Name: 数百个 C.白化病 细胞生物原子力显微镜测量自动化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 了解原子力显微镜自动化测量技术，通过PDMS微结构固定微生物，可在四小时内完成数百个细胞的力学特性检测。该方法显著提升通量，适用于微生物生物力学研究及潜在医学诊断策略开发。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）下属的FONCYCYT、法国外交部以及巴黎第十三大学为名为“用于诊断的纳米触诊”的国际协作ECOS-NORD项目（编号：263337（墨西哥）和MI5P02（法国））提供的资金支持。AMR感谢墨西哥国立理工学院SIP项目（编号：20195489）提供的经费支持。SPC获得墨西哥国家科学技术委员会（CONACYT）博士奖学金（编号：288029）以及通过墨西哥国立理工学院（IPN）与图卢兹第三大学（UPS）联合培养协议提供的支持，以获得双博士学位证书（IPN-UPS）。ED和CFD为法国国家科学研究中心（CNRS）的研究人员。

1. 微生物细胞培养
<ol>
	<li>从甘油保存液中复苏细胞。 
	注意：C. albicans 以甘油保存液形式储存在 -80 °C 的小瓷珠上。
	<ol>
		<li>取一支 -80 °C 保存的小瓷珠，在酵母浸膏蛋白胨葡萄糖（YPD）琼脂平板上轻轻涂抹，于 30 °C 培养 2 天，然后进行液体培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备液体培养物。
	<ol>
		<li>在培养管中加入 5 mL 无菌 YPD 液体培养基，并接种一单菌落的 C. albicans 细胞（来自 YPD 琼脂平板培养）。</li>
		<li>于 30 °C 静置培养 20 小时，随后通过离心（4000 × g，5 分钟）收集细胞。弃去上清液，并作为生物危害废物处理。</li>
		<li>用 10 mL 醋酸盐缓冲液（8 mM 醋酸钠、1 mM CaCl2、1 mM MnCl2，pH 5.2）将菌体沉淀洗涤两次，每次洗涤后均进行离心（4000 × g，5 分钟）。</li>
		<li>将菌体沉淀重悬于 2 mL 醋酸盐缓冲液中，用于后续将细胞固定在 PDMS 印模上。 
		注意：该悬液不可保存，应于第 3 节实验前新鲜配制。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. PDMS印章制备
<ol>
	<li>硅胶母模制备
	<ol>
		<li>使用计算机辅助设计（CAD）软件绘制所需的微结构。 
		注意：设计的微孔尺寸应与待捕获的微生物大小相近。设计应提供至少100 × 100的微孔阵列。最好围绕微生物的平均尺寸制作多个略有不同尺寸的阵列。</li>
		<li>若有洁净室条件，可参照先前发表的方案12中的步骤2至12进行操作；否则，可从商业洁净室服务中获取硅胶母模。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>PDMS印章成型
	<ol>
		<li>准备55 g PDMS预聚物溶液，其中PDMS低聚物与固化剂按质量比10:1混合（材料表）。</li>
		<li>在真空条件下（压力范围为10-1-10-2 bar）混合并脱气，直至PDMS溶液中所有气泡完全去除（5−10分钟）。</li>
		<li>将20 g脱气后的溶液倒入硅胶母模中，并再次进行脱气处理（压力范围为10-1-10-2 bar）。 
		注意：印章厚度应约为2−3 mm。</li>
		<li>当所有气泡完全去除后，在80 °C下交联固化PDMS 1小时。</li>
		<li>使用手术刀将PDMS微结构印章切割成0.5 × 1.5 cm2大小，切割方向应与可见的微结构阵列方向平行。</li>
		<li>将印章从硅胶母模上剥离。</li>
		<li>将印章翻转，使微结构朝上，并将其放置于载玻片上。确保微结构面朝上，远离载玻片表面。将印章上可见的微结构与载玻片边缘对齐，以便后续作为原子力显微镜（AFM）自动化程序的参考基准。 
		注意：此时PDMS印章已可用于细胞固定。PDMS印章可存放于硅胶母模中保存数月。当母模上的PDMS全部用尽后，可再次在其上浇铸新的PDMS印章（为保护母模安全，可用聚氨酯复制母模）14。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品制备
<ol>
	<li>细胞固定
	<ol>
		<li>将重悬的细胞溶液600 µL进行离心（500 × g，5分钟），以分离缓冲液与细胞。</li>
		<li>用移液器将步骤3.1.1中的200 µL上清液转移至PDMS印章表面，并在真空条件下（压力范围为10-1-10-2 bar）脱气约40分钟。 
		注意：此步骤对于提高细胞在微孔内的固定效果至关重要。上清液中含有的酵母细胞壁分子可能在预润湿过程中沉积于PDMS表面，这些分子很可能增强细胞的黏附性，从而提高印章的填充率。</li>
		<li>40分钟后，用移液器将PDMS表面的缓冲液移除，并用移液器加入200 µL步骤1.2.4中的细胞溶液，在室温下孵育15分钟。</li>
		<li>通过对流/毛细作用将细胞装入印章的微结构中。具体操作为：使用载玻片以30至50°的角度在两个方向上手动将200 µL细胞悬液均匀涂布于印章表面。可能需要多次重复该操作以实现较高的填充率。 
		注意：该方法的完整描述可参见文献13。</li>
		<li>用移液器移除细胞悬液。用1 mL pH 5.2的乙酸盐缓冲液洗涤印章3次，以去除未被捕获的细胞。</li>
		<li>使用氮气流吹干印章背面，以确保印章能够牢固地粘附于干燥的培养皿表面。</li>
		<li>最后将载有细胞的PDMS印章置于培养皿中（材料表），并加入2 mL乙酸盐缓冲液，以维持细胞处于液体环境中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将印章安装至原子力显微镜（AFM）载物台
	<ol>
		<li>开始AFM操作时，将载物台中心定位至0:0位置。</li>
		<li>按照Unsay等人的描述，在玻璃表面和水中对悬臂的灵敏度和弹簧常数进行校准15。</li>
		<li>取出装有印章的培养皿，并将其放置于AFM专用的培养皿支架中。</li>
		<li>调整印章边缘，使其与培养皿支架的Y轴方向垂直。 
		注意：如图1所示，倾斜角度应小于5°为宜。</li>
		<li>将AFM探头装置放置到载物台上，并确保步进电机充分伸展，以避免探针撞击到印章表面。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 运行原子力显微镜程序
注意：原子力显微镜（AFM）程序作为补充材料提供（AutomatipSoftware2019.pdf）。该程序需要配备电动载物台和 JPK 桌面软件版本 4.3 的 JPK-Bruker AFM Nanowizard II 或 III 系统。该程序基于 Jython（基于 Python 2.7 版本）开发。
<ol>
	<li>数据采集
	<ol>
		<li>使用原子力显微镜（AFM）光学显微镜，将AFM探针尖端定位在4.5 × 4.5 µm2 微孔的左上角（对应于细胞尺寸）。若需使用其他尺寸的微孔，则将探针定位在目标微孔的左上角。</li>
		<li>在100 × 100 µm² 区域上执行64 × 64点的力图谱采集（Z范围 = 4 µm，探针速度 = 90 µm·s-1，施加力为3至5 nN）。从“测量模式”下拉菜单中选择“力图谱”模式。在力控制图谱面板中输入以下参数：相对设定值（Rel. Setpoint）= 3至5 nN；z长度 = 4 µm；Z运动方式：恒定持续时间；伸出时间：0.01 s；伸出延迟：0；回缩延迟：0；延迟模式：恒力模式；采样率：2048 Hz；Z闭环：取消勾选；网格：勾选“方形图像”，快速轴：100 µm，慢速轴：100 µm，X偏移：0 µm；Y偏移：0 µm；网格角度：0度；像素：64×64；像素比：1:1 
		注：典型结果如图2所示。该图像可用于测量并验证两个微孔之间的间距。</li>
		<li>记录左上角微孔（W1）和左下角微孔（在图2中称为W2）中心的坐标。操作方法为：在微孔周围绘制一个方形框，框的中心坐标将显示在AFM软件左侧面板的x、y坐标框中。</li>
		<li>打开自动化软件（Automatip_scan.py）：在JPK桌面软件中，点击顶部菜单栏的“Advance”（高级），然后选择“Open Script”（打开脚本）。在弹出的窗口中，选择指向补充数据中提供的脚本文件（Automatip_scan.py）的路径。</li>
		<li>在Jython脚本的“Inputs box”（输入框）部分（图&#160;3）中输入W1和W2的坐标值。将W1的坐标输入脚本第239行的P1变量，将W2的坐标输入第241行的P2变量。 
		注：所选作为初始坐标的微孔（W1和W2）不应过于靠近扫描区域边缘，否则中心定位算法将无法正确执行，因为该算法需要测量微孔两侧PDMS表面的高度。示例见图4。</li>
		<li>将测得的间距值赋给脚本第245行的pitch变量。</li>
		<li>在脚本第248行的Ws变量中输入微孔尺寸。该尺寸由微孔图案设计决定，也可在用于验证间距的同一图像中进行确认（图2）。</li>
		<li>在第251行中输入保存目录的路径，以便将数据保存至指定位置。</li>
		<li>将totalArea变量（第254行）设置为100 µm的期望倍数&#34;n&#34;（即所用AFM的最大扫描面积）。可通过该值和间距计算将被探测的微孔总数：最大扫描面积/间距 × n2。 
		注：在图3的示例中，将分析9个100 × 100 µm2 的区域。</li>
		<li>在numScans变量（第257行）中设置每个微孔采集的力曲线矩阵的行数和列数（如3,3或4,4）。 
