Name: 用于膜蛋白-蛋白质相互作用分析的原生细胞膜纳米粒子系统 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 31 s
Description: 学习利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜分析膜蛋白寡聚状态的方法。该技术可在类天然膜环境中获取准确的膜蛋白结构数据，适用于神经科学与结构生物学研究。

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本研究由弗吉尼亚联邦大学（VCU）启动资金（资助编号：Y.G.）以及美国国立卫生研究院（NIH）下属国家普通医学科学研究所资助（资助编号：R01GM132329，Y.G.）。本研究内容仅由作者负责，不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。我们感谢Montserrat Samso和Kevin McRoberts在视频录制方面提供的大力支持。

1. 蛋白质表达
<ol>
	<li>在50 mL离心管中，将15 mL含相应质粒特异性抗生素的丰富培养基（Terrific Broth, TB）接种含有表达AcrB质粒的BL21(DE3) pLysS细胞，于37 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>测定过夜培养物在600 nm处的光密度（OD600），确保其值超过2.0。</li>
	<li>将5 mL过夜培养物接种至1 L含相应质粒特异性抗生素的TB培养基中，在37 °C振荡培养至OD600=0.8，然后加入IPTG至终浓度为1 mM进行诱导。</li>
	<li>在20 °C、振荡条件下继续诱导培养20小时。</li>
	<li>于4 °C、4,000 x g条件下离心15分钟，收集菌体沉淀。</li>
</ol>
2. 细胞裂解与膜分离
<ol>
	<li>根据后续的纯化方案，使用 DDM Buffer A 或 NCMNs Buffer A（见表1），每20 g细胞沉淀使用80 mL Buffer A重悬细胞沉淀。</li>
	<li>在4 °C条件下使用玻璃Dounce匀浆器对重悬的细胞沉淀进行匀浆；若在室温下操作，则匀浆后需立即置于冰上。</li>
	<li>将样品转移至冰上的金属烧杯中，并在4 °C、1,500 bar条件下使用高压匀浆器裂解细胞。
	<ol>
		<li>将细胞反复加载至匀浆器中，使其通过匀浆器3–4个循环，直至裂解液开始变澄清为止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在4 °C条件下，以15,000 x g离心裂解液30分钟。</li>
	<li>收集上清液，转移至超速离心管中，在4 °C条件下以215,000 x g离心1小时。</li>
	<li>弃去上清液，收集超速离心管中的膜沉淀。如有多余膜沉淀，可在-80 °C保存。</li>
</ol>
3. 天然细胞膜纳米颗粒的制备
<ol>
	<li>将1 g膜沉淀重悬于10 mL NCMNs缓冲液A中（表1）。</li>
	<li>在20 °C下，使用玻璃Dounce匀浆器匀浆重悬的细胞膜样品。</li>
	<li>将悬浮的膜样品转移至50 mL聚丙烯管中，加入膜活性聚合物储备液和额外的NCMNs缓冲液A，使样品中膜活性聚合物（NCMNP1-1或NCMNP5-2）的终浓度为2.5%（w/v）。 
	注意：膜活性聚合物的储备液应使用双蒸水配制，可配制成不同浓度，通常为10%（w/v）。</li>
	<li>在20 °C下振荡样品2小时。</li>
	<li>将样品装入超速离心机，在20 °C下以150,000 × g离心1小时。</li>
	<li>在样品超速离心的同时，开始用25 mL NCMNs缓冲液A平衡5 mL Ni-NTA柱。</li>
	<li>超速离心完成后，收集上清液，并在室温下以0.5 mL/min的流速使用注射泵将其上样至5 mL Ni-NTA柱中。</li>
	<li>使用足量的NCMNs缓冲液B（表1）冲洗快速蛋白液相色谱（FPLC）管路，彻底清洗系统后，将色谱柱连接至FPLC仪器。</li>
	<li>以1 mL/min的流速用30 mL NCMNs缓冲液B洗涤色谱柱，并收集穿流液。</li>
	<li>以1 mL/min的流速用30 mL NCMNs缓冲液C（表1）洗涤色谱柱，并收集穿流液。</li>
