Name: 用Janus碱纳米管和纤维素制造用于干细胞粘附的仿生纳米矩阵 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 学习使用Janus碱纳米管和纤连蛋白组装仿生纳米基质，用于促进人间充质干细胞粘附。该方法可快速自组装，模拟细胞外基质形态，在骨组织工程修复中具有应用潜力。

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本工作获得美国国立卫生研究院（NIH）（资助号 1R01AR072027-01、1R03AR069383-01）、美国国家科学基金会职业奖（1653702）和康涅狄格大学的资助。

1. JBNTs 的合成
注意：JBNT 单体的制备方法如先前文献所述11。
<ol>
	<li>化合物 A1 的合成
	<ol>
		<li>将 8.50 g 2-氰基乙酸和 9.80 g 乙基氨基甲酸酯溶于 25 mL 甲苯和 2.5 mL N,N-二甲基甲酰胺中，制备成溶液。逐滴加入 4.90 mL 三氯氧磷，然后将混合物加热至 70 °C，持续搅拌 1.5 小时。</li>
		<li>将反应混合物冷却至室温，倒入 100 g 冰水中。用乙酸乙酯（3 × 250 mL）萃取水相，并用 100 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除挥发性物质，得到淡黄色固体。</li>
		<li>将黄色固体进行硅胶快速柱层析（3% 甲醇/二氯甲烷），得到 15.61 g 白色粉末状化合物 A1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A2 的合成
	<ol>
		<li>将 3.12 g 化合物 A1 和 2.75 g 碳酸钾加入 50 mL N,N-二甲基甲酰胺中，室温下搅拌 2 小时。</li>
		<li>向反应悬浮液中加入 2.6 mL 二硫化碳，继续搅拌 4 小时。</li>
		<li>在 0 °C 下向反应混合物中加入无水乙醇，过滤析出的黄色沉淀，并用乙醚洗涤。减压干燥过夜，得到 6.18 g 淡黄色固体状化合物 A2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A3 的合成
	<ol>
		<li>将 2.7 mL 碘甲烷加入 15 mL 乙腈中。另取 6.18 g 化合物 A2 溶于 80 mL 水/乙腈（7:3）混合溶剂中，制备成溶液。将两种溶液混合，室温下搅拌 30 分钟。</li>
		<li>将反应混合物加热至 95 °C，持续搅拌 3 小时。</li>
		<li>将反应混合物冷却至室温，然后减压蒸除挥发性物质。</li>
		<li>用 100 mL 乙酸乙酯对残留物萃取 3 次，并用饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到黄色固体。</li>
		<li>将黄色固体进行硅胶快速柱层析（30% 乙酸乙酯/正己烷），得到 4.52 g 浅黄色固体状化合物 A3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A4 的合成
	<ol>
		<li>将 925 µL 烯丙胺加入 20 mL 乙醇中，制备成烯丙胺溶液。将该溶液在 30 分钟内逐滴加入由 3.14 g A3 溶于 75 mL 无水乙醇所制得的化合物 A3 溶液中。然后将反应混合物加热回流 16 小时。</li>
		<li>将反应混合物冷却至室温，减压蒸除挥发性物质，得到黄色固体。</li>
		<li>将黄色固体进行硅胶快速柱层析（洗脱梯度：50% 乙酸乙酯/正己烷 至 2% 甲醇/二氯甲烷），得到 1.80 g 白色晶体状化合物 A4。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A5 的合成
	<ol>
		<li>将 2.05 g 盐酸胍和 7.8 mL 乙醇钠（21 wt% 乙醇溶液）加入 14 mL 无水乙醇中，加热至 45 °C 反应 15 分钟。</li>
		<li>过滤除去不溶物，将滤液直接加入由 2.70 g A4 溶于 40 mL 无水乙醇所制得的化合物 A4 溶液中。将反应混合物加热回流 16 小时。</li>
		<li>过滤析出的沉淀，得到 2.65 g 类白色固体状化合物 A5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A6 的合成
	<ol>
		<li>将 2.11 g 化合物 A5 和 1.10 g 4-二甲氨基吡啶加入 120 mL 四氢呋喃中，形成浆状混合物，于 1 分钟内缓慢加入 24.9 mL 三乙胺。室温下搅拌 2 分钟。</li>
		<li>向反应混合物中逐滴加入 20.7 mL 二叔丁基二碳酸酯，室温下继续搅拌 40 小时。</li>
		<li>加入 20 mL 水淬灭反应，减压蒸除挥发性物质。</li>
		<li>用 500 mL 乙酸乙酯萃取红色粘稠残留物，依次用 250 mL 水、75 mL 10% 柠檬酸、2 × 200 mL 水、200 mL 饱和碳酸氢钠溶液和 200 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到红/橙色固体。</li>
		<li>将该固体进行硅胶快速柱层析（0–20% 乙酸乙酯/正己烷），得到 3.87 g 白色泡沫状化合物 A6。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A7 的合成
