使用 Drosophila 幼虫进行热遗传神经元筛选时宏量营养素摄入量的定量分析

本实验方案能够识别与调控两种主要宏量营养素（蛋白质和碳水化合物）摄入水平相关的幼虫神经元群体。本方法操作简便且通量相对较高，可对多种基因型在不同营养条件下摄食量进行定量分析。为进行遗传杂交，需设置直径60毫米的胚胎收集笼，并配备添加适量活性酵母糊的L3培养基平板。

将成年TripA1雌性处女蝇与5至8日龄的Janelia GAL4雄蝇转移至胚胎收集笼中，在25摄氏度、60%湿度及12小时光照/12小时黑暗循环条件下交配24至48小时。交配结束后，将已交配的成蝇转移至新鲜的L3饲养培养基平板上，在25摄氏度条件下让其产卵3至4小时。确保所有平板均标记上基因型及产卵日期。

产卵期结束后，将培养皿从饲养笼中取出，通过计数培养皿四分之一区域内的胚胎数量来估算每皿的卵数。每皿幼虫密度应控制在最多200个胚胎，并用塑料盖盖好培养皿。将L3培养皿置于18°C、60%湿度、12小时光照/12小时黑暗循环条件下培养9天。

孵育结束后，从待测的每种基因型中分别收集三组 L3 幼虫，每组 10 条，另取一组 10 条 L3 幼虫用于零染料食物对照。使用 5 号或超轻型镊子，尽可能轻柔地进行幼虫收集。将收集的幼虫转移至含有 1 毫升水的塑料培养皿称量舟中。

设置一个30摄氏度的培养箱，并通过添加盛水的托盘保持高湿度，以避免在实验过程中幼虫脱水。在开始实验前，将实验用培养板预热至30摄氏度，使其温度平衡。确保所有培养板均标记有基因型及饲料的蛋白质与碳水化合物比例。

将装有动物的塑料舟直接转移至37摄氏度的水浴中，对实验幼虫进行两分钟的热激处理。设置所需数量的一小时计时器，然后小心倒掉塑料舟中的水，将L3幼虫组从塑料舟转移至平板中心位置。盖上平板盖子，并启动计时器。

将幼虫在30摄氏度避光条件下培养一小时使其摄食。通过将培养板转移至冰浴中来终止摄食实验。为每组检测的L3幼虫准备2毫升微量离心管，管内加入足量0.5毫米玻璃珠以铺满管底，并加入300 µL冰甲醇。

使用 bench cooler 保持微量离心管处于低温状态。小心地从饲喂实验培养板中回收 L3 群体，并将其转移至含有少量水的培养板盖中。用清水冲洗幼虫，以去除其体表的食物残渣，注意避免造成任何损伤。

将幼虫转移至已准备好的微量离心管中，使用组织裂解仪进行裂解，以从肠道中提取食用染料。通过将2毫升微量离心管直接倒置在新的1.5毫升洁净微量离心管上来转移提取液。操作时应轻柔，使大部分玻璃珠保留在2毫升离心管底部。

将提取物在4摄氏度下以最大速度离心10分钟，以去除细胞碎片，然后将上清液转移至洁净的1.5毫升离心管中。为进行食物摄入量的比色定量，用甲醇对蓝色染料进行连续一比二系列稀释，制备标准溶液。取100微升实验样品、标准品和空白对照加入96孔微孔板的孔中，并在600纳米处测定吸光度。

本方案用于量化在幼虫神经系统中特定神经元群体经热遗传激活后，动物所摄取的主要营养物质的相对含量。激活不同类型的神经元群体显著影响了三龄幼虫的主要营养物质平衡。对照组品系的摄食模式（此处以灰色表示）显示，在蛋白质与碳水化合物比例较高的饮食条件下，摄食量呈现预期的下降趋势，从而证明了该方法的有效性。

实验动物被划分为五种表型类别：进食量大且通过过量进食补偿蛋白质稀释、进食量大但不进行补偿、进食量少但进行补偿、进食量少且不进行补偿，以及进食异常。针对每一种表型类别和基因型，展示了三龄幼虫中枢神经系统中的GFP表达模式。在实施本实验方案时，关键在于获得发育同步的早期三龄幼虫，以尽量减少与动物行为相关的变异。

采用本方案，对食物进行放射性标记将有助于验证并进一步分析使用该方法所发现的阳性结果。