	<li>以0.5 mL/min的流速用20 mL NCMNs缓冲液D（表1）洗脱蛋白，使用馏分收集器收集样品，每管设定为1.0 mL。</li>
	<li>将蛋白样品储存于4 °C。</li>
	<li>进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，以检测FPLC洗脱图谱中对应峰的样品。</li>
</ol>
4. SDS-PAGE 凝胶电泳
<ol>
	<li>通过将玻璃板夹紧到制胶装置上，准备制胶室。</li>
	<li>根据表1中列出的配方配制12%分离胶。 
	注意：加入TEMED后胶会迅速聚合，因此仅在准备灌胶时再加入TEMED。</li>
	<li>灌注分离胶，留出距梳子底部约2 cm的空间用于后续灌注浓缩胶。</li>
	<li>在胶顶部覆盖一层100%异丙醇以去除气泡，并等待分离胶完全聚合。</li>
	<li>去除异丙醇，并用蒸馏水冲洗残留的异丙醇痕迹。</li>
	<li>根据表1中列出的配方配制浓缩胶。 
	注意：加入TEMED后胶会迅速聚合，因此仅在准备灌胶时再加入TEMED。</li>
	<li>将浓缩胶灌注在已聚合的分离胶上方。</li>
	<li>向制胶室中插入梳子以形成加样孔，并等待浓缩胶完全聚合。</li>
	<li>为每个需要上样检测的组分样品，向一个微量离心管中加入1 µL的1 M DTT。</li>
	<li>向每根试管中同时加入7 µL的4x上样缓冲液。</li>
	<li>从需要上样检测的各组分中取20 µL样品加入对应的微量离心管中。</li>
	<li>用涡旋振荡器充分混匀含有样品的试管。</li>
	<li>使用台式微量离心机将样品管短暂离心3秒，确保所有样品沉降至管底。</li>
	<li>安装电泳槽：将一块12%聚丙烯酰胺凝胶板固定在电泳装置中，并在内槽和外槽中加入Tris-乙酸-EDTA（TAE）缓冲液（表1）。</li>
	<li>根据分子量标准品说明书推荐的体积，将其加入凝胶的第一个泳道中。</li>
	<li>将每根试管中与DTT和上样缓冲液混合后的样品各取28 µL进行上样。</li>
	<li>将电泳槽盖板盖在电泳槽上，并将电极插头连接至电源。</li>
	<li>打开电源，设置电压为100 V，电泳20分钟。</li>
	<li>20分钟后，将电压提高至140 V，继续电泳30–40分钟，或直至加样缓冲液染料条带迁移至凝胶板底部。</li>
	<li>电泳结束后，对凝胶进行染色和脱色处理，以观察凝胶中蛋白质条带。</li>
</ol>
5. 使用 DDM 进行蛋白质纯化
注意：进行此纯化过程的目的是作为利用膜活性聚合物的实验的对照。
<ol>
	<li>将步骤 2.6 中获得的 6–10 g 膜沉淀用 DDM 缓冲液 A（表 1）重悬，每克膜沉淀使用 5 mL 缓冲液。</li>
	<li>在 4 °C 下使用玻璃 Dounce 匀浆器匀浆重悬的样品；若在室温下操作，完成后应立即将样品置于冰上。</li>
	<li>将样品转移至 50 mL 聚丙烯管中，并加入 DDM 及额外的 DDM 缓冲液 A，使样品中 DDM 的终浓度为 2%。</li>
	<li>在 4 °C 下振荡样品 2 小时。</li>
	<li>将样品装入超速离心管中，在 4 °C、150,000 x g 条件下离心 1 小时。</li>
	<li>在样品超速离心的同时，开始准备 5 mL Ni-NTA 柱：用 25 mL DDM 缓冲液 A（表 1）洗涤柱体。</li>
	<li>超速离心完成后，收集上清液，并在 4 °C 下以 0.5 mL/min 的流速使用注射泵将其加载至 5 mL Ni-NTA 柱中。</li>
	<li>用足量的 DDM 缓冲液 B + 0.05% DDM（表 1）冲洗 FPLC 管路，彻底清洗系统后，将层析柱连接至 FPLC 仪器。</li>
	<li>以 1 mL/min 的流速用 30 mL DDM 缓冲液 B + 0.05% DDM 洗涤层析柱，并收集穿流液。</li>
	<li>以 1 mL/min 的流速用 30 mL DDM 缓冲液 C + 0.05% DDM（表 1）洗涤层析柱，并收集穿流液。</li>
	<li>以 0.5 mL/min 的流速用 20 mL DDM 缓冲液 D + 0.05% DDM（表 1）洗脱蛋白，使用馏分收集器收集洗脱液，每馏分设定为 1.0 mL。</li>
	<li>选择对应于洗脱峰的馏分进行合并，并使用离心浓缩器在 4,000 x g 和 4 °C 条件下浓缩至 500 µL。</li>
