Name: 蛋白酶降解藻酸盐水凝胶和疏水性微生物反应器，用于猪卵母细胞封装 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 了解使用纤维蛋白-藻酸盐水凝胶和氟化乙烯丙烯粉末封装猪卵母细胞的方法。该技术维持卵丘-卵母细胞复合体的球形结构，提高细胞存活率，适用于生殖生物学研究和不孕症治疗应用。

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作者非常感谢：雅盖隆大学动物学与生物医学研究所发育生物学与无脊椎动物形态学系的 dr Waclaw Tworzydlo 提供透射电子显微镜（TEM）技术设施；雅盖隆大学动物学与生物医学研究所内分泌学系的 Beata Snakowska 女士提供技术协助；以及雅盖隆大学动物学与生物医学研究所细胞生物学与成像系提供的 JEOL JEM 2100HT（JEOL，东京，日本）。本研究由波兰国家科学中心资助，项目编号为 2018/29/N/NZ9/00983。

以下实验程序已获得雅盖隆大学动物学与生物医学研究中心动物福利委员会的批准。
1. 猪卵丘-卵母细胞复合体的分离
<ol>
	<li>为获取卵泡分离材料，需在当地屠宰场摘取未成年母猪（约6-7月龄，体重70至80公斤）的卵巢。每次实验从10只动物中选取约20个猪卵巢用于卵母细胞- cumulus复合体（COCs）的分离。 
	注：假设每个卵巢可获得3–5个卵泡，则卵泡总数在60至100个之间。</li>
	<li>将卵巢置于装有含1%抗生素/抗真菌溶液（AAS）的无菌磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4；38 °C）的保温瓶中。确保实验材料在1小时内运送至实验室，并用含抗生素的无菌PBS冲洗两次。</li>
	<li>冲洗卵巢后，将其转移至盛有HM培养基的烧杯中，并在38 °C培养箱中保存，以供后续所有操作使用。 
	注：为在卵母细胞操作过程中获得最佳效果，所有操作应在DMEM/F12培养基（操作培养基，HM）中进行，添加2.5%抗生素/抗真菌溶液（AAS）和10%胎牛血清（FBS），并在带有温度控制（38 °C）的加热台和层流罩内操作，以控制环境中的CO2水平并维持pH，同时最大限度减少细菌污染。</li>
	<li>从大型猪卵泡（直径6-8 mm）中通过抽吸收集卵泡液（FF），并在室温下以100 x g离心10分钟。随后，使用连接无菌注射器的0.2 μm孔径膜滤器过滤上清液，并立即在-80 °C速冻保存。 
	注：使用胰岛素注射器（u-40）抽吸卵泡液。</li>
	<li>确保仅选择健康、中等大小的卵泡（直径4-6 mm）用于COCs的分离42。 
	注：I级COCs，其卵母细胞完整且呈圆形，胞质均匀，且具有多层（至少3-4层）致密的卵丘细胞，适用于后续的三维体外成熟（3D IVM）程序43。</li>
	<li>为分离COCs，将2-3个卵巢转移至盛有HM培养基的无菌10 cm直径培养皿中。通过以下任一方法从中等大小的卵泡中分离COCs。
	<ol>
		<li>使用无菌手术刀片15C轻轻切开突出的卵巢卵泡表面，使卵泡液连同COCs流出至培养皿中。</li>
		<li>使用连接一次性注射器的28 G（5/8”）针头抽吸卵泡内容物，并将其转移至培养皿中。 
		注：弃去卵巢组织残余。后续分离步骤在体视显微镜下进行。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备3–5个60 mm的体外受精（IVF）培养皿。
	<ol>
		<li>向中央孔中加入1 mL HM培养基，并在周围环形区域放置3-4滴HM培养基（每滴50 µL）。</li>
		<li>然后使用聚碳酸酯微量移液管将完好的COCs转移至外圈的HM液滴中，短暂冲洗3-4次。</li>