		注：在图&#160;3的示例中，每个微孔将记录一个3 × 3 = 9条力曲线的矩阵。</li>
		<li>运行程序，点击Start（开始）按钮。 
		注：程序首先自动执行一个中心定位算法，以更精确地确定W1和W2微孔的中心（步骤1）。然后自动在第一个扫描区域的每个微孔上采集力曲线（FCs）矩阵（步骤2）。当该区域所有微孔探测完成后，脚本将自动将AFM探针移动至下一个扫描区域的第一个微孔。探针被抬升，显微镜载物台移动至下一区域，探针再次接近样品表面，中心定位算法重新执行，以自动重新定位到该区域的第一个微孔（1'）（步骤3）。第一个区域由用户定义，第二个区域位于其右侧，依此类推，直至达到n；n+1区域位于n下方，n+2位于n+1左侧，依此类推，直至达到2n；2n+1位于2n下方，2n+2位于2n右侧，依此类推。总体上，探针以蛇形路径遍历整个区域。步骤2和3将自动重复，直至完成总共&#34;n2&#34;个扫描区域的探测。图5展示了该程序的流程图。程序完成约需4小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>数据分析
	<ol>
		<li>运行&#34;Copy files&#34; Python脚本（Copy_files_L.py，提供于补充数据中），将力曲线文件整理至同一文件夹。该脚本使用Python 2.7和SciPy模块开发。使用Visual&#160;Studio Code软件打开该Python脚本。输入主文件夹路径（补充数据中脚本第67&#160;行）以及存储位置（第73行）。</li>
		<li>打开AFM设备制造商提供的数据处理软件以分析力曲线。在顶部菜单File（文件）中，选择打开“batch of spectroscopy curves”（光谱曲线批处理）。</li>
		<li>在批处理窗口中，选择补充数据中提供的处理流程（StiffnessProcess.jpk-proc-force）。选择流程的最后一步，然后点击Keep and Apply to All（保留并应用于全部）。所有力曲线将接受相同的处理。 
		注：该处理流程使用力曲线文件中的校准数据，将偏转曲线转换为以牛顿为单位的力曲线；应用数据平滑算法（连续3个点的平均值）；将基线平移至零轴；外推接触点，并将力曲线偏移使接触点位于坐标(0,0)；从力曲线中扣除悬臂梁弯曲量，并拟合回撤段斜率。数据处理结束后，软件生成一个包含每条力曲线信息的表格，内容包括：曲线名称、杨氏模量、接触点、黏附力、斜率等。</li>
		<li>对所有实验重复步骤4.2.1至4.2.3。注意将数据保存在不同的文件夹中（例如：“…\TREATED\”和“…\UNTREATED\”）。</li>
		<li>使用补充数据中提供的R脚本绘制直方图和箱线图，并进行ANOVA统计分析。
		<ol>
			<li>使用R Studio软件打开R脚本（DataAnalisys.R），并加载由数据处理软件提取的信息文件（.tsv格式）。</li>
			<li>在环境窗口中，使用Import Dataset（导入数据集）按钮，从列表中选择from text (readr)（从文本导入），在新窗口中点击Browser（浏览）按钮，选择相应的.tsv文件。</li>
			<li>文件加载完成后，选择要纳入分析的列（如刚度和黏附力）。按Ctrl+Alt+R运行全部代码。 
			注：该脚本适用于4个数据集，假设有两组实验，每组均包含未处理和处理的细胞。可分段执行脚本代码，观察变量随函数执行的变化情况。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cross, S. E., Jin, Y. S., Rao, J., Gimzewski, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+analysis+of+cells+from+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical analysis of cells from cancer patients.</a> Nature Nanotechnology. 2 (12), 780-783 (2007).</li>
<li>Dague, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+and+electron+microscopic-based+study+of+sarcolemmal+surface+of+living+cardiomyocytes+unveils+unexpected+mitochondrial+shift+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Atomic force and electron microscopic-based study of sarcolemmal surface of living cardiomyocytes unveils unexpected mitochondrial shift in heart failure.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 162-172 (2014).</li>
<li>Muller, D. J., Helenius, J., Alsteens, D., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+probing+surfaces+of+living+cells+to+molecular+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Force probing surfaces of living cells to molecular resolution.</a> Nature Chemical Biology. 5 (6), 383-390 (2009).</li>
<li>Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+to+Explore+Electroporation+Effects+on+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Electroporation%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy to Explore Electroporation Effects on Cells.</a> Handbook of Electroporation. , 1-13 (2016).</li>
<li>Puntheeranurak, T., Neundlinger, I., Kinne, R. K. H., Hinterdorfer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+recognition+force+spectroscopy+of+transmembrane+transporters+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-molecule recognition force spectroscopy of transmembrane transporters on living cells.</a> Nature Protocols. 6 (9), 1443-1452 (2011).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+the+effects+of+antibiotics+and+CX1+on+a+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug-resistant+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of the effects of antibiotics and CX1 on a Pseudomonas aeruginosa multidrug-resistant strain.</a> Scientific Reports. 2, (2012).</li>
<li>Pillet, F., Chopinet, L., Formosa, C., Dague, É <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+and+pharmacology%3A+From+microbiology+to+cancerology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy and pharmacology: From microbiology to cancerology.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1840 (3), 1028-1050 (2014).</li>
<li>Wu, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+methods+to+assess+cell+mechanical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of methods to assess cell mechanical properties.</a> Nature Methods. 15 (7), 491-498 (2018).</li>