	<li>使用 500 µL 进样环将样品注入 FPLC 仪器，然后在 4 °C 下加载至 25 mL 凝胶过滤层析柱。以 0.5 mL/min 的流速用 30 mL DDM 缓冲液 E + 0.05% DDM（表 1）进行洗脱，收集馏分，每馏分体积设为 0.5 mL。</li>
	<li>收集各馏分，通过测定 280 nm 吸光度确定蛋白浓度，以验证 FPLC 洗脱图谱中的紫外-可见光谱曲线。</li>
	<li>从 FPLC 洗脱图谱中对应于观察到的峰且经吸光度检测确认准确的各馏分中，分别取 20 µL 样品。</li>
	<li>将上述各馏分的剩余样品使用液氮或干冰速冻，分装后于 -80 °C 保存。</li>
	<li>按照前述方法进行 SDS-PAGE 凝胶电泳分析，检测对应于 FPLC 洗脱图谱中峰的样品。</li>
</ol>
6. 负染网格制备
<ol>
	<li>将用于样品制备的载网放置在用滤纸包裹的载玻片上，碳膜面朝上。</li>
	<li>将带有透射电镜载网的载玻片放入辉光放电仪的腔室中，置于两个电极之间，并盖上玻璃盖，确保其居中且密封良好。</li>
	<li>启动辉光放电仪，确认可见由等离子体产生的紫色光。</li>
	<li>仪器运行结束后，等待腔室恢复至大气压，再打开玻璃盖，将载有载网的载玻片取回实验台，准备后续加样。</li>
	<li>通过使用适当缓冲液稀释或使用离心浓缩仪浓缩，将纯化后的蛋白质样品浓度调整至约 0.1 mg/mL。</li>
	<li>将 3.5 µL 蛋白质样品加到 10 nm 厚的碳膜载网上，静置 1 分钟。</li>
	<li>用滤纸从电镜载网表面吸去液体。</li>
	<li>通过用载网依次拾取 3 µL 水滴并用滤纸在每次拾取之间吸去载网上的水分，洗涤载网表面 3 次。</li>
	<li>通过用载网依次拾取 3 µL 新鲜过滤的 2% 醋酸铀溶液，并在每次拾取之间用滤纸吸去载网上的洗涤液，洗涤载网表面 2 次。</li>
	<li>用 3 µL 新鲜过滤的 2% 醋酸铀溶液对载网染色 1 分钟。</li>
	<li>用滤纸吸去电镜载网表面的醋酸铀溶液，并在空气中干燥至少 1 分钟。</li>
	<li>将载网存放在载网盒中，以备后续使用。</li>
</ol>
7. 透射电子显微镜成像
<ol>
	<li>在安全的工作台上将制备好的载网装入载网 holder 中。</li>
	<li>通过将显微镜的杜瓦瓶放入聚苯乙烯盒中，并向杜瓦瓶内注入三分之四满的液氮，完成显微镜的准备工作。</li>
	<li>确认显微镜窗口的橡胶盖已覆盖到位，然后将杜瓦瓶装入显微镜，将铜线插入杜瓦瓶中，直至其稳固地放置在平台上。</li>
	<li>用液氮将杜瓦瓶剩余空间填满，并在杜瓦瓶顶部加盖密封。</li>
	<li>开启高压，对显微镜进行调校，并等待显微镜预热并建立可用于操作的安全真空水平。</li>
	<li>当显微镜准备就绪后，打开镜筒阀门，通过移除显微镜窗口的橡胶盖来确认电子束的存在。</li>
	<li>通过调节电子束强度使其会聚和发散，检查电子束的消像散情况。若存在像散，当偏离束斑交叉点时，电子束将呈现椭圆形，且在两侧应呈现相同的椭圆形状。</li>
	<li>根据观察者的眼睛位置，调整显微镜双目镜筒的高度和间距至合适位置。</li>
	<li>依次切换 Search、Focus 和 Exposure 三种模式，检查每种模式下的电子束位置，确保电子束在每种模式下均居中。</li>
	<li>关闭镜筒阀门，随后将载网 holder 装入电子显微镜中。</li>
	<li>利用显微镜的 wobbler 功能，调节载物台 Z 轴方向的移动，使样品中心无左右晃动，从而将显微镜调整至等心高度。</li>
	<li>在显微镜上使用低剂量 Search 模式，在载网上寻找具有合理对比度且含有待观察样品分子的合适区域，以便对样品进行聚焦。</li>
	<li>在 Focus 模式下，先使用较大的步进值进行聚焦，直至观察到样品，然后减小步进值以找到最佳聚焦水平。</li>
	<li>将电子束归零并关闭，同时确保显微镜窗口已被橡胶垫覆盖。</li>
	<li>使用 Exposure 模式，在 62,000 倍放大倍数下对目标载网区域进行 1 秒曝光成像，并检查所获得的图像质量。</li>
	<li>完成一个载网的成像后，关闭镜筒阀门，并将载网 holder 从镜筒中取出。</li>
	<li>完成所有目标载网的成像后，关闭显微镜：先关闭灯丝电源，再将液氮杜瓦瓶从显微镜上移除。</li>
	<li>在杜瓦瓶原来放置的位置上放置吸湿材料，以吸收显微镜铜线圈产生的冷凝水。</li>
	<li>启动 Cryo Cycle 模式，并确保涡轮泵已关闭。</li>
</ol>

