用于膜蛋白-蛋白质相互作用分析的原生细胞膜纳米粒子系统

该协议将帮助研究人员通过将天然细胞膜纳米颗粒系统与电子显微镜结合使用来更准确地确定膜蛋白的天然寡聚状态。该技术的优点是它在天然细胞膜样环境中提供了膜蛋白的准确结构数据，可用于未来的高分辨率结构测定。演示该程序的是我实验室的博士后研究员 Kyle Kroeck。

为了制备天然细胞膜纳米颗粒，将 1 克感兴趣的膜沉淀重悬于 10 毫升 NCMN 缓冲液中 A.使用玻璃 Dounce 匀浆器在 20 摄氏度下匀浆重悬的细胞膜样品，并将悬浮样品转移到 50 毫升聚丙烯管中。向样品中加入膜活性聚合物储备液和额外的 NCMN 缓冲液 A，使其终浓度为 2.5% 膜活性聚合物，并在 20 摄氏度下摇动溶液 2 小时。孵育结束时，超速离心样品。

在离心过程中，在离心结束时用 25 mL NCMN 缓冲液平衡 5 mL 镍 NTA 柱 A.At，将上清液转移到柱上，并使用设置为 0.5 mL/min 流速的注射泵在 20 °C 下将上清液加载到柱上。用足够的 NCMN 缓冲液 B 清洗快速蛋白液相色谱机管路，以完全冲洗系统并将色谱柱连接到色谱仪。用 30 mL NCMN 缓冲液 B 以每分钟 1 mL的流速洗涤色谱柱，并收集流出液。

用 30 mL NCMN 缓冲液 C 以每分钟 1 mL 的流速洗涤色谱柱，并收集流出液。用 20 毫升 NCMN 缓冲液 D 以每分钟 0.5 毫升的流速洗脱蛋白质，并使用馏分收集器收集 1 毫升馏分的样品，然后使用 SDS-PAGE 将蛋白质样品储存在 4 摄氏度下，以检查与快速蛋白质液相色谱洗脱图上观察到的峰相对应的样品。要制备负染色网格，请用滤纸包裹载玻片，碳面朝上，然后将用于样品制备的网格放在载玻片上。

将带有电子显微镜网格的载玻片放入两个电极之间的辉光放电器腔室中，然后更换玻璃盖，确保盖子居中且密封良好。运行辉光放电机，确保等离子体产生的紫光可见。机器运行完毕后，等到腔室达到大气压后，再取下玻璃盖并将载玻片放在工作台上。

将纯化的蛋白质样品的浓度调整至约 0.1 毫克/毫升，并将 3.5 微升蛋白质样品加载到 10 纳米厚的碳网格上。一分钟后，用一张滤纸去除电子显微镜网格表面的液体，并用一滴 3 微升的水洗涤网格表面 3 次。最后一次水洗后，每次洗涤用三微升新鲜过滤的 2% 乙酸铀液滴再清洗网格表面两次。

最后一次乙酸铀洗涤后，用 3 微升新鲜过滤的 2% 乙酸铀液滴对网格染色 1 分钟。孵育结束时，使用一张新滤纸去除液滴并将网格风干至少一分钟，然后将网格存放在网格盒中以备后用。在这里，可以观察到使用透射电子显微镜获得的负染色图像，如图所示。

用去污剂纯化的野生型 Acraf黄素抗性通道蛋白 B 样品的阴性染色图像显示单分散颗粒的均匀溶液，蛋白质显示出明确的三聚体四级结构。这些三聚体结构与纯化后观察到的尺寸排阻色谱图相对应。相比之下，在同样用去污剂纯化的 P223G 突变体的负染色图像中，可以观察到具有聚集倾向但无法观察到天然三聚体的多分散纳米颗粒的异质溶液。

这些结果也得到了体积排阻色谱法的支持。使用膜活性聚合物 NCMNP11 纯化后，野生型和突变型蛋白观察到相似的结果。NCMNP52聚合物的使用有助于产生更大尺寸的天然细胞膜纳米颗粒，从而允许在单个天然细胞膜颗粒中对多个 Acraf黄素抗性通道蛋白 B 三聚体进行成像。

然而，在突变体样品中，即使观察大的天然细胞膜双层斑块，也没有观察到三聚体颗粒。纯化蛋白质样品的 SDS-PAGE 分析证实所有样品中存在 Acraf黄素抗性 B，在蛋白质的预测分子量下纯度大于 95%。当为其他蛋白质修改此方案时，重要的是通过实验确定适当的膜组分量以及增溶过程的长度、时间和温度。

如果样品图像显示具有明确结构单元的单分散颗粒的均相溶液，则样品可用于冷冻电子显微镜的高分辨率结构测定。