<li>Rigato, A., Rico, F., Eghiaian, F., Piel, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Mechanical+Mapping+of+Micropatterned+Cells+Shows+Adhesion+Geometry-Dependent+Mechanical+Response+on+Local+and+Global+Scales%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Mechanical Mapping of Micropatterned Cells Shows Adhesion Geometry-Dependent Mechanical Response on Local and Global Scales.</a> ACS Nano. 9 (6), 5846-5856 (2015).</li>
<li>Favre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+AFM+imaging+and+force+spectroscopy+using+two-dimensional+probe+arrays+for+applications+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Recognition%22%5BJournal%5D)">Parallel AFM imaging and force spectroscopy using two-dimensional probe arrays for applications in cell biology.</a> Journal of Molecular Recognition. 24 (3), 446-452 (2011).</li>
<li>Dujardin, A., Wolf, P. D., Lafont, F., Dupres, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+multi-sample+acquisition+and+analysis+using+atomic+force+microscopy+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated multi-sample acquisition and analysis using atomic force microscopy for biomedical applications.</a> PLOS ONE. 14 (3), 0213853(2019).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+living+cell+arrays+for+atomic+force+microscopy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of living cell arrays for atomic force microscopy studies.</a> Nature Protocols. 10 (1), 199-204 (2015).</li>
<li>Proa-Coronado, S., Séverac, C., Martinez-Rivas, A., Dague, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+the+paradigm+of+nanomechanical+measurements+on+cells+using+AFM%3A+an+automated+methodology+to+rapidly+analyse+thousands+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Horizons%22%5BJournal%5D)">Beyond the paradigm of nanomechanical measurements on cells using AFM: an automated methodology to rapidly analyse thousands of cells.</a> Nanoscale Horizons. , (2019).</li>
<li>Foncy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+polyurethane+and+epoxy+resist+master+mold+for+nanoscale+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Microelectronic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Comparison of polyurethane and epoxy resist master mold for nanoscale soft lithography.</a> Microelectronic Engineering. 110, 183-187 (2013).</li>
<li>Unsay, J. D., Cosentino, K., García-Sáez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscopy+Imaging+and+Force+Spectroscopy+of+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52867(2015).</li>
<li>Schiavone, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combined+chemical+and+enzymatic+method+to+determine+quantitatively+the+polysaccharide+components+in+the+cell+wall+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts.</a> FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).</li>
<li>Formosa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+Effects+of+Caspofungin+against+Two+Yeast+Species%2C+Saccharomyces+cerevisiae+and+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Nanoscale Effects of Caspofungin against Two Yeast Species, Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (8), 3498-3506 (2013).</li>
<li>El-Kirat-Chatel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+analysis+of+caspofungin-induced+cell+surface+remodelling+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Nanoscale analysis of caspofungin-induced cell surface remodelling in Candida albicans.</a> Nanoscale. 5 (3), 1105-1115 (2013).</li>
<li>Peric, O., Hannebelle, M., Adams, J. D., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+bacterial+traps+for+simultaneous+fluorescence+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Research%22%5BJournal%5D)">Microfluidic bacterial traps for simultaneous fluorescence and atomic force microscopy.</a> Nano Research. 10 (11), 3896-3908 (2017).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该方法学带来的主要改进是在确定的时间内显著增加了被测量细胞的数量。其代价是每个细胞测量的点数有所减少。这意味着该方法并不适用于对单个细胞进行详细分析。该方法仅适用于能够容纳于PDMS印章微孔中的细胞。该印章具有较高的通用性，其微孔尺寸范围从1.5 × 1.5 µm2 到6 × 6 µm2。然而，仍无法固定杆菌或更大的细胞。此外，该印章及毛细管对流沉积法不能用于固定尺寸大得多的哺乳动物细胞（长度约100 µm）。
在此背景下，Peric 等人19开发了一种智能微流控装置，用于在特定位置和生理条件下固定大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等芽孢杆菌。将软件适配于该装置的特定尺寸将非常有意义。
在该自动化系统中，枪头污染也可能成为一个问题。对于微生物细胞而言，这种情况并不常见，但在哺乳动物细胞实验中则尤为重要。Dujardin 等人<sup cla...