		<li>最后，将COCs分别转移至中央孔中。将这些IVF培养皿存放于培养箱中，以供后续操作使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集COCs后，通过将其随机分配至以下列出的两种不同IVM包封方案中，进行最终筛选步骤。</li>
</ol>
2. 纤维蛋白-海藻酸盐水凝胶微球中的包封
<ol>
	<li>在2.0 mL无菌微量离心管中，配制1 mL含100 mM CaCl2的50 IU/mL凝血酶Tris缓冲盐水溶液（TBS；pH 7.4）。</li>
	<li>配制纤维蛋白原储备液（50 mg/mL，溶于TBS），并保持冷冻保存。 
	注意：为避免纤维蛋白原在TBS中溶解时结块，应先将TBS加热至37 °C。
	<ol>
		<li>在实验当天，将储备液置于冰上缓慢解冻，并在使用前恢复至室温。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用前，将0.5%海藻酸钠溶液与50 mg/mL纤维蛋白原溶液按1:1比例混合，最终得到2 mL的FA混合液。在无菌微量离心管中轻轻涡旋混匀，避免产生气泡。</li>
	<li>为制备&#34;孵育室&#34;，在玻璃载玻片上贴附薄层石蜡膜。 
	注意：使用前用70%乙醇擦拭载玻片。每两个载玻片构成一个孵育室。为实现间隔，在其中一个载玻片上放置3 mm间隔垫片。</li>
	<li>用移液器将7.5 μL FA混合液滴加到已涂覆石蜡膜并带有间隔垫片的玻璃载玻片上。每张载玻片放置8–10滴，排列成两行。</li>
	<li>使用微量移液器，将3–5个卵丘-卵母细胞复合体（COCs）连同最少体积（最多5 µL）的成熟培养基（MM）转移至FA液滴中央，确保位置精准。该操作需要良好的手动技巧和精确性。&#160; 
	注意：成熟培养基（MM）由DMEM/F12组成，添加10 IU/mL PMSG、10 IU/mL hCG、10% FBS以及在步骤1.4中收集的50%猪卵泡液（FF）。</li>
	<li>向每个FA液滴中加入7.5 μL凝血酶/Ca2+溶液，刚好覆盖液滴即可。无需混匀，因为凝胶几乎会瞬间形成。</li>
	<li>将另一张预先准备好的玻璃载玻片盖在FA微胶囊上，封闭孵育室。小心而稳固地将整个装置翻转倒置，并放入已铺有湿润滤纸的100 mm培养皿中，以防止干燥。</li>
	<li>随后将培养皿转移至5% CO2培养箱（38 °C）中孵育约5–7分钟。此后，由于纤维蛋白和海藻酸钠同时发生凝胶化，FA微胶囊将变得浑浊。</li>
	<li>将FA微胶囊小心转移至96孔板中（每孔一个胶囊），每孔加入100 μL MM。 
	注意：为避免损伤已形成的FA微胶囊，应使用手术镊子谨慎操作。</li>
	<li>每隔2天更换一半MM（50 μL），补充新鲜且预先平衡的培养基。使用倒置光学显微镜（10倍放大）对COCs进行成像观察。 
	注意：COCs的FA培养条件为：38 °C，5% CO2气氛，相对湿度95%。体外成熟培养4天后，由于纤维蛋白组分逐步降解，水凝胶将变得几乎透明。剩余的海藻酸钠需通过海藻酸裂解酶进行酶解降解——这是一种来源于植物的酶，可特异性降解海藻酸钠，但不影响动物细胞。
	<ol>
		<li>移除含有微胶囊孔中的MM，每孔加入100 μL含10 IU/mL海藻酸裂解酶的DMEM溶液。将培养板置于培养箱中孵育25–30分钟。</li>
		<li>从溶解的微胶囊中取出COCs。 
		注意：可使用剪口的移液器吸头完成此操作。</li>
		<li>在新鲜DMEM中洗涤数次后，将COCs转移至含有PBS的受精培养皿内圈中（每皿5–10个COCs）。随后可用于进一步的形态学或生物化学分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 超疏水氟化乙烯丙烯（FEP）微生物反应器中的封装。
