用于膜蛋白-蛋白质相互作用分析的原生细胞膜纳米粒子系统
July 16th, 2020
这里介绍的是一个协议，用于确定膜蛋白的寡头状态，该方案利用本地细胞膜纳米粒子系统与电子显微镜配合使用。
该协议将帮助研究人员通过将天然细胞膜纳米颗粒系统与电子显微镜结合使用来更准确地确定膜蛋白的天然寡聚状态。该技术的优点是它在天然细胞膜样环境中提供了膜蛋白的准确结构数据，可用于未来的高分辨率结构测定。演示该程序的是我实验室的博士后研究员 Kyle Kroeck。
为了制备天然细胞膜纳米颗粒，将 1 克感兴趣的膜沉淀重悬于 10 毫升 NCMN 缓冲液中 A.使用玻璃 Dounce 匀浆器在 20 摄氏度下匀浆重悬的细胞膜样品，并将悬浮样品转移到 50 毫升聚丙烯管中。向样品中加入膜活性聚合物储备液和额外的 NCMN 缓冲液 A，使其终浓度为 2.5% 膜活性聚合物，并在 20 摄氏度下摇动溶液 2 小时。孵育结束时，超速离心样品。
在离心过程中，在离心结束时用 25 mL NCMN 缓冲液平衡 5 mL 镍 NTA 柱 A.At，将上清液转移到柱上，并使用设置为 0.5 mL/min 流速的注射泵在 20 °C 下将上清液加载到柱上。用足够的 NCMN 缓冲液 B 清洗快速蛋白液相色谱机管路，以完全冲洗系统并将色谱柱连接到色谱仪。用 30 mL NCMN 缓冲液 B 以每分钟 1 mL的流速洗涤色谱柱，并收集流出液。
用 30 mL NCMN 缓冲液 C 以每分钟 1 mL 的流速洗涤色谱柱，并收集流出液。用 20 毫升 NCMN 缓冲液 D 以每分钟 0.5 毫升的流速洗脱蛋白质，并使用馏分收集器收集 1 毫升馏分的样品，然后使用 SDS-PAGE 将蛋白质样品储存在 4 摄氏度下，以检查与快速蛋白质液相色谱洗脱图上观察到的峰相对应的样品。要制备负染色网格，请用滤纸包裹载玻片，碳面朝上，然后将用于样品制备的网格放在载玻片上。
将带有电子显微镜网格的载玻片放入两个电极之间的辉光放电器腔室中，然后更换玻璃盖，确保盖子居中且密封良好。运行辉光放电机，确保等离子体产生的紫光可见。机器运行完毕后，等到腔室达到大气压后，再取下玻璃盖并将载玻片放在工作台上。
将纯化的蛋白质样品的浓度调整至约 0.1 毫克/毫升，并将 3.5 微升蛋白质样品加载到 10 纳米厚的碳网格上。一分钟后，用一张滤纸去除电子显微镜网格表面的液体，并用一滴 3 微升的水洗涤网格表面 3 次。最后一次水洗后，每次洗涤用三微升新鲜过滤的 2% 乙酸铀液滴再清洗网格表面两次。
最后一次乙酸铀洗涤后，用 3 微升新鲜过滤的 2% 乙酸铀液滴对网格染色 1 分钟。孵育结束时，使用一张新滤纸去除液滴并将网格风干至少一分钟，然后将网格存放在网格盒中以备后用。在这里，可以观察到使用透射电子显微镜获得的负染色图像，如图所示。
用去污剂纯化的野生型 Acraf黄素抗性通道蛋白 B 样品的阴性染色图像显示单分散颗粒的均匀溶液，蛋白质显示出明确的三聚体四级结构。这些三聚体结构与纯化后观察到的尺寸排阻色谱图相对应。相比之下，在同样用去污剂纯化的 P223G 突变体的负染色图像中，可以观察到具有聚集倾向但无法观察到天然三聚体的多分散纳米颗粒的异质溶液。
这些结果也得到了体积排阻色谱法的支持。使用膜活性聚合物 NCMNP11 纯化后，野生型和突变型蛋白观察到相似的结果。NCMNP52聚合物的使用有助于产生更大尺寸的天然细胞膜纳米颗粒，从而允许在单个天然细胞膜颗粒中对多个 Acraf黄素抗性通道蛋白 B 三聚体进行成像。
然而，在突变体样品中，即使观察大的天然细胞膜双层斑块，也没有观察到三聚体颗粒。纯化蛋白质样品的 SDS-PAGE 分析证实所有样品中存在 Acraf黄素抗性 B，在蛋白质的预测分子量下纯度大于 95%。当为其他蛋白质修改此方案时，重要的是通过实验确定适当的膜组分量以及增溶过程的长度、时间和温度。
如果样品图像显示具有明确结构单元的单分散颗粒的均相溶液，则样品可用于冷冻电子显微镜的高分辨率结构测定。
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概述
该协议将帮助研究人员通过利用天然细胞膜纳米粒子系统和电子显微镜相结合，更准确地确定膜蛋白的天然寡聚状态。该技术在类似天然细胞膜的环境中提供膜蛋白的准确结构数据。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 结构生物学
背景
- 了解膜蛋白的寡聚状态对于阐明其功能至关重要。
- 传统方法可能无法准确反映这些蛋白质的天然环境。
- 电子显微镜提供高分辨率成像能力。
- 天然细胞膜纳米粒子为研究膜蛋白提供了更真实的背景。
研究目的
- 开发一种可靠的协议来确定膜蛋白的寡聚状态。
- 利用天然细胞膜纳米粒子进行结构分析。
- 提高从膜蛋白获得的结构数据的准确性。
使用的方法
- 从膜片中制备天然细胞膜纳米粒子。
- 使用玻璃Dounce均质器对细胞膜样品进行均质化。
- 超离心分离纳米粒子。
- 使用电子显微镜观察膜蛋白结构。
主要结果
- 成功制备了天然细胞膜纳米粒子。
- 准确确定了膜蛋白的寡聚状态。
- 通过电子显微镜获得高分辨率图像。
- 具有未来高分辨率结构确定的潜力。
结论
- 该协议提供了一种研究膜蛋白的稳健方法。
- 利用天然环境提高了结构数据的准确性。
- 未来应用可能包括各种膜蛋白的详细结构分析。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate determination of membrane protein oligomeric states is critical for target validation in drug discovery, as misinterpretation can lead to failed mechanistic hypotheses. The native cell membrane nanoparticle system preserves native lipid bilayer context, reducing artefactual dissociation or denaturation seen in detergent-based methods. This enables more reliable structural data for de-risking early-stage targets and informing lead identification strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by resolving native oligomeric states of membrane protein targets like AcrB.