本研究提供了一种利用原子力显微镜（AFM）对数百个活细胞进行自动力学测量的方法。同时，还提供了一种将微生物固定在聚二甲基硅氧烷（PDMS）微结构印章上的方法，该方法适用于在液体环境中进行的AFM实验。
生物原子力显微镜（Bio-AFM）是一种专为生物学应用而设计的高度专业化技术，随后被用于研究活细胞。该技术需要经过专门培训的工程师，每次仅能分析一个细胞。在此条件下，可分析的不同细胞数量相当有限，通常在4至5小时内仅能分析5到10个细胞。然而，在单个细胞上记录的力测量数据量通常非常大，可轻松达到1000次。因此，当前对活细胞进行原子力显微镜力测量的研究范式是：在有限数量的细胞上记录数百条力曲线（FCs）。
从统计学角度来看，这种方法存在疑问，并引发了样本代表性的难题。例如，即使对少数细胞记录了数百次测量数据，也很难仅凭这些少量细胞来评估细胞群体的异质性。然而，正是基于这一范式，生物物理学、微生物学和纳米医学领域取得了重大进展1,2,3。事实上，在单细胞尺度上进行的纳米级分析，已为细胞纳米力学、跨膜蛋白的组织方式以及抗菌或抗癌药物的作用机制提供了新的信息4,5,6,7。然而最近，多种针对细胞的高通量生物力学检测技术相继出现8，反映出科学界希望改变这一范式并获取细胞群体异质性信息的浓厚兴趣。这些检测均依赖于微流控系统，通过使细胞在应力作用下发生形变，并光学测量其形变程度，从而间接获得细胞整体表面弹性的评估8。然而，这些方法存在一个重要问题：它们是单参数的，只能探测细胞的弹性。此外，这些方法无法测量贴壁细胞的力学参数，这在研究非循环的哺乳动物细胞或生物膜等情况下可能具有局限性。
S. Scheuring9 和 M. Favre10 的研究团队已开发出基于原子力显微镜（AFM）的研究方法。Scheuring 等人将细胞固定在纤连蛋白图案上9，迫使单个细胞呈现图案的形状9。随后，该团队对少量细胞的力学特性进行映射，获得代表14至18个细胞的平均数据。Farve 等人开展的研究则致力于通过并行化 AFM 悬臂梁实现测量的多重化10。据我们所知，这一在多重化方向上的工作尚未实现对活细胞的测量。
Dujardin 团队提出了一种有趣的方法，即使用一种能够识别细胞并对其在定制微孔底部进行成像的自动化原子力显微镜。尽管该方法无法用于分析大量细胞群体，但它可在每个微孔中自动测试不同的实验条件11。
本研究的目标更具雄心，因为我们希望测量至少1000个细胞，目的不是获得一个平均意义上的细胞特性，而是相反，旨在揭示细胞之间的异质性。我们在此提出的利用原子力显微镜（AFM）研究细胞群体异质性的策略，基于对数百个细胞进行分析，每个细胞仅采集有限数量的力曲线。与传统的在少量细胞上采集大量力曲线的方法相比，该方法应被视为一种互补手段，因其提供的信息类型不同。事实上，传统方法可用于探测单个细胞表面的异质性，而采用我们的方法，则能够获取整个细胞群体的异质性信息。为实现这一目标，我们结合了一种将微生物（此处为酵母菌 Candida albicans）直接固定于PDMS微结构印章孔洞中的方法12，并开发了一套原创程序，可自动控制AFM探针从一个细胞移动到另一个细胞13，并对每个细胞的力学性质进行测量。