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<li>Hall, S. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+acid-compatible+co-polymer+for+the+solubilization+of+membranes+and+proteins+into+lipid+bilayer-containing+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">An acid-compatible co-polymer for the solubilization of membranes and proteins into lipid bilayer-containing nanoparticles.</a> Nanoscale. 10 (22), 10609-10619 (2018).</li>
<li>Oluwole, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+of+Membrane+Proteins+into+Functional+Lipid-Bilayer+Nanodiscs+Using+a+Diisobutylene%2FMaleic+Acid+Copolymer%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+England%22%5BJournal%5D)">Solubilization of Membrane Proteins into Functional Lipid-Bilayer Nanodiscs Using a Diisobutylene/Maleic Acid Copolymer.</a> Angewandte Chemie International Edition England. 56 (7), 1919-1924 (2017).</li>
</ol>

Y.G 被列为膜活性聚合物 NCMNP5-2 和 NCMN 系统的发明人。

蛋白质-蛋白质相互作用对于膜蛋白的结构完整性和功能至关重要。已有多种方法被开发用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。与可溶性蛋白相比，由于膜蛋白自身独特的内在特性，膜蛋白及其蛋白质相互作用（PPIs）更难研究。这一困难主要源于膜蛋白需要嵌入天然脂双层环境中才能维持其结构稳定性和功能活性。这带来了一个问题：为了获得蛋白质的高分辨率结构，必须将其从细胞膜中提取出来。FRET 是一种常用于研究细胞膜上蛋白质-蛋白质相互作用的技术，然而其分辨率较低，且常产生假阳性结果17,18,19,20。本文首次证明，可通过在天然细胞膜上对野生型 AcrB 三聚体和 AcrB-P223G 单体进行结构分析，并与先前基于 FRET 的分析结果进行比较，利用 NCMNs 研究膜蛋白的蛋白质-蛋白质相互作用。通过比较野生型 AcrB 与 AcrB-P223G 的电子显微镜单颗粒图像，结果表明，在使用膜活性聚合物（如 ...