	<ol>
		<li>将 N-甲基吗啉-N-氧化物（50 wt.% 水溶液，1.64 mL）逐滴加入由 2.93 g 化合物 A6 溶于丙酮/水（8:1，58.5 mL）所制得的溶液中，室温下搅拌 5 分钟。</li>
		<li>在 3 分钟内逐滴加入四氧化锇（4% 水溶液），室温下继续搅拌 24 小时。</li>
		<li>用 1.0 M 亚硫酸钠水溶液淬灭反应，直至溶液变为无色。减压除去挥发性物质，得到含白色浆状物的水相。用 350 mL 二氯甲烷萃取残留物，依次用 150 mL 水和 150 mL 饱和食盐水洗涤。</li>
		<li>用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到 2.45 g 白色固体状化合物 A7。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A8 的合成
	<ol>
		<li>将 760 g 高碘酸钠加入由 1.36 g 化合物 A7 溶于二氯甲烷/水（6:1，35 mL）所形成的混合物中，室温下搅拌 42 小时。</li>
		<li>过滤除去不溶物，减压浓缩滤液。用 250 mL 二氯甲烷萃取所得残留物，依次用 100 mL 水和 100 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到粗产物。</li>
		<li>将粗产物进行硅胶快速柱层析（5–40% 乙酸乙酯/正己烷，随后 5% 甲醇/二氯甲烷），得到 1.08 g 化合物 A8。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>化合物 A9 的合成
	<ol>
		<li>将 830 mg 化合物 A8 溶于 15 mL 1,2-二氯乙烷中，制备成溶液。在 3 分钟内将该溶液逐滴加入由 6-苄氧羰基氨基-2-L-氨基己酸三甲基硅乙酯（649.5 mg）和 N,N-二异丙基乙胺（591 µL）溶于 24 mL 1,2-二氯乙烷所形成的混合物中，室温下搅拌 15 分钟。</li>
		<li>向溶液中加入 360.3 mg 三乙酰氧基硼氢化钠，室温下继续搅拌 24 小时。</li>
		<li>用 6 mL 水淬灭反应混合物。用 200 mL 二氯甲烷萃取反应混合物 3 次，依次用 200 mL 10% 柠檬酸水溶液、2 × 200 mL 水、200 mL 饱和碳酸氢钠溶液和 200 mL 饱和食盐水洗涤。用无水硫酸钠干燥有机相，过滤后减压蒸除溶剂，得到粗产物。</li>
		<li>将粗产物进行硅胶快速柱层析（5–30% 乙酸乙酯/正己烷），得到 885 mg 化合物 A9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>JBNT 单体的合成
	<ol>
		<li>将 0.54 g 化合物 A9 溶于 10 mL 94% 三氟乙酸/硫代苯甲醚溶液中，室温下搅拌 72 小时。</li>
		<li>向反应混合物中加入乙醚（80 mL），离心收集沉淀。倾去含三氟乙酸的上清液，用乙醚和甲醇洗涤白色沉淀，得到 168.6 mg 粗制 JBNT 单体（补充文件 1）。</li>
		<li>采用反相高效液相色谱（HPLC）对粗制 JBNT 单体进行纯化。分离程序如下：流动相 A：100% 水；流动相 B：100% 乙腈；流动相 C：pH = 1 的盐酸水溶液；流速：3 mL/min（见 表 1）。</li>
		<li>收集约 7.2 分钟处的主峰组分。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. JBNT/FN 的制备
<ol>
	<li>将80 µL浓度为1 mg/mL的JBNT水溶液加入40 µL浓度为1 mg/mL的FN水溶液中，并用移液器反复吹打数次。</li>
	<li>吹打约10秒后，观察是否有白色固体悬浊物生成。 
	注意：已拍摄视频以记录NM的自组装过程（补充文件2）。</li>
</ol>
3. 冻干样品的观察
注意：此步骤旨在展示由 JBNTs 和 FN 制备的 NM 的支架结构。
<ol>
	<li>制备用于观察冻干材料的 FN、JBNT 和 FN/JBNT 纳米材料（NM）溶液。将 10 µL 浓度为 100 µg/mL 的 FN 用 40 µL 蒸馏水稀释，配制成浓度为 20 µg/mL 的 FN 溶液。</li>
	<li>通过将 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNTs 用 45 µL 去离子水稀释，配制浓度为 100 mg/mL 的 JBNTs 溶液。</li>
	<li>在 35 µL 去离子水中混合 10 µL 浓度为 100 µg/mL 的 FN 和 5 µL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNTs，形成 NM 溶液。</li>
	<li>分别用 FN 溶液、JBNT 溶液和 NM 溶液包被 96 孔透明圆底微孔板中的三个孔，每孔加入 50 µL 溶液。</li>
	<li>按以下步骤进行冻干处理，以观察 NM 的支架结构：
	<ol>
		<li>将微孔板在 -80 °C 下冷冻过夜。</li>
		<li>打开冻干仪和真空泵。</li>
		<li>按下 cool down 按钮，使系统温度降至 -50 °C。</li>