- Operational Value: Provides structural clarity in a native-like environment, reducing false negatives in target validation assays.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by confirming functional quaternary structures prior to downstream investment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates stable, monodisperse nanoparticles suitable for reproducible biophysical assays.
- Operational Value: Enables standardization of membrane protein preparations across screening campaigns.
- Scalability: Facilitates preparation of large bilayer patches for imaging multiple protein complexes per particle.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage structural insights with preclinical validation by maintaining native membrane context.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed phenotypes stem from native oligomeric states rather than detergent-induced artifacts.
- Biomarker Alignment: Supports target engagement studies where oligomeric state correlates with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing structural inputs that inform hit-to-lead progression.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing native quaternary arrangements of membrane protein complexes.
- Screening: Delivers assay-ready, homogeneous protein nanoparticles for consistent compound screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of oligomeric state via electron microscopy and size exclusion chromatography.
- Translational Research: Ensures structural findings are translatable to native physiology, improving predictive confidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for membrane protein structural analysis across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target mechanism by preserving native protein-lipid interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and reduces variability in structural data generation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing biological uncertainty in early targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in membrane protein isolation and nanoparticle formation.
- Depends on access to ultracentrifugation, FPLC, and electron microscopy instrumentation.
- Necessitates standardization of buffer conditions and polymer concentrations across teams.
- Involves optimization of solubilization time, temperature, and membrane fraction for each target.
- Limited by the need for empirical determination of solubilization parameters per membrane source.