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在生物学中发挥着关键作用，从维持蛋白质的结构与功能，到调控整个生物系统均离不开此类作用。PPI 具有多种不同形式，可根据其相互作用类型进行分类。其中一种分类方式是根据相互作用是否发生在相同亚基之间或作为亚基的不同蛋白质之间，将其分为同源寡聚体或异源寡聚体。另一种分类方式则基于相互作用的强度，即这些相互作用是否形成稳定的复合物或短暂存在的复合状态。关于蛋白质之间 PPI 的结构信息，对于理解蛋白质执行其功能的机制至关重要。据估计，超过 80% 的蛋白质依赖于复合物的形成来实现其功能作用1。鉴于大量蛋白质被发现依赖 PPI 实现正常固有功能，其在生物学中的重要性显而易见；然而，由于现有实验技术在观测蛋白质何时形成 PPI 方面存在局限性，对参与这些相互作用的蛋白质进行深入研究仍然具有挑战性。
由于目前许多蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）检测技术会产生大量噪声、假阳性和假阴性结果，导致针对许多实验测定的PPI结果之间存在高度不一致。这一问题在酵母双杂交（Y2H）系统、串联亲和纯化-质谱法（TAP-MS）和荧光共振能量转移（FRET）中尤为突出，这三种方法是目前最常用的PPI检测手段2,3,4,5,6,7。相比之下，蛋白质结构生物学技术，如核磁共振（NMR）、X射线晶体学和电子显微镜（EM），能够提供原子水平分辨率的蛋白质-蛋白质相互作用结构信息，并允许直接可视化验证目标蛋白之间的相互作用。目前所有非基于结构的PPI研究技术（例如Y2H、TAP-MS和FRET）均缺乏这种能力，且在识别蛋白质之间弱相互作用和瞬时相互作用方面存在困难5。当研究膜蛋白时，这些局限性更为显著，因为脂质环境这一额外变量增加了复杂性，影响了正确四级结构的形成以及异源复合物的组装。
膜蛋白构成了蛋白质组的很大一部分，已知在所有生物体的正常细胞功能中发挥着许多关键作用。尽管膜蛋白估计占人类基因组的27%，并构成了目前约60%的药物靶点，但已解析的膜蛋白结构模型数量却存在显著差异，仅占所有已发表蛋白质结构的约2.2%8,9,10。这种结构信息匮乏的主要原因在于膜蛋白自身的固有特性。由于其溶解性差、依赖与脂质环境的相互作用以维持天然结构和功能，以及脂质膜本身的各种理化性质，膜蛋白在应用结构生物学技术对其进行研究时仍构成重大挑战。在这些固有特性中，获取准确结构信息最关键的要素是膜蛋白必须与其天然脂质环境相互作用，才能维持其天然结构和功能。脂质环境对膜蛋白的结构与功能至关重要，以至于“膜蛋白”（memtein，即 membrane 与 protein 的组合）这一概念已被提出，作为膜蛋白结构与功能的基本单位11。尽管脂质-蛋白相互作用至关重要，但目前可用的基于结构的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）检测技术通常要求被研究的蛋白质具有可溶性，或需使用去垢剂将其增溶。暴露于强效去垢剂可能导致蛋白质变性，或因脱脂作用引发假阳性与假阴性结果，进而导致蛋白聚集、变性、非共价相互作用解离以及人工寡聚状态的形成。鉴于必须维持天然脂质环境以准确测定膜蛋白的天然寡聚状态，我们开发了一种天然细胞膜纳米颗粒系统（Native Cell Membrane Nanoparticles, NCMNs）12，该系统基于先前报道的苯乙烯马来酸脂质颗粒（Styrene Maleic Acid Lipid Particles, SMALP）方法13。
SMALP 利用苯乙烯-马来酸共聚物作为膜活性聚合物，用于提取和增溶膜蛋白。苯乙烯-马来酸共聚物（SMA）是一种独特的两亲性聚合物，因其含有疏水性的苯乙烯部分和与之性质截然相反的亲水性马来酸部分。SMA 通过吸附、破坏并瓦解细胞膜，在依赖 pH 的机制下形成纳米颗粒14。正是 SMA 的这种功能活性使其能够作为无去垢剂系统，用于膜蛋白的提取与增溶。NCMN 系统在多个方面与 SMALP 系统不同。NCMN 系统最显著的特点在于其拥有一个包含多种聚合物的膜活性聚合物文库，这些聚合物具有独特性质，适用于在不同稳定条件和天然功能需求下分离多种不同的膜蛋白。此外，在纳米颗粒制备流程方面，NCMN 系统也采用了与 SMALP 方法不同的实验方案。例如，NCMN 可使用单步镍亲和层析进行纯化，以实现高分辨率结构解析；比较两种方法时可观察到这些不同操作带来的影响：采用 NCMN 方案获得了分辨率为 3.2 Å 和 3.0 Å 的 AcrB 蛋白冷冻电镜结构，而使用 SMALP 方法的类似研究仅得到分辨率为 8.8 Å 的 AcrB 冷冻电镜结构12,15。NCMN 系统的这些独特特性是对已有 SMALP 方法的改进，使其成为研究蛋白质相互作用（PPIs）的理想选择。
多药外排转运蛋白 AcrB 在 E. coli 中以功能性同源三聚体形式存在12。一项诱变分析表明，位于负责 AcrB 三聚体稳定性的环状结构上的单个 P223G 点突变，在使用去垢剂 DDM 制备时会破坏三聚体状态，形成可被天然蓝色凝胶电泳检测到的 AcrB 单体16。然而，对 AcrB-P223G 突变体的 FRET 分析表明，在天然细胞膜脂双层环境中，大多数 AcrB-P223G 突变体仍以三聚体形式存在，且野生型 AcrB 与 AcrB-P223G 的表达水平相似。尽管如此，转运蛋白活性检测结果显示，该突变体的活性相较于野生型显著降低16。虽然 FRET 技术已被广泛用于蛋白质-蛋白质相互作用的研究，但已有研究显示其常产生假阳性结果17,18,19,20。
最近，利用NCMNs12解析出了AcrB三聚体的高分辨率冷冻电镜结构，揭示了AcrB与其相关的天然细胞膜脂双层之间的相互作用。原则上，NCMNs可被直接用于分析天然细胞膜上存在的蛋白质-蛋白质相互作用。在对该系统的测试中，实验利用天然细胞膜纳米颗粒和负染电子显微镜技术，直接观察了AcrB-P223G的寡聚状态。为了与野生型AcrB纳米颗粒进行比较，我们采用了相同的膜活性聚合物（实验室自制的SMA2000，在NCMN文库中编号为NCMNP1-1），该聚合物此前曾用于AcrB高分辨率冷冻电镜结构的解析，同时也使用了NCMNs文库中收录的其他替代性聚合物12。根据先前报道的结果，预期大多数AcrB-P223G突变体将以三聚体形式存在于天然细胞膜纳米颗粒中21。然而，在样品中并未发现如野生型AcrB中所观察到的AcrB三聚体。这表明，大多数AcrB-P223G在天然细胞膜上并不像此前推测的那样形成三聚体。
此处我们报告对突变体的详细分析 E. coli AcrB-P223G 与野生型的比较 E. coli 使用NCMNs研究AcrB。该AcrB案例研究表明，NCMNs是进行蛋白质-蛋白质相互作用分析的良好系统。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;化学试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% 丙烯酰胺/BIS 溶液 (37.5:1)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0158</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli 上样缓冲液（上样缓冲液）</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>冰醋酸</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A38S-212</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵（APS）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素</td><td>Goldbio</td><td>C-105-5</td><td></td></tr><tr><td>考马斯亮蓝 