		<li>将已冷冻的微孔板放入冻干仪中，并关闭仪器所有开口。</li>
		<li>点击 start 按钮，使系统压力降至 0.9 mbar。</li>
		<li>4 小时后，按下 aerate 按钮并打开阀门，使系统压力升至大气压。</li>
		<li>将微孔板从冻干仪中取出。</li>
		<li>使用显微镜观察 FN、JBNTs 及所形成的自组装 NM 结构，并用相机拍摄材料的多张照片。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 吸收光谱测量
注意：利用 FN 和 JBNTs 光谱的变化来展示自组装的 JBNT/FN 纳米材料12。
<ol>
	<li>取30 µL浓度为100 µg/mL的FN与15 µL蒸馏水和5 µL浓度为1 mg/mL的JBNTs混合，制备JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液。反复吹打溶液数次后可见白色固体悬浮物。 
	注意：溶液中JBNTs和FN的最终浓度分别为100 µg/mL和60 µg/mL。同时配制与NM溶液中相同浓度的JBNTs和FN溶液作为对照溶液。</li>
	<li>将5 µL浓度为1 mg/mL的JBNTs用45 µL蒸馏水稀释，制备JBNT对照溶液。</li>
	<li>将30 µL浓度为100 µg/mL的FN用20 µL蒸馏水稀释，制备FN对照溶液。</li>
	<li>使用紫外-可见分光光度计（见材料表）测定FN、JBNT和JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液的紫外-可见吸收光谱，以表征纳米复合物的组装情况。
	<ol>
		<li>点击UV-Vis按钮。清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL蒸馏水。在190–850 nm范围内进行空白测定。</li>
		<li>清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL FN溶液。在190 nm至850 nm范围内测定FN溶液的紫外-可见吸收光谱。</li>
		<li>清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL JBNT溶液。在190 nm至850 nm范围内测定JBNT溶液的吸收光谱。</li>
		<li>清洁分光光度计的检测表面，并在其上滴加2 µL JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液。在190 nm至850 nm范围内测定JBNT/FN纳米复合物（NM）溶液的吸收光谱。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于透射电子显微镜（TEM）的JBNT/FN纳米材料制备
<ol>
	<li>使用基础等离子清洗机（见材料表）在负染色前清洗数个载网。</li>
	<li>按照两种不同流程对样品进行负染色。
	<ol>
		<li>分别在不同的载网上滴加3 µL浓度为1 mg/mL的JBNT水溶液和3 µL JBNT/FN NM溶液，静置2分钟。然后用100 µL的0.5%醋酸铀（UA）溶液冲洗每个载网。用滤纸吸去多余液体，并将载网在空气中干燥。</li>
		<li>将9 µL JBNT/FN NM溶液与3 µL 2.0% UA溶液混合，并用移液器反复吹打数次。将混合溶液滴加到载网上，在载网上保持2分钟。用滤纸吸去载网上的混合溶液，并在室温下干燥载网。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>最后，利用透射电子显微镜（TEM）对JBNTs、经步骤5.2.1染色的JBNT/FN NM以及经步骤5.2.2染色的JBNT/FN NM样品进行表征。</li>
</ol>
6. 体外生物学功能检测
<ol>
	<li>分别向8孔板的每个孔中加入200 µL的阴性对照（NC，PBS）、JBNTs、FN和JBNT/FN NM溶液。</li>
	<li>使用冷冻干燥仪器对8孔板盖玻片进行冷冻干燥，使材料涂覆在孔底。冷冻干燥的程序与步骤3.5相同。</li>
	<li>然后每孔加入10,000个/孔的hMSCs细胞（第3代），在37 °C、5% CO2条件下培养24小时。</li>
	<li>培养结束后，用移液器吸出各孔中的细胞培养基，并用1× PBS溶液清洗细胞培养层。</li>
	<li>向含细胞的各孔中加入100 µL固定液，静置5分钟。用1× PBS轻柔冲洗细胞两次。</li>
	<li>将1% Triton-X 100稀释至0.1%。向含细胞的各孔中加入100 µL 0.1% Triton-X 100，静置10分钟。用1× PBS轻柔冲洗细胞两次。</li>
	<li>将罗丹明-鬼笔环肽（Rhodamine Phalloidin）稀释至1.65 µM。向含细胞的各孔中加入100 µL罗丹明-鬼笔环肽，将8孔板避光置于室温下孵育30分钟。用1× PBS轻柔冲洗细胞两次。</li>
	<li>使用荧光显微镜拍摄细胞图像。</li>
	<li>统计每组荧光图像中的细胞数量。通过计算每个孔内三个随机区域的平均值，得出细胞黏附密度。</li>
	<li>所有数据以平均值±标准差（SD）表示。采用单尾t检验进行统计分析，随后进行方差分析（ANOVA），以p&#60;0.05为差异具有统计学意义。</li>
</ol>

