对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

原子力显微镜自动化是该技术向生物医学应用发展过程中的关键创新，同时也为研究细胞群体的生物力学特性提供了便利。我们的方法可在四小时内完成对1,000个细胞的原子力显微镜测量，而传统方法在相同时间内仅能测量10个细胞，这在时间效率上具有显著提升。

如果自动化是将该技术引入医院实验室的前提条件，那么本概念验证方案表明了其在开发特定医学诊断策略中的应用潜力。该方案使用了一种通用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）主干结构，可填充多种微生物，从而允许探索不同的系统。制备PDMS印章时，将55克PDMS预聚物溶液以10:1的质量比混合PDMS低聚物和固化剂，并在真空条件下脱气5至10分钟，压力为1×10⁻¹至1×10⁻²巴。

当所有陷阱中的气泡均被去除后，将20克脱气溶液倒入硅胶母模中，形成两到三毫米厚的液层，并再次进行脱气处理。当所有气泡完全去除后，在80摄氏度条件下交联PDMS一小时，然后使用手术刀沿可见的微结构阵列方向平行切割PDMS微结构印章。随后将印章从硅胶母模上剥离，并将印章的微结构面朝上放置于载玻片上，使微结构与载玻片边缘对齐。

为将细胞准备用于该装置，离心600微升目标细胞悬液，并将200微升上清液加入到印章上。在真空条件下脱气约40分钟。当所有气泡完全去除后，将PDMS表面的上清液替换为200微升重悬的细胞溶液，在室温下孵育15分钟。

为了将细胞加载到印章的微结构中，使用载玻片以30至50度的角度在印章表面来回涂抹细胞悬液，必要时重复数次。当微结构达到较高的填充率后，用移液器吸除细胞悬液，并用乙酸盐缓冲液每次1毫升洗涤三次，以去除未被捕获的细胞。最后一次洗涤后，使用氮气流吹干样品背面，然后将印章放入培养皿中。

然后向培养皿中加入 2 毫升新鲜的醋酸盐缓冲液。进行细胞原子力显微镜观察时，将培养皿放置在原子力显微镜的载物台上，并将载物台中心定位在零对零位置。载物台居中后，将培养皿移入显微镜的培养皿支架中，并调整印章边缘，使其与培养皿支架的 y 轴垂直。

然后将原子力显微镜的探头放置到载物台上，注意确保步进电机充分伸展，以避免探头尖端撞击到印模。成像时，使用显微镜旋钮将原子力显微镜探头对准 4.5 × 4.5 平方微米孔阵列的左上角，并在显微镜软件中选择力映射模式。为在 100 × 100 微米区域内设置 64 × 64 的力图谱，需将相对设定点设为 3 至 5 纳牛，Z 长度设为 4 微米，Z 方向运动设为恒定持续时间，伸出时间设为 0.01 秒，伸出延迟设为零，回缩延迟设为零，延迟模式设为恒力模式，采样率设为 2048 赫兹。

取消勾选 Z 闭环，勾选方形图像。将快速轴设置为 100 微米，慢速轴设置为 100 微米，X 偏移设置为 0 微米，Y 偏移设置为 0 微米，网格角度设置为 0 度，像素设置为 64 × 64，像素比设置为 1:1。接下来打开自动化软件。

在弹出窗口中，选择指向脚本文件的路径。在 gyfon 脚本的输入框部分，将 W1 坐标值输入至 P1 变量的第 239 行，将 W2 坐标值输入至 P2 变量的第 241 行。将螺距值赋给脚本中第 245 行的 pitch 变量，并将可通过井位图案设计确定的井尺寸输入至第 248 行的 W-S 变量。

在第251行中输入保存目录的路径，以将数据保存至指定位置，并在第254行将总面积变量设置为所需数值（单位为100微米的倍数）。然后，在第257行的扫描次数变量中设置每个孔记录的力曲线矩阵的行数和列数，点击运行以启动程序。为分析数据，请使用Video Studio Code软件打开Python脚本，并执行复制文件Python脚本，将力曲线文件整理到一个文件夹中。

输入用于存储数据的通用文件夹路径。为分析力曲线，请打开原子力显微镜制造商提供的数据处理软件。在文件菜单中，选择光谱曲线批量处理选项。

接下来选择文件并加载流程，然后选择刚度处理流程。选择该流程的最后一步，点击“保留并应用于全部”，以确保所有力曲线都经过相同的处理。要打开R脚本，请将通过数据处理软件提取出的信息所存储的文件加载到R Studio软件中。

在环境窗口中，单击导入数据集，然后在弹出窗口的文本读取器中单击浏览，以定位点 TSV 文件。文件加载后，选择代码运行区域并运行全部代码，以执行所有代码。此处展示了使用本方案所获得的典型直方图。

在此分析中，记录了957个原代细胞的刚度分布，而在此分析中，测量了574个卡泊芬净处理细胞的刚度。需要注意的是，使用数百个细胞可观察到数值的双峰分布；而在较小的样本中，通常仅观察到单一分佈，可能导致无法检测到细胞群体的异质性。

两种条件的对比凸显了卡泊芬净在降低细胞刚性方面的作用。通过对方差分析（ANOVA）比较天然细胞与处理后细胞的结果显示，这两种条件下的细胞刚性存在极显著差异。该结论的得出得益于所分析细胞数量众多，从而提高了实验结果的可信度。

在将上清液加入PDMS印章后，反复冲洗细胞至印章的所有孔中直至填满，这对分析的成功至关重要。在此概念验证实验中，分析了白色念珠菌细胞，但该方案可应用于任何类型的图案化细胞、分子或材料。