<table><tbody><tr><td>原子力显微镜悬臂梁</td><td>Bruker AFM 探针</td><td>MLCT</td><td>所使用的悬臂梁标记为&amp;ldquo;C&amp;rdquo;，其共振频率为 7 至 10 kHz，k：0.01 N/m</td></tr><tr><td>原子力显微镜数据分析</td><td>JPK-Bruker</td><td>JPK 数据处理软件版本最低 5.1.8</td><td>可通过 JPK-Bruker 用户账户下载</td></tr><tr><td>原子力显微镜用培养皿</td><td>WPI</td><td>FluoroDish FD35-100</td><td>加热器用于监测实验过程中的温度变化</td></tr><tr><td>原子力显微镜（AFM）</td><td>JPK-Bruker</td><td>Nanowizard II 或 III</td><td>原子力显微镜应安装在带有电动载物台的倒置光学显微镜上</td></tr><tr><td>卡泊芬净</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0425-5MG</td><td>卡泊芬净使用浓度为 4 倍最低抑菌浓度（MIC）</td></tr><tr><td>代码编辑器</td><td>Microsoft</td><td>Visual Studio Code 版本 1.40.1</td><td>https://code.visualstudio.com/</td></tr><tr><td>冷冻珠</td><td>IFU</td><td>CB12</td><td></td></tr><tr><td>干燥器/脱气室</td><td>Fisherbrand</td><td>15594635</td><td>该设备用于对 PDMS 印模进行约 50 分钟的脱气处理，任何配备真空泵的干燥器均可使用</td></tr><tr><td>培养皿加热器</td><td>JPK-Bruker</td><td>PetriDishHeater</td><td>这是 JPK/Bruker 原子力显微镜的附加组件。加热器用于监测实验过程中的温度变化</td></tr><tr><td>乙酸钠缓冲液 pH 5.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7899</td><td>溶液包含 18 mM 乙酸钠、1 mM CaCl₂ 和 1 mM MnCl₂。用冰乙酸调节 pH 值。该溶液可在 4 &amp;deg;C 下保存 2 个月</td></tr><tr><td>统计分析语言</td><td>https://www.r-project.org</td><td>R 版本 3.6.1</td><td>R 是一种用于统计计算和图形的语言与环境，属于 GNU 项目，与 S 语言和环境类似</td></tr><tr><td>统计分析软件</td><td>https://rstudio.com</td><td>R Studio 版本 1.1.463</td><td>由 R 基金会、RStudio、Microsoft、TIBCO、Google、Oracle、HP 等共同协作开发。RStudio 和 Shiny 是开放获取统计学基金会的关联项目</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761028</td><td>聚二甲基硅氧烷（PDMS）及其固化剂套装</td></tr><tr><td>酵母胨葡萄糖肉汤培养基</td><td>Difco</td><td>242820</td><td></td></tr><tr><td>YPD 琼脂</td><td>Difco</td><td>DF0427-17-6</td><td></td></tr></tbody></table>