<ol><li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li>
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<li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Material%22%5BJournal%5D)">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089(2017).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li>
<li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li>
</ol>

Yupeng Chen 博士是 NanoDe Therapeutics, Inc. 的联合创始人。

在本研究中，我们开发了一种自组装的仿生纳米膜（NM），该膜由仿DNA结构的JBNTs和FN组成。在配制JBNT溶液时，应将JBNT冻干粉溶解于水中，而非PBS中，因为PBS会引起JBNT的聚集，从而抑制其自组装。此外，若希望观察NM的纳米原纤维结构，也应在水中进行NM的组装，因为PBS中的盐离子会与NM纤维发生束集作用，显著降低成像分辨率。
尽管已有大量研究致力于制备用于促进人骨髓间充质干细胞（hMSCs）黏附与分化的组织再生支架，但脱细胞基质（NM）作为一种新型组织工程支架仍展现出巨大潜力。然而，大多数此类材料均为预先制备成特定形状，例如3D打印支架18,19，因此难以植入关节内部较深的损伤部位。相比之下，本文中的NM溶液可作为液体直接注射，并随后作为细胞黏附的支架发挥作用。
一个局限性在于纳米材料（NM）的机械强度不高。与聚合物不同，它们通过非共价相互作用的自组装方式制备，因此无法承受较大的机械载荷或张力。...

