蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

这种猪卵母细胞包封方案能够维持卵丘复合体（COCs）的球形结构，防止其扁平化，从而避免卵母细胞与周围卵泡细胞之间的缝隙连接受到破坏。所描述的两种方案主要优势在于操作简便，且能有效控制卵母细胞和化学感受细胞的存活。

这两种培养系统都是生殖生物学基础研究的有力工具，可能对改善不孕症治疗具有临床意义。它们还可用于开发新型生物技术方法以及改良家畜。在冲洗卵巢后，将其转移至盛有HM培养基的烧杯中，并在后续所有操作过程中置于38摄氏度的培养箱中保存。

吸取大型猪卵泡中的卵泡液，在室温下以100 × g离心10分钟。然后，使用连接无菌注射器的0.2微米孔径滤膜过滤上清液，并在-80摄氏度下迅速冷冻。为从中小型卵泡中分离卵丘-卵母细胞复合体（COCs），将两到三个卵巢转移至盛有HM的无菌10厘米培养皿中。用无菌外科15号刀片轻轻切割突出的卵巢卵泡表面，使卵泡液和COCs流出进入培养皿中。

用连接一次性注射器的28号针头抽吸卵泡内容物，并将其转移至另一个培养皿中。准备体外受精用培养皿时，在中央孔中加入1毫升HM，在外圈加入3至4滴HM。然后使用聚碳酸酯微量移液管将未受损的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至外圈的HM液滴中，并短暂冲洗3至4次。

操作完成后，将它们分别转移至中央孔中。将体外受精板存放于培养箱中。按照文本稿件中的描述配制凝血酶和纤维蛋白原溶液。

在操作当天，将纤维蛋白原溶液置于冰上缓慢解冻，并在使用前恢复至室温。将0.5%海藻酸钠溶液与纤维蛋白原溶液按1:1比例混合，终体积为2毫升，轻轻涡旋混匀。通过在玻璃显微镜载玻片上贴附薄层石蜡膜来修复培养腔室。

用移液器吸取7.5 µL FA混合液，滴加到带有间隔垫片的石蜡膜包被的玻片上，每片放置8至10滴，排列成两行。使用微量移液器将3至5个COCs连同最小体积的成熟培养基转移至FA液滴的中央。在每个FA液滴上方加入7.5 µL凝血酶溶液，以覆盖液滴表面。

无需混合，因为凝胶几乎会立即形成。用预先准备好的盖玻片覆盖孵育室，然后将孵育室倒置，放入内衬湿润滤纸的100毫米培养皿中。将培养皿置于含5%二氧化碳、38摄氏度的培养箱中孵育5至7分钟。

孵育后，将每个FA胶囊转移至含有100 µL成熟培养基的96孔板的孔中。每两天用新鲜预平衡的成熟培养基更换一半培养基。使用倒置光学显微镜在10倍放大倍数下对COC进行成像。

将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）培养四天后，从孔中移除成熟培养基，并加入100微升含10国际单位/毫升藻酸酶裂解液的DMEM培养基。将培养板置于培养箱中孵育25至30分钟。从溶解的胶囊中取出COCs。

用DMEM洗涤数次，然后将其转移至含有PBS的IVF培养皿的内圈中。在30毫米的培养皿中铺一层5克FEP粉末。将含有3至5个COCs的成熟培养基单滴分布于FEP粉末上。

轻轻旋转培养皿，使其做圆周运动，确保颗粒完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠（liquid marbles，简称 LMs）。准备数个 60 毫米的 IVF 培养皿，在外圈加入 3 至 4 毫升无菌水，以创建一个湿度环境。使用 1000 微升移液器吸取形成的液态弹珠，并将其转移至中央孔洞中。

将类球体在38摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育四天。更换培养基时，向每个LM中加入30 µL成熟培养基，使其铺展。当类球体内容物溶解后，将从生物反应器中释放出的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至培养皿中新鲜成熟培养基的液滴中。

在成熟培养基中洗涤三到四次后，将COCs连同30微升新鲜培养基转移至FEP粉末床中。轻轻旋转培养板作圆周运动，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，并形成新的LM。随后，将LM转移至体外受精（IVF）培养皿中。两种体外成熟体系均获得颗粒细胞紧密黏附、卵丘细胞层完整的COCs。

囊胚细胞活力分析证实，两种包封系统均达到了最佳生长条件。在两组中均仅观察到高活力的卵母细胞区域。采用透射电子显微镜对卵母细胞进行成像。

线粒体呈均匀分布，具有壳状形态。仅有少数线粒体呈拉长状，且其聚集现象偶见。内质网或与线粒体相关联，或游离于卵母细胞胞质中。

液滴呈现为微小、深色、圆形的结构，高尔基体则表现出扩张的扁平囊。将受精胶囊从孵育室转移至培养板，以及拾取并转移受精格式LM至体外受精培养皿时，操作必须精确且小心。