对数百个c. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

本文介绍的方法旨在实现生物原子力显微镜（Bio-AFM）实验及力曲线记录的自动化。利用该方法，可在4小时内自动完成对1000个细胞的力曲线采集。为保持4小时的分析时长，每个细胞采集的力曲线数量被减少至9条或16条。该方法结合了一个基于Jython的程序和一种将细胞组装到特定图案上的策略。该程序可在商用Bio-AFM系统上运行，能够自动将探针定位至阵列中第一个细胞的中心，随后在记录每个细胞力曲线的同时，自动逐个移动至下一个细胞。通过该方法，可获取细胞的生物物理参数，例如其刚度、黏附特性等。借助自动化操作以及对大量细胞的分析，研究人员能够获得细胞群体的行为特征。这一进展在Bio-AFM领域具有突破性意义，因为此前该领域的数据通常仅基于数十个细胞的记录。

我们采用所述方案分析了卡泊芬净对机会性人类病原真菌C. albicans酵母形态下生物物理特性的影响。当其他药物因真菌细胞对药物产生耐药机制而失效时，卡泊芬净是一种最后选择的抗真菌分子。其作用机制基于抑制负责β-葡聚糖合成的fks1/Fks2复合物中的Fks2亚基。由于β-葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分16,17，我们预期细胞壁的生物物理特性（如刚性和黏附性）会发生改变。
图6展示了应用上述完整实验方案后获得的典型直方图。红色直方图代表在957个天然细胞上记录的刚度分布，蓝色直方图代表在574个经卡泊芬净处理的细胞上记录的刚度分布。一个值得注意的初步观察结果是，两个直方图均呈现出双峰分布特征。这一现象的发现得益于我们对数百个细胞进行了测量；若样本量较小，研究者通常仅能观察到单一分布，从而忽略细胞群体的异质性。17,<sup...