R-250 蛋白染色粉</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0400</td><td></td></tr><tr><td>DTT（二硫苏糖醇）（&gt; 99% 纯度）无蛋白酶</td><td>Goldbio</td><td>DTT10</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Affymetrix</td><td>17525 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Goldbio</td><td>I2481C100</td><td></td></tr><tr><td>卡那霉素</td><td>Goldbio</td><td>K-120-25</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AA3622636</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基乙二胺（EDTA）</td><td>Merck</td><td>8.03779.0100</td><td></td></tr><tr><td>NCMNS-P5-2</td><td>尚未商业化供应</td><td>请向通讯作者提交获取申请</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein 双色标准蛋白 Marker</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>SDS（十二烷基硫酸钠）</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>SMA2000</td><td>Cray Valley</td><td>请向通讯作者提交获取申请</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Goldbio</td><td>TCEP25</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>优质肉汤培养基（Terrific Broth Media）</td><td>Affymetrix</td><td>75856 1 KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0719</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Ambinter</td><td>Amb22348393</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-26S XPI</td><td>Beckman Coulter</td><td>B14538</td><td></td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>碳支持膜电镜铜网（10 nm）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CF300-Cu-TH</td><td></td></tr><tr><td>Con-Torque 组织匀浆器</td><td>Eberbach</td><td>E7265</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE 小型微量离心机</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>07-203-954</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C3</td><td>Avestin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自动组分收集器 F9-R</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29003875</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra 垂直电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8004</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000 分光光度计</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K 超速离心机</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN LL-IM-12AB</td><td></td></tr><tr><td>PELCO easiGlow 电晕放电清洗系统</td><td>Ted Pella</td><td>91000S-230</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem 安全研磨组织研磨器</td><td>Wheaton</td><td>358013</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic 电源供应器</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>Razel R99-E 可调速注射泵</td><td>Razel Scientific Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai F20 200kV 透射电子显微镜</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Type 70 Ti 固定角转子</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;通用耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>4 ml Amicon Ultra-4 30 kDa 超滤管</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC803024</td><td></td></tr><tr><td>AKTA pure 25 L1 FPLC 系统</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29018225</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS 感受态细胞</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C606003</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 圆锥形离心管</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-959-49A</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 5 ml 层析柱</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17524802</td><td></td></tr><tr><td>pET-24a 质粒</td><td>EMD Biosciences</td><td>69749-3</td><td></td></tr></tbody></table>

