经大池双次直接注射血液作为蛛网膜下腔出血模型

本视频的主要目标是阐述通过枕大池双次直接注射血液来建立蛛网膜下腔出血模型的实验方案。蛛网膜下腔出血的生理机制通常源于动脉瘤的破裂，首先导致血液外渗至脑组织与其覆盖组织之间的腔隙中。

这一腔隙为蛛网膜下腔。蛛网膜下腔出血占所有卒中病例的7%。基于人群的研究显示，其死亡率在30%至50%之间，且蛛网膜下腔出血的幸存者常出现认知后遗症，如记忆障碍、虚弱或情绪障碍。

导致不良预后高发的主要原因是脑缺血。研究表明，脑缺血的发生与大脑大动脉的血管收缩有关，这种现象被称为显微血管痉挛，可在首次出血事件后的第4至第15天内于大多数患者中检测到。由于现有治疗手段效果有限，临床上迫切需要更深入地理解相关病理过程。

伴随性蛛网膜下腔出血及新的治疗靶点应进行测试，但这需要多种且标准化的动物模型。人类蛛网膜下腔出血大多由颅内动脉瘤破裂引起，而要建立可用于临床前研究和人类研究的模型可能较为困难。在动物模型中，主要难点在于出血发生率和血液分布的可控性，但近期研究集中于开发更具可重复性的蛛网膜下腔出血模型。

此处展示的是一种标准化的小鼠模型，即在两天内向小脑延髓池连续注射两次自体动脉血。该模型的主要优势在于能够可重复地掌握一种非侵入性外科操作，可调节注射血液的质量与数量，并可在不显著增加颅内压的情况下强化出血事件。在手术开始之前，必须使用微电极拉制仪制备大量玻璃毛细管。

注射用移液管的内径应为0.86毫米，外径应为0.5毫米。按照书面实验方案中的说明，制备用于假手术组的人工脑脊液。必须使用0.22微米滤器装置对这种含氧人工脑脊液进行过滤处理。

我们蛛网膜下腔出血模型的第一步是沿气管分离颈动脉，并通过颈动脉穿刺采集尽可能多的血液。使用异氟烷麻醉后，通过夹闭一只或两只后肢来检查反射是否消失，以确认可以开始实验操作。使用26号针头将Eprin注入一毫升注射器中进行编码。

这将防止在后续步骤中发生血液凝固。使用电子天平精确称量每只小鼠的体重。在本研究中，小鼠在手术前的体重范围为20至25克。

如前所述，对实验小鼠实施诱导麻醉，然后使用合适的电动剃毛器剃除颈部以及两耳之间的毛发。检查小鼠是否处于睡眠状态，并确保其头部固定良好。使用26号针头在小鼠下背部皮下注射100 µL浓度为0.1 mg/kg的丁丙诺啡，以预防苏醒后疼痛。

使用保护性液体凝胶预防干眼，并通过自动调节的电热毯维持脑内温度为37摄氏度。在用消毒液处理剃毛区域之前，所有接触组织的器械均已灭菌，并以无菌方式操作。在第一天，于后颈部做一厘米长的切口，随后沿中线分离肌肉，以暴露小脑延髓池。

用细剪刀剪去空玻璃移液管的尖端，然后连接至通过柔性硅胶接头与注射器相连的装置。接着，使用精密微量移液器将60 µL血液或人工脑脊液转移至0.5 mL离心管中，并将60 µL血液（用于蛛网膜下腔出血条件）或60 µL人工脑脊液（用于假手术条件）吸入玻璃移液管中。

注射时，将移液管插入立体定位仪上，例如使用我们的a环或a，缓慢将移液管尖端靠近枕大池界面处的膜。使用立体定位仪的显微操作器，缓慢将移液管尖端穿过枕骨大孔膜进入枕大池。将移液管连接至先前已充满液体、准备进行加压注射的注射器上。

以约每分钟10 µL的低速率进行压力注射，以避免急性颅内高压。注射过程中，密切监测呼吸频率和直肠温度。注射结束后，使用显微操作器小心移除移液管，并在撤出时肉眼观察确保无渗漏。

达到稳态后，使用编织的不可吸收缝合线完成两针缝合。手术后立即将小鼠分离并置于倾斜卧位，用保温毯覆盖，放置于开放的盒子中直至恢复。24小时后，再次诱导麻醉，将小鼠安装至立体定位仪框架上（操作同前一天），并用显微剪小心拆除缝合线。

用棉棒在剃毛区域涂抹无菌溶液，按先前方法对枕寰膜进行无菌准备。同前一天一样，以低速注射30 µL血液或人工脑脊液。如前所述，监测呼吸频率和直肠温度。

注射结束后，小心取下移液器，并在撤出时控制无血液渗漏。实现止血后，使用编织可吸收缝合线进行两针缝合。从术后第一天至安乐死当天，应每日评估体重，作为反映整体健康状况的敏感指标。

与假手术组动物相比，蛛网膜下腔出血组动物的体重增长显著降低，提示蛛网膜下腔出血后存在持久的神经功能恢复过程以及长期持续的病理事件。为何假手术组未出现死亡？在蛛网膜下腔出血条件下，术后第7天的死亡率接近30%，其中大多数动物在术后第1天或第4天死亡。

在人道终点指标中，显著的体重下降超过初始体重的15%被视为重要指征。弓背姿势、行动迟缓、伤口、异常叫声或明显攻击行为也是动物遭受痛苦的表现。若出现上述任一症状或多种症状的组合，应在症状出现后的数小时内加强对该动物的监测。

如果动物的状况在术后1小时内恶化，或在48小时内未见改善，则认为已达到无法忍受的痛苦程度，需实施安乐死。在此示例中，术后第1天，可从样本脑组织中观察到蛛网膜下腔出血模型动物Willis环大动脉沿线存在血凝块。术后第5天，在处死前通过血管内注射印度墨水，可检测到与小脑大动脉血管收缩相对应的肉眼可见的血管痉挛。通过苏木精-伊红染色脑组织切片，可对脑血管痉挛程度进行测量。

如本照片显微图像所示，您可观察到基底动脉的血管痉挛现象。在该通过直接向小脑延髓池注射血液建立的模型中，我们近期已证实小鼠会出现大脑主要动脉的脑血管痉挛、脑血管纤维蛋白沉积以及细胞凋亡，并伴随感觉、运动和认知功能的改变。因此，该模型已被验证并具有特征性，适用于研究蛛网膜下腔出血后短期及长期的病理事件。

它应非常适合用于前瞻性识别新靶点以及研究针对蛛网膜下腔出血相关并发症的有效治疗策略。