本方案旨在对数百个微生物细胞实现原子力显微镜（AFM）测量的自动化。首先，将微生物固定在PDMS印章微结构中，随后对数百个固定的细胞自动进行力谱测量。

对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

本文提出的方法旨在实现生物原子力显微镜（Bio-AFM）实验及力曲线记录的自动化。利用该方法，可记录……

原子力显微镜自动化是该技术向生物医学应用发展过程中的关键创新，同时也为研究细胞群体的生物力学特性提供了便利。我们的方法可在四小时内完成对1,000个细胞的原子力显微镜测量，而传统方法在相同时间内仅能测量10个细胞，这在时间效率上具有显著提升。如果自动化是将该技术引入医院实验室的前提条件，那么本概念验证方案表明了其在开发特定医学诊断策略中的应用潜力。该方案使用了一种通用的聚二甲基硅氧烷（PDMS）主干结构，可填充多种微生物，从而允许探索不同的系统。制备PDMS印章时，将55克PDMS预聚物溶液以10:1的质量比混合PDMS低聚物和固化剂，并在真空条件下脱气5至10分钟，压力为1×10⁻¹至1×10⁻²巴。当所有陷阱中的气泡均被去除后，将20克脱气溶液倒入硅胶母模中，形成两到三毫米厚的液层，并再次进行脱气处理。当所有气泡完全去除后，在80摄氏度条件下交联PDMS一小时，然后使用手术刀沿可见的微结构阵列方向平行切割PDMS微结构印章。随后将印章从硅胶母模上剥离，并将印章的微结构面朝上放置于载玻片上，使微结构与载玻片边缘对齐。为将细胞准备用于该装置，离心600微升目标细胞悬液，并将200微升上清液加入到印章上。在真空条件下脱气约40分钟。当所有气泡完全去除后，将PDMS表面的上清液替换为200微升重悬的细胞溶液，在室温下孵育15分钟。为了将细胞加载到印章的微结构中，使用载玻片以30至50度的角度在印章表面来回涂抹细胞悬液，必要时重复数次。当微结构达到较高的填充率后，用移液器吸除细胞悬液，并用乙酸盐缓冲液每次1毫升洗涤三次，以去除未被捕获的细胞。最后一次洗涤后，使用氮气流吹干样品背面，然后将印章放入培养皿中。然后向培养皿中加入 2 毫升新鲜的醋酸盐缓冲液。进行细胞原子力显微镜观察时，将培养皿放置在原子力显微镜的载物台上，并将载物台中心定位在零对零位置。载物台居中后，将培养皿移入显微镜的培养皿支架中，并调整印章边缘，使其与培养皿支架的 y 轴垂直。然后将原子力显微镜的探头放置到载物台上，注意确保步进电机充分伸展，以避免探头尖端撞击到印模。成像时，使用显微镜旋钮将原子力显微镜探头对准 4.5 × 4.5 平方微米孔阵列的左上角，并在显微镜软件中选择力映射模式。为在 100 × 100 微米区域内设置 64 × 64 的力图谱，需将相对设定点设为 3 至 5 纳牛，Z 长度设为 4 微米，Z 方向运动设为恒定持续时间，伸出时间设为 0.01 秒，伸出延迟设为零，回缩延迟设为零，延迟模式设为恒力模式，采样率设为 2048 赫兹。取消勾选 Z 闭环，勾选方形图像。将快速轴设置为 100 微米，慢速轴设置为 100 微米，X 偏移设置为 0 微米，Y 偏移设置为 0 微米，网格角度设置为 0 度，像素设置为 64 × 64，像素比设置为 1:1。接下来打开自动化软件。在弹出窗口中，选择指向脚本文件的路径。在 gyfon 脚本的输入框部分，将 W1 坐标值输入至 P1 变量的第 239 行，将 W2 坐标值输入至 P2 变量的第 241 行。将螺距值赋给脚本中第 245 行的 pitch 变量，并将可通过井位图案设计确定的井尺寸输入至第 248 行的 W-S 变量。在第251行中输入保存目录的路径，以将数据保存至指定位置，并在第254行将总面积变量设置为所需数值（单位为100微米的倍数）。然后，在第257行的扫描次数变量中设置每个孔记录的力曲线矩阵的行数和列数，点击运行以启动程序。为分析数据，请使用Video Studio Code软件打开Python脚本，并执行复制文件Python脚本，将力曲线文件整理到一个文件夹中。输入用于存储数据的通用文件夹路径。为分析力曲线，请打开原子力显微镜制造商提供的数据处理软件。在文件菜单中，选择光谱曲线批量处理选项。接下来选择文件并加载流程，然后选择刚度处理流程。选择该流程的最后一步，点击“保留并应用于全部”，以确保所有力曲线都经过相同的处理。要打开R脚本，请将通过数据处理软件提取出的信息所存储的文件加载到R Studio软件中。在环境窗口中，单击导入数据集，然后在弹出窗口的文本读取器中单击浏览，以定位点 TSV 文件。文件加载后，选择代码运行区域并运行全部代码，以执行所有代码。此处展示了使用本方案所获得的典型直方图。在此分析中，记录了957个原代细胞的刚度分布，而在此分析中，测量了574个卡泊芬净处理细胞的刚度。需要注意的是，使用数百个细胞可观察到数值的双峰分布；而在较小的样本中，通常仅观察到单一分佈，可能导致无法检测到细胞群体的异质性。两种条件的对比凸显了卡泊芬净在降低细胞刚性方面的作用。通过对方差分析（ANOVA）比较天然细胞与处理后细胞的结果显示，这两种条件下的细胞刚性存在极显著差异。该结论的得出得益于所分析细胞数量众多，从而提高了实验结果的可信度。在将上清液加入PDMS印章后，反复冲洗细胞至印章的所有孔中直至填满，这对分析的成功至关重要。在此概念验证实验中，分析了白色念珠菌细胞，但该方案可应用于任何类型的图案化细胞、分子或材料。

