数百个 C.白化病 细胞生物原子力显微镜测量自动化
April 2nd, 2021
该协议旨在自动化数百个微生物细胞上的自动对焦M测量。首先，微生物固定在PDMS标记显微结构中，然后在数百个固定细胞上自动进行力光谱测量。
原子力显微镜自动化是生物技术向生物医学应用发展的关键创新。它还为细胞种群的生物力学特性调查开辟了通道。我们的方法使得在四个小时内记录1000个细胞的AFM测量结果成为可能，而通常的方法需要4个小时来测量10个细胞，这确实是一个显著的时间增益。
如果自动化是将这项技术引入医院实验室的先决条件，则此概念验证协议表明其在制定特定医疗诊断策略时具有潜力。此协议使用多功能 PDMS 茎，可以充满各种微生物，从而探索不同的系统。要准备 PDMS 盖章，请在 PDM、寡聚合物和固化剂中以 10 比 1 的质量比例混合 55 克 PDMS 预聚合物溶液，并在真空下将产生的溶液在真空中一次混合 10 到负 1 到 10 到负两棒 5 到 10 分钟。
当所有的陷阱气泡都被移除后，将20克脱气溶液倒入硅主模具上，达到2至3毫米厚，并再次去气。当所有气泡都被移除后，在 80 摄氏度下对 PDMS 进行一小时的回缩，并使用手术刀切割与可见的微结构阵列平行的 PDMS 微结构印记。然后从硅主模具上剥下邮票，将邮票微结构位置放在玻璃滑梯上，微型结构与滑梯侧面对齐。
为了为设备准备细胞，离心机600微升的细胞悬浮的兴趣，并添加200微升的超自然分子的邮票。在真空下将超自然人德加斯吸约40分钟。当所有气泡都被移除后，用200微升的再喷射细胞溶液替换PDMS表面的超细剂，在室温下孵育15分钟。
要将细胞加载到邮票的微观结构中，请使用以 30 到 50 度角举行的玻璃滑梯将细胞向两个方向扩散，必要时将细胞向两个方向扩散数倍。当微结构的填充率很高时，使用移液器去除细胞悬架，每次洗涤一毫升醋酸盐缓冲器清洗三次，以去除任何未绑住的细胞。最后一次洗涤后，使用氮流干燥样品的背面，并将盖章放在培养皿中。
然后在菜中加入两毫升新鲜醋酸盐缓冲器。对于细胞的原子力显微镜，将碟子放在原子力显微镜阶段，并将舞台中心放在零到零。当舞台处于中心位置时，将菜移入显微镜Petry盘架，并对齐邮票的边缘，使其垂直于培养皿架的 y 轴。
然后将原子显微镜力放在舞台上，注意步进马达是否足够伸展，以避免尖端撞击到邮票上。用于成像，使用显微镜旋钮将原子力显微镜尖端集中在 4.5 乘 4.5 平方米井的左角，并在显微镜软件中选择力映射模式。设置一个64乘64力图，超过100乘100微米区域，将相对设定点设置为3至5纳米牛顿，Z长度至4微米，Z运动持续时间，延长时间至0.01秒，延期延迟至零，缩回延迟至零，延迟模式以恒定力，样本率到2048赫兹。
取消选中Z闭环并检查方形图像。设置快速访问 100 微米，慢轴到 100 微米，X 偏移到零微米，Y 偏移到零微米，网格角度到零度，像素到 64 × 64，像素比为 1 比 1 。接下来打开自动化软件。
在弹出窗口中，选择指向脚本文件的路径。在gyfon脚本输入框部分的P1可变行239中输入W1坐标，在P2变量行241中输入框部分输入W2坐标值。将间距值归因于脚本的间距可变行 245 并输入井维，这可以从井模式的设计确定为 W-S 可变线 248。
将路径写入 251 行中的保存目录，以便在所需的位置保存数据，并将总面积可变行 254 设置为 100 微米多端的愿望。然后设置在数字扫描可变行 257 中记录的每口井的力曲线矩阵行和列，然后单击运行以启动程序。要分析数据，请使用视频工作室代码软件打开 Python 脚本并执行 Python 脚本的副本文件，将力曲线文件组织成一个文件夹。
输入路径到将存储数据的普通文件夹。分析力曲线，打开原子力显微镜制造商的数据处理软件。在文件菜单中，选择一批光谱曲线。
接下来选择文件和加载过程，并选择刚度过程。选择过程的最后一步，单击"保留并应用到所有"，以便所有力曲线都得到相同的处理。要打开 R 脚本，将包含数据处理软件提取信息的包含信息的 i 文件加载到 R 工作室软件中。
在环境窗口中，单击"导入数据集"，从弹出窗口中的文本读取器单击浏览以定位点 TSV 文件。加载文件后，选择代码运行区域并运行所有代码以运行所有代码。在这里，显示了使用所示的协议获得的典型直方图。
在这项分析中，在957个原生细胞上记录了刚度再分区，而在这项分析中，测量了574个被处理细胞的刚度。要知道，使用数百个细胞可以观察到值的双模分布。在较小的样本中，通常观察到单一分布，并可能导致对种群异质性缺乏观察。
这两种情况的比较突出了卡斯波芬金对降低细胞僵硬的影响。ANOVA对原生细胞和处理细胞的比较揭示了这两种情况，其刚度差异很大。由于分析的细胞数量众多，因此达到了这个值，从而对获得的结果有了更大的信心。
在反复将细胞冲入井中直到盖章满为止之前，将超自然物添加到 PDMS 邮票中，对于分析的成功至关重要。在这个概念证明中，对念珠菌细胞进行了分析，但该协议可以应用于任何一组模式细胞、分子或材料。
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概览
该协议实现了微生物细胞的原子力显微镜（AFM）测量的自动化，显著提高了吞吐量。通过将微生物固定在PDMS印章微结构中，该方法允许自动记录数百个细胞的AFM测量。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物医学应用
- 微生物生物力学
- 自动化显微镜
背景
- 原子力显微镜正朝着生物医学应用发展。
- 自动化增强了对细胞群体生物力学特性的研究。
- 传统方法耗时，一次只能测量几个细胞。
- 该协议展示了显著的时间效率改进。
研究目的
- 实现大量细胞的AFM测量自动化。
- 探索各种微生物系统的生物力学特性。
- 为潜在的医疗诊断策略提供概念验证。
使用的方法
- 将微生物固定到PDMS印章微结构中。
- 对数百个细胞进行自动化力谱测量。
- 使用特定比例的预聚合物和固化剂混合制备PDMS印章。
- 在真空下对PDMS溶液进行脱气以确保质量。
主要结果
- 能够在四小时内记录1,000个细胞的AFM测量。
- 与传统方法相比，显著减少了测量时间。
- 展示了PDMS印章对各种微生物的多功能性。
- 在医院实验室用于诊断的潜在应用。
结论
- AFM的自动化对大规模测量是可行且高效的。
- 该方法可以促进微生物生物力学的研究。
