含有棒状结构的细胞核百分比可进行量化分析，如图2B所示。此外，还可对肌动蛋白棒进行FRAP实验（图2C）。关于FRAP数据的一种推荐量化方法参见文献1，图2D</...

本实验方案的目的是将罗丹明标记的球状肌动蛋白注射到Drosophila胚胎中，并在热应激后观察细胞核内肌动蛋白棒状结构的组装过程。

本实验方案旨在观察热应激后活体黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）胚胎中形成的核内肌动蛋白束。肌动蛋白……

本方案的意义在于利用果蝇胚胎中已建立成熟的显微注射技术，推动对肌动蛋白应激反应及其伴随的肌动蛋白棒状结构组装的新研究。该技术的主要优势在于，我们能够在多种条件下研究肌动蛋白的应激反应，例如在突变体筛选中或不同应激环境下。对于从未操作过该技术的人员而言，可能在胚胎处理和显微注射操作方面遇到困难。建议练习这些步骤，直到操作者感到熟练为止。该方法的可视化演示至关重要，因为仅凭文字说明可能无法清晰传达胚胎操作、定位以及显微注射和成像过程中的固定等步骤。请根据文稿中的指示准备胚胎收集杯和苹果汁琼脂平板。为了促进最大程度的产卵，应在实验开始前两天将果蝇放入收集杯中。每个收集杯中加入至少100只雌性果蝇和50只雄性果蝇，然后用琼脂苹果汁培养基平板封口。配制G-肌动蛋白红色工作液，并置于冰上保存，直至装入显微注射针中。在18摄氏度条件下，让果蝇在含酵母糊的苹果汁培养基上产卵30分钟。在果蝇产卵的同时，用刀片切下一小块4厘米×1厘米的苹果汁琼脂，将其放置于25毫米×75毫米的玻璃载片上。从收集装置中取出培养基，通过将新鲜的漂白液倒入培养基并轻轻旋转一分钟，对胚胎进行去壳处理。用蒸馏水润湿画笔的刷毛，然后用其将去壳并清洗过的胚胎从收集篮中转移到载玻片上已准备好的苹果汁琼脂楔形块上。使用一对精细尖头镊子或解剖针，将10个胚胎沿矩形琼脂楔的长轴方向排成一条直线。将胚胎首尾相连排列，使其背侧朝向研究人员。用剃刀刀片切下P200枪头末端约0.5厘米，将其浸入胚胎胶中。在24 mm × 50 mm矩形盖玻片的长边沿约5毫米区域均匀涂抹足量胚胎胶，然后将胶面朝上放置使其干燥。待胚胎胶完全干燥后，将盖玻片胶面朝下轻轻覆盖在琼脂上已排列整齐的胚胎行上方，确保盖玻片边缘与胚胎行之间留有2至3毫米的间隙。将盖玻片翻转，使胚胎朝上。胚胎应沿盖玻片的一条长边呈直线排列，其腹侧朝向最近的边缘。将盖玻片放置在16盎司螺旋盖瓶中，瓶内装有150克新鲜蓝色干燥剂，并拧紧瓶盖。将胚胎干燥 8 到 10 分钟，然后从干燥剂罐中取出盖玻片，并用胶带将盖玻片的短边固定在载玻片上，使胚胎面朝上。用巴斯德移液管加入 2 至 3 滴 Hollow Carbon 27 油，覆盖排列好的胚胎，防止其进一步脱水。在胚胎干燥的同时，使用微加载吸头将先前制备的 G-actin red 上清液从后端装入微针中。将微针固定到针夹上并拧紧螺丝。将载有固定胚胎的载玻片置于显微镜载物台上，使用微针控制装置调节，使微针与胚胎处于同一焦平面。将微针插入胚胎，使其在胚胎赤道位置的腹侧中部刺入胚胎。当微针尖端可见于胚胎中部时，启动注射。注射完成后，缓慢取出微针。移动载物台，对其他胚胎进行注射操作。所有胚胎注射完成后，将载有胚胎的载玻片放入湿润的培养孵育室中，并盖上盖子。随后，从湿润的培养孵育室中取出注射后的载玻片。操作时动作要迅速，轻柔地撬下用于将盖

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