人源间充质干细胞（hMSCs）具有自我更新和沿不同间充质谱系自我分化的能力，有助于组织的再生与维持1。基于其分化潜能，hMSCs被视为治疗间充质组织损伤和造血系统疾病的重要候选细胞2。研究表明，hMSCs能够通过促进组织修复、血管生成以及减轻炎症反应来加速伤口愈合3。然而，在缺乏生化因子或生物材料辅助的情况下，hMSCs靶向迁移至目标组织并在特定部位发挥功能的效率较低4。尽管已有多种工程化支架被用于引导hMSCs黏附于损伤部位，但某些解剖位置（如位于长骨中部的生长板骨折处）难以通过传统预制支架有效到达，且这些支架可能无法与形状不规则的损伤区域完全贴合。
在此，我们开发了一种可原位自组装并可注射至难以到达靶区域的仿生纳米材料。这种可注射的生物支架纳米材料（NM）由Janus基纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组成。JBNTs也被称为玫瑰花结纳米管（RNTs），来源于DNA碱基对，特别是胸腺嘧啶和腺嘌呤5,6,7。如图1所示，当六个衍生的DNA碱基对分子通过氢键自组装形成一个平面时，即形成纳米管结构6。随后，六个分子通过强烈的π-π堆叠相互作用在平面上层层堆叠7，可形成长达200–300 µm的结构。JBNTs在形态上被设计为模拟胶原纤维，以使纤连蛋白（FN）能够与其发生反应。
纤连蛋白（FN）是一种高分子量的黏附性糖蛋白，存在于细胞外基质（ECM）中9。它可介导干细胞与其他ECM成分（尤其是胶原蛋白）之间的黏附10。我们设计的JBNTs在形态上模拟胶原纤维，使FN能够通过非共价键在数秒内与其反应并形成NM。因此，NM是一种有前景的生物支架材料，可注射至传统制备的支架难以到达的骨骨折部位。在此，这种可注射的NM在体外表现出优异的增强人骨髓间充质干细胞（hMSC）锚定能力，显示出其作为组织再生支架的应用潜力。

<table><tbody><tr><td>1,2-二氯乙烷</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-氰基乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-二甲氨基吡啶</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8孔腔室盖玻片</td><td>Thermo Fisher</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>96孔板</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>烯丙胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>基础等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>浓盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>去离子水</td><td>Thermo Fisher</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>二氯甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>乙醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>二叔丁基二碳酸酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>氨基甲酸乙酯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>固定液（磷酸盐缓冲液配制的4%甲醛）</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>盐酸胍</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>己烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>人源间充质干细胞</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>碘甲烷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺</td><td>Alfa Aesar</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-甲基吗啉-N-氧化物</td><td>Alfa Aesar</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>三氯氧磷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>反相色谱柱</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>硅胶</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>乙醇钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>高碘酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>亚硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>三乙酰氧基硼氢化钠</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（NanoDrop One/One&lt;sup&gt;c&lt;/sup&gt; UV-Vis）</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>干细胞生长培养基子弹套装</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>四氢呋喃</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401757</td><td></td></tr><tr><td>硫代苯甲醚</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T28002</td><td></td></tr><tr><td>甲苯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>三乙胺</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12646</td><td></td></tr><tr><td>三氟乙酸</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12198</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>Thermo Fisher</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA溶液</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

基于janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

开发了一种仿生纳米膜（NM），用作组织工程的生物支架，可增强干细胞的锚定。该仿生纳米膜通过JBNTs与FN在水溶液中自组装形成。JBNTs长度为200-300 µm，具有内部疏水的中空通道和外部亲水的表面。JBNTs带正电，而FN带负电。因此，当将其注入中性水溶液时，二者通过非共价键结合，形成纳米膜束。该自组装过程在数秒内完成，无需任何化学引发剂、热源或紫外光。当纳米膜溶液的pH值低于FN的等电点（pI 5.5-6.0）时，由于FN带正电，纳米膜束将自发解离释放。
纳米膜（NM）在形态上可模拟细胞外基质（ECM），因此可用作可注射的支架材料，为增强人骨髓间充质干细胞（hMSC）的黏附提供优良平台。细胞密度分析和荧光成像实验表明，与阴性对照组相比，纳米膜显著增加了hMSC的锚定。