用于膜蛋白-蛋白相互作用分析的天然细胞膜纳米颗粒系统

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

细胞膜系统中的蛋白质-蛋白质相互作用在多种生物过程中发挥着关键作用——从细胞间的相互作用到信号转导；从感知环境信号到产生生物学响应；从代谢调控到发育控制。准确的蛋白质-蛋白质相互作用结构信息对于理解膜蛋白复合物的分子机制以及设计高特异性分子来调控这些蛋白至关重要。目前已有多种体内和体外方法被开发用于检测和分析蛋白质-蛋白质相互作用。其中，结构生物学方法的独特之处在于能够提供原子水平上蛋白质-蛋白质相互作用的直接结构信息。然而，当前的膜蛋白结构生物学研究在很大程度上仍局限于基于去垢剂的方法。基于去垢剂方法的主要缺点是，当去垢剂分子移除膜蛋白原本所处的脂双层环境后，常常会导致膜蛋白复合物解离或变性。我们一直在开发一种&#160;用于膜蛋白结构生物学研究的天然细胞膜纳米颗粒系统。在此，我们通过AcrB寡聚状态的案例研究，展示该系统在细胞膜上蛋白质-蛋白质相互作用分析中的应用。

使用本文所述方法，可制备样品 E. coli AcrB 野生型和 E. coli 突变型AcrB-P223G被纯化后，将样品吸附至碳支持膜负染电镜载网上，采用乙酸铀酰通过侧向滤纸吸除法进行染色22负染色图像采用透射电子显微镜采集。使用DDM纯化的AcrB野生型样品的负染色图像显示，溶液中颗粒均一且分散，蛋白呈现出结构清晰的三聚体四级结构。图1A）。这些三聚体结构在纯化后与观察到的尺寸排阻色谱结果相对应（补充图1）。相比之下，观察使用 DDM 纯化的 AcrB-P223G 突变体的负染图像时，可发现溶液中含有多种粒径的纳米颗粒，呈多分散状态，并倾向于聚集，但未观察到明显的天然三聚体图1B）。这些结果也得到了尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography）过程中观察到的洗脱曲线的支持。补充图1）。为了确定突变体缺乏三聚体状态蛋白是由于去垢剂处理所致...