注意：确保所有体外成熟（IVM）操作均在恒温控制台上进行，并在整个操作过程中将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）维持在38 °C。
<ol>
	<li>准备一个直径为30 mm的培养皿，其中含有5 g平均粒径为1 μm的FEP粉末。 
	注意：必须使用新鲜的FEP粉末。重复使用的FEP容易发生聚集并形成团块。</li>
	<li>将一步骤1.6中分离得到的3-5个COCs悬浮于一滴MM（体积约30 μL）中，并将其滴加至FEP粉末床表面。轻轻旋转培养皿作圆周运动，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠（LM）。</li>
	<li>使用带有1,000 μL吸头的移液器拾取已形成的LM。 
	注意：将移液器吸头边缘剪裁，使其口径适配LM的直径（4-5 mm）。制备后的吸头内径应略大于LM的直径。</li>
	<li>准备数个直径为60 mm的体外受精（IVF）培养皿。在外圈加入3-4 mL无菌水以构建湿度环境，随后将一个LM放入中央孔中。 
	注意：该操作需要良好的手动技巧和精确性——若LM放置不当或即使从较低高度跌落，都会导致其破裂。</li>
	<li>将LM置于38 °C、5 % CO2的培养箱中培养4天。
	<ol>
		<li>每天更换培养基，操作如下：向每个LM上添加30 μL的MM，液体直接接触会破坏包覆FEP粉末的疏水性，导致LM展开。待LM内容物完全溶解后，将释放出的COCs转移至培养皿中的一滴新鲜MM中。 
		注意：为精确转移释放的COCs，建议使用聚碳酸酯微量移液管。</li>
		<li>用MM清洗数次（3-4次）以去除残留的FEP颗粒后，将COCs连同30 μL新鲜MM转移至FEP粉末床上。轻轻旋转培养皿作圆周运动，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，重新形成新的LM。</li>
		<li>随后重复步骤3.3–3.4的操作。 
		注意：FEP粉末形成的透明包覆层允许通过光学显微镜观察LM内部情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用两种三维系统对经96小时体外成熟（IVM）处理后的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）进行表征
注意：为评估所用体外成熟（IVM）系统的效率，需在光学显微镜下对卵丘-卵母细胞复合体（COCs）进行形态学评分。此外，可采用钙黄绿素 AM 与碘化乙啶同型二聚体（EthD-1）进行双荧光染色，以分析 COCs 的存活率44。
<ol>
	<li>通过光学显微镜和荧光显微镜对体外成熟（IVM）后的卵母细胞进行形态学检查。
	<ol>
		<li>用38 °C的1×PBS洗涤卵丘-卵母细胞复合体（COCs）（包括来自FAB培养和LM来源的COCs）。 
		注意：为便于操作COCs并在染色过程中避免损伤，建议使用96孔或48孔板，并通过将COCs转移至后续孔中完成每一步染色。</li>
		<li>在37 °C下，将COCs置于100 µL含1.6 mM钙黄绿素AM（calcein AM）和5.5 mM碘化乙啶同型二聚体-1（EthD-1）的溶液中孵育30–45分钟。两种试剂均用1×PBS稀释。 
		注意：由于这是双色荧光检测，该步骤需在避光条件下进行。</li>
		<li>孵育后，用PBS洗涤COC两次，然后将其浸入抗荧光淬灭封片剂中，以防止荧光蛋白和荧光染料快速光漂白（材料表）。 
		注意：可用任何指甲油密封盖玻片边缘，防止干燥。</li>
		<li>在共聚焦激光扫描显微镜下观察染色样本。 
		注意：为激发两种探针（即钙黄绿素和碘化乙啶同型二聚体-1，EthD-1）的荧光，将氩激光调节至488 nm。发射荧光通过三色分光镜（488/561/633）分离，绿色荧光（钙黄绿素）在505−570 nm波段检测，红色荧