automation-bio-atomic-force-microscope-measurements-on-hundreds-c

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

数百个 C.白化病 细胞生物原子力显微镜测量自动化

本文中，我们描述了如何利用自动扫描共聚焦显微镜，从固定在表面的单个DNA分子获得FRET轨迹。...

用于表面固定生物分子单分子荧光测量的自动化系统

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

我们描述了一种用于追踪由胞内细菌引发的内膜系统破裂的方法 志贺氏菌 福氏 和 结核分枝杆菌...

由胞内病原体引起的液泡破裂的单细胞测量

我们提供了一种简单的实验方案，用于获取酵母细胞生长过程的荧光显微镜视频，以及一个基于图形用户界面的软件包，用于提取单细胞时间序列数据。该分析方法结合了自动化的谱系追踪与分裂时间分配，并整合了可视化检查及对追踪数据的手动校正。...

获取芽殖酵母荧光延时成像并利用GRAFTS分析单细胞动态

本文描述了用于量化贴壁细胞与微结构基底之间机械相互作用的实验方案。这些相互作用与细胞迁移、增殖、分化和凋亡等基本细胞行为密切相关。本方案介绍了一款名为 MechProfiler...

微柱阵列上简便而精确的力学表征

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。...

高分辨率成像与分析酿酒酵母中单个星体微管的动力学行为

该技术描述了一种用于测量多糖荚膜和菌体半径的自动化批量图像处理程序。尽管该程序最初是为Cryptococcus...

Cryptococcal 物种多糖荚膜和细胞体的自动测量

本方案旨在利用扫描电子显微镜（SEM）对组织中特定细胞进行纳米级分辨率的成像。首先在光学显微镜下对来自树脂包埋生物样品的大量连续切片进行成像，以识别目标区域，随后以逐级放大的方式在扫描电子显微镜中进行成像。...

大体积样本中连续切片的多模态分层成像以定位特定细胞靶标

本文介绍了一种用于分析线虫Caenorhabditis...

监测蛋白质聚集动力学 在体 内 使用自动包涵体计数在 秀丽隐杆线虫

本文介绍了原子力显微镜（AFM）在细菌表征中的应用，作为一种简便快速的方法，可用于分析细菌的大小和形态、细菌培养形成的生物膜，以及纳米颗粒作为杀菌剂的活性等细节。...

接触模式原子力显微镜作为一种快速进行形态观察与细菌细胞损伤分析的技术

此处使用裂殖酵母作为异源宿主，表达与GFP构成融合蛋白的细菌细胞骨架蛋白（如FtsZ和MreB），以观察其聚合行为。同时，通过荧光显微镜成像鉴定影响这些蛋白聚合的化合物。...

以裂殖酵母作为靶向细菌细胞骨架蛋白的抗菌药物筛选平台

了解原子力显微镜自动化测量技术，通过PDMS微结构固定微生物，可在四小时内完成数百个细胞的力学特性检测。该方法显著提升通量，适用于微生物生物力学研究及潜在医学诊断策略开发。

对数百个C. albicans细胞进行生物原子力显微镜测量的自动化

探索更多视频