我们的研究发现，JBNTs与FN形成NM的过程非常迅速，仅需10秒即可完成。如图2所示，当JBNT溶液与FN溶液混合并反复吹打数次后，即可观察到白色絮状物的生成。NM的形成过程完全仿生，无需任何外部刺激。该制备工艺比某些新兴生物材料更为简便，后者通常依赖紫外光或化学引发剂来实现交联13。
我们采集并分析了FN、JBNTs和NM的显微图像（图3）。在FN组中，除少量短的白色斑点外，未观察到长纤维。这些短簇是由FN组成的蛋白聚集体，表明仅靠FN无法形成支架结构（图3A）。如图3B所示，长而细的纤维表明JBNTs的存在。与JBNTs相比，NM中白色条带的宽度更宽，说明JBNTs与FN相互交联形成了NM。NM纤维的长度可生长至数厘米（图3C）。</...

本实验方案的目的是展示由Janus基底纳米管（JBNTs）和纤连蛋白（FN）组装仿生纳米基质（NM）的方法。当与人源间充质干细胞（hMSCs）共培养时，该纳米基质在促进hMSCs黏附方面表现出优异的生物活性。

基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

一种仿生核层（NM）被开发出来，用作组织工程的生物支架，可增强干细胞的锚定。该仿生核层由……形成。

我们开发了一种具有广阔前景的仿生纳米基质，可用作组织工程支架。本方案展示了如何利用本实验室合成的Janus基纳米管以及纤连蛋白蛋白来组装该纳米基质。该纳米基质可在数秒内自发组装，无需任何额外辅助。与人源间充质干细胞共培养时，该纳米基质在促进细胞黏附方面表现出优异的生物活性。该纳米基质在形态上模拟了细胞外基质，因此有望作为可注射支架，通过在靶向部位促进细胞黏附和功能，用于修复骨骨折。首先制备纳米基质。将80微升浓度为1毫克/毫升的Janus基纳米管加入40微升浓度为1毫克/毫升的纤连蛋白中，轻轻缓慢地用移液器吹打混合液数次。10秒后，目视检查管内是否存在白色固体悬浮物。接下来，根据文稿说明，制备用于观察冻干材料的纤连蛋白、JBNT以及纤连蛋白/JBNT纳米基质溶液。取三孔96孔透明圆底微孔板，每孔加入50微升上述溶液进行包被。将微孔板于-80摄氏度冷冻过夜。第二天，打开冷冻干燥仪和真空泵，按下降温按钮，将系统温度降至零下50摄氏度。将已冻结的样品板放入仪器中，并关闭所有开口。点击启动按钮，将系统压力降至0.9毫巴。四小时后，按下曝气按钮，打开阀门，使系统压力升至大气压。然后将培养板从冻干仪中取出。按照文本稿件中的描述制备JBNT/纤连蛋白纳米基质溶液，并用蒸馏水稀释JBNT和纤连蛋白溶液，以制备对照溶液。使用分光光度计测量溶液的吸收光谱，以表征纳米基质的组装情况。点击UV-vis按钮，然后清洁分光光度计的测试表面，并在其上滴加两微升蒸馏水。以水作为空白样，在190至850纳米范围内进行测量。对于每个样品，先清洁测试表面，然后在其上滴加两微升溶液，随后在190至850纳米范围内测量紫外-可见吸收光谱。向八孔板的各孔中分别加入 200 微升的阴性对照、JBNTs、纤连蛋白和纳米基质溶液。使用冷冻干燥机对八孔板盖玻片进行冻干，使材料包被于各孔底部。随后，向盖玻片的每个孔中加入 10,000 个人类间充质干细胞，并在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 24 小时。孵育结束后，从孔中移除细胞培养基，并用 PBS 洗涤。每孔加入 100 µL 固定液，在室温下放置 5 分钟。然后，用 PBS 轻柔洗涤细胞两次，每孔加入 100 µL 0.1% Triton X-100。10分钟后，用PBS再次重复洗涤。每孔加入100微升罗丹明标记的鬼笔环肽，将带孔盖玻片避光孵育30分钟。用PBS洗涤细胞两次，然后使用荧光显微镜观察成像。纳米基质的形成快速且完全仿生。将JBNT溶液与纤连蛋白溶液混合后10秒即可观察到白色絮状物。拍摄并分析了纤连蛋白、JBNTs及纳米基质的显微图像。在纤连蛋白组中未观察到长纤维，表明没有JBNTs则无法形成支架结构。JBNTs呈长而细的纤维状。当与纤连蛋白交联时，纳米基质纤维可生长至数厘米长。通过获取紫外-可见光谱也证实了纳米基质的组装。单独的JBNTs的两个吸收峰在纳米基质形成后减弱。采用透射电子显微镜对JBNTs和纳米基质的形貌进行表征。JBNTs 是具有均匀直径的细长管状结构。当与纤连蛋白混合时，通过电荷相互作用形成较长的纤维瘤样纳米基质。当 pH 值低于纤连蛋白的等电点时，由于纤连蛋白带正电，纳米基质束会自发释放。还探讨了JBNT/纤连蛋白纳米基质对细胞黏附的影响。由于纳米基质在形态上模拟了细胞外基质，因此可为细胞提供支架并增强细胞黏附。荧光显微镜证实，与纳米基质共孵育可增加细胞黏附。在以下实验过程中，可通过细胞迁移、分化及长期功能的检测，进一步探究纳米基质对人源间充质干细胞生长和功能的影响。