- 它为开发特定的医学诊断策略开辟了途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Automated Bio-AFM enables high-throughput biomechanical profiling of microbial populations, transforming early discovery and target validation by providing statistically robust, population-scale data. This capability addresses the bottleneck of low-throughput single-cell analysis, supporting predictive confidence and mechanistic de-risking in antifungal and microbial research portfolios. The approach positions AFM as a scalable, enterprise-ready platform for quantitative phenotyping and comparative analysis across experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables population-level biomechanical measurements for robust target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying cell rigidity and adhesive properties across hundreds of cells.
- Facilitates detection of phenotypic heterogeneity relevant to antifungal mechanism studies.
- Improves predictive confidence in early-stage compound evaluation by increasing sample size and statistical power.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, automated force curve acquisition for reproducible assay development.
- Prepares validated cell arrays for downstream screening of antifungal or antimicrobial agents.
- Enables quantitative, high-content readouts suitable for comparative compound profiling.
- Supports scalability and platform reuse across diverse microbial systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns biomechanical phenotyping with translational biomarker discovery in microbial pathogenesis.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale, quantitative comparisons.
- Reduces risk of false negatives in preclinical models by capturing population heterogeneity.
Pipeline & Workflow Integration
This automated Bio-AFM workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and comparative analytics at scale.
- Discovery Biology: Quantifies biomechanical parameters to clarify microbial response pathways and validate antifungal targets.
- Screening: Provides reproducible, quantitative force curve data for robust assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of cell populations, supporting ANOVA and distribution analysis for decision-making.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment and population-scale phenotyping.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, automated platform adaptable to various cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in microbial target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible biomechanical measurements.
- Strategic Value: Supports data-driven go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing robust, population-level data for advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, data analysis, and microbial handling.
- Depends on access to commercial Bio-AFM instrumentation and compatible automation software.
- Necessitates cross-team standardization of data processing and statistical analysis workflows.
- Adaptable to various microbial systems via customizable PDMS stamp design.
- Throughput and data quality are contingent on sample preparation and instrument calibration.