本文介绍了一种利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术测定膜蛋白寡聚状态的实验方案。

细胞膜系统中的蛋白质-蛋白质相互作用在多种生物过程中发挥着关键作用——从细胞间相互作用到信号传导……

本方案将帮助研究人员利用天然细胞膜纳米颗粒系统结合电子显微镜技术，更准确地确定膜蛋白的天然寡聚状态。该技术的优势在于能够在类似天然细胞膜的环境中提供膜蛋白的精确结构数据，并可用于未来的高分辨率结构解析。本实验操作将由本实验室的博士后研究员 Kyle Kroeck 演示。为了制备天然细胞膜纳米颗粒，将一克目标膜沉淀物重悬于10毫升NCMN缓冲液A中。使用玻璃Dounce匀浆器在20°C下对重悬的细胞膜样品进行匀浆，并将悬浮样品转移至一个50毫升聚丙烯管中。向样品中加入膜活性聚合物储备液和额外的NCMN缓冲液A，使膜活性聚合物的终浓度达到2.5%，并在20°C下振荡反应两小时。孵育结束后，对样品进行超速离心。 离心过程中，用25毫升NCMN缓冲液A平衡5毫升镍NTA柱。离心结束后，将上清液转移至柱上，并使用设定为0.5毫升/分钟流速的注射泵，在20摄氏度条件下将上清液加载到柱上。用足量的NCMN缓冲液B冲洗快速蛋白液相色谱仪管路，彻底清洗系统后，将柱连接至色谱仪。以1毫升/分钟的流速用30毫升NCMN缓冲液B洗涤柱，并收集穿流液。用30毫升NCMN缓冲液C以1毫升/分钟的流速洗涤层析柱，并收集穿流液。用20毫升NCMN缓冲液D以0.5毫升/分钟的流速洗脱蛋白，使用馏分收集器收集每管1毫升的样品馏分，然后将蛋白样品置于4°C保存，并通过SDS-PAGE检测与快速蛋白液相色谱洗脱图谱中观察到的峰相对应的样品。制备负染电镜载网时，将滤纸包裹在玻璃载片上，使碳膜面朝上，然后将用于样品制备的载网放置在载片上。将带有透射电镜载网的玻片放入辉光放电仪的两个电极之间的腔室内，盖上玻璃盖，确保盖子居中且密封良好。启动辉光放电仪，并确认可见由等离子体产生的紫色光。仪器运行结束后，等待腔室恢复至大气压，再打开玻璃盖，将玻片取出并放置于实验台面上。将纯化后的蛋白质样品浓度调整至约 0.1 毫克/毫升，并取 3.5 微升蛋白质样品滴加到厚度为 10 纳米的碳支持膜载网上。孵育 1 分钟后，用滤纸从透射电镜载网表面吸去液体，并用 3 微升水滴洗涤载网表面 3 次，每次使用一滴。最后一次水洗后，再用 3 微升新鲜过滤的 2% 醋酸铀溶液滴洗载网表面 2 次，每次使用一滴。最后一次醋酸铀洗涤后，用3微升新鲜过滤的2%醋酸铀液滴对载网染色1分钟。孵育结束后，使用新的滤纸条吸去液滴，并将载网在空气中干燥至少1分钟，然后存放在载网盒中以备后续使用。此处可观察到如图所示通过透射电子显微镜获得的负染图像。通过去垢剂纯化的野生型Acraflavin抗性通道蛋白B样品的负染图像显示，该溶液为均一的单一分散颗粒，蛋白呈现出结构清晰的三聚体四级结构。这些三聚体结构与纯化后观察到的尺寸排阻色谱结果一致。相比之下，同样使用去垢剂纯化的P223G突变体的负染图像中，则呈现出异质性的多分散纳米颗粒溶液，具有聚集倾向，但未观察到明显的天然三聚体结构。这些结果也得到了尺寸排阻色谱的支持。在使用膜活性聚合物 NCMNP11 进行纯化后，野生型和突变型蛋白表现出相似的结果。使用 NCMNP52 聚合物可促进生成尺寸大得多的天然细胞膜纳米颗粒，从而能够在单个天然细胞膜颗粒中对多个阿克拉弗林耐药通道蛋白 B 三聚体进行成像。然而，在突变体样品中，即使观察较大的天然细胞膜双层区域，也未观察到三聚体颗粒。对纯化蛋白样品进行SDS-PAGE分析，证实所有样品中均存在AcrB耐药蛋白，纯度超过95%，且分子量与预测值一致。当将本方案应用于其他蛋白时，需通过实验确定合适的膜组分用量，以及溶解过程的时间、时长和温度。如果样品的图像显示出具有明确结构单元的均一单分散颗粒溶液，则该样品可用于冷冻电子显微镜的高分辨率结构测定。

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Biochemistry

生物化学

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