用于植入物的金属与关节软骨对磨的生物摩擦学测试与分析

本方案可实现测试金属材料与关节软骨之间的滑动性能，从而研究局灶性植入物或半关节成形术对特定软骨细胞生物合成活性的影响。该技术的主要优势在于，能够全面揭示软骨配对中机械载荷的摩擦学特性及其生物学效应。该技术可作为膝关节局灶性金属植入物治疗骨软骨缺损或髋关节半关节成形术等外科手术后临床发现的补充。本次操作演示由我实验室来自多瑙河大学的博士后 Christopher Bauer 进行。

使用市售的往复式摩擦计，配备圆柱-平板构型、垂直加载能力以及可调节的载荷和滑动速度。此外，需要使用液体池在润滑溶液中进行测试。将骨软骨圆柱固定在底部样品夹具上，并使标记与滑动方向对齐。

首先使用压力测量膜确定钴铬钼与软骨系统之间的接触压力。将压力测量膜置于界面处，并施加30秒的静态载荷，以测定初始接触压力、接触面积和接触形状。将钴铬钼圆柱体安装到上部载荷传感器上。

将测试溶液加入液相池中，以浸没骨软骨圆柱并覆盖金属-软骨滑动界面。设置测试参数，如正常力冲程和滑动速度，并在测试过程中保持恒定。启动金属圆柱与浸没在润滑溶液中的关节软骨之间的往复滑动。

在整个实验过程中监测摩擦系数，然后终止实验。在达到预期的测试时间后，将骨软骨塞从样品 holder 中取出，用 PBS 冲洗，并在培养基中保存直至进行后续生物学分析。在测试期间，将对照样品和测试溶液置于室温下，并与经受机械载荷的样品一同进行分析。

将一个24孔板放在天平上并归零。用PBS冲洗骨软骨栓，并将其放入培养皿中。然后使用手术刀将移植物上的软骨完整地切下，再将软骨均分为两个相等的部分，使接触面积均匀分布在两块软骨上，并将其中一半切碎成约1 mm³的小块。

将后半部分用于基因表达分析，将剪碎的软骨组织转移至已准备好的24孔板中的一个孔内，并测定组织重量；对每个样本重复此过程，并向每孔加入1毫升生长培养基。向每孔加入500微升XTT溶液并混匀，然后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育4小时。孵育结束后，移除上清液并转移至5毫升离心管中。通过向每孔的软骨组织中加入500微升DMSO来提取四唑盐产物，并在室温下持续振荡1小时。移除DMSO溶液，并将其与先前收集的XTT溶液合并。

将每份样品各100微升以三复孔形式转移至96孔板中。使用酶标仪在492纳米波长下测定吸光度，并以690纳米为参考波长。为分离RNA，将从骨软骨栓获得的另一半软骨组织切碎成小块，转移至含有陶瓷珠和300微升裂解缓冲液的离心管中。

加入1% β-巯基乙醇，使用商业裂解液在6,500 RPM条件下匀浆组织，每次20秒，共进行四次，每次运行后冰浴20分钟。向每个样品中加入20 µL蛋白酶K和580 µL无RNase的水，于55 °C孵育30分钟。将样品在10,000 ×g离心3分钟，收集上清液转移至1.5 mL离心管中。

向每根试管中加入0.5倍体积的90%乙醇，混匀，然后将700微升样品转移至RNA结合柱（置于2毫升收集管中），在8,000 × g离心15秒。弃去穿流液，并对剩余的裂解液重复此离心步骤。向柱中加入350微升RW1缓冲液。

在8,000 × g条件下离心15秒，弃去流出液。取10微升DNA储备液与70微升RDD缓冲液混合，将混合液加入RNA纯化膜中，在室温下孵育15分钟，然后向柱中加入350微升RW1缓冲液。

在8,000 × g条件下离心15秒，弃去流出液；向RNA纯化柱中加入500 µL RPE缓冲液，在8,000 × g条件下离心15秒，弃去流出液；再次向RNA纯化柱中加入500 µL RPE缓冲液，然后在8,000 × g条件下离心2分钟。将柱子放入一个新的1.5 mL收集管中，加入30 µL无RNase的水，在8,000 × g条件下离心1分钟，以洗脱RNA。使用商业试剂盒将RNA反转录为cDNA：按照说明书操作，解冻并混匀所有组分，加入RNA样品，并在热循环仪中进行反应，具体条件见文稿描述。在96孔板中，每孔加入9 µL RT-qPCR预混液和1 µL cDNA，每个样本设三个复孔。用石蜡油覆盖PCR板，在4 °C、877 × g条件下离心10分钟。按照文稿中的指示，在实时定量PCR仪（RT-qPCR）和精密热循环仪中进行扩增反应。

在测试之前，必须使用压力测量膜确认金属与软骨界面的接触面积和接触压力。通过将获得的压痕图像与已知接触条件下的参考印迹进行比较，可进一步验证生理载荷条件。当接触区域发生迁移时，低摩擦系数至少可维持一小时。利用苏木精和藏红O染色可确定细胞外基质的组成与结构。

藏红花素和O染色的强度与蛋白聚糖含量成正比。蛋白聚糖含量在关节表面存在差异，但在基线样本的整个组织切片中应保持均匀，可显示糖胺聚糖的提取，而机械负荷可抵消这一提取作用。牛关节软骨细胞的代谢活性与取材部位无关，但随机械负荷增加而增强。

在生理载荷条件下，软骨特异性基因的表达水平升高；而当接触面积固定时，分解代谢基因则会上调。通过该实验流程，可进一步开展其他分析，包括软骨基质产物的测定、利用扫描电子显微镜对关节表面进行分析，此外，我们还尝试在多种摩擦学配对条件下优化关节软骨的润滑性能。