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

用Janus碱纳米管和纤维素制造用于干细胞粘附的仿生纳米矩阵

介绍了一种从单一或多种细胞外基质蛋白中获取纳米纤维及复杂纳米结构的方法。该方法利用蛋白质-表面相互作用，制备具有可调组成和结构的自支撑蛋白材料，可用于多种组织工程和生物技术应用。...

利用表面引发组装技术构建的细胞外基质蛋白纳米纤维与纳米结构

本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。...

具有纤维排列梯度的电纺纳米纤维支架

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利用拼接技术扩展纳米图案化基底以调控细胞行为的纳米形貌

本文描述并应用了一种制备基于树状大分子的非均匀纳米图案的方法，该方法可实现对局部精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）表面密度的纳米尺度调控，用于研究细胞黏附和软骨发生分化。...

基于树状大分子的非均匀纳米图案用于局部调控表面黏附性：一种引导软骨细胞定向分化的技术方法

本方案描述了一种利用定制的3D打印塑料模具制备不同尺寸自组装组织环的平台。将PDMS倒入3D打印模具中固化形成阴模，然后将琼脂糖注入固化的PDMS阴模中成型。将细胞接种至所得的琼脂糖孔中，细胞在其中聚集形成组织环。...

使用3D打印模具制备定制琼脂糖孔用于细胞接种和组织环自组装

本文描述了制备用于高通量操控模拟物理与化学信号的多重人工细胞微环境（MACME）阵列的详细方法 体内...

构建多重人工细胞微环境阵列

本文介绍了一种通过热纳米压印技术制备梯度纳米图案化培养板，并筛选人内皮祖细胞对这些纳米结构响应的方法。利用所述技术，可制备出能够通过物理刺激调控细胞行为的支架材料。...

利用热纳米压印技术制备梯度纳米图案及人内皮集落形成细胞响应的筛选

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成纤维细胞来源的三维基质系统在内皮细胞成管形成实验中的应用

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层层自组装制备与表征双面纳米基质以促进软骨再生

带有塑料膜的组织培养小室是细胞培养实验室中的金标准，可作为可渗透支持物用于构建细胞层和屏障组织模型。在此，我们介绍一种简单的方法，用重组功能化蜘蛛丝蛋白制成的更具生物学相关性的膜替代塑料膜。...

定制组织培养插件中由重组功能化蜘蛛丝制成的纳米原纤维基底膜模拟物

以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。...

用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

学习使用Janus碱纳米管和纤连蛋白组装仿生纳米基质，用于促进人间充质干细胞粘附。该方法可快速自组装，模拟细胞外基质形态，在骨组织工程修复中具有应用潜力。

基于Janus基纳米管与纤连蛋白的仿生纳米基质的制备及其用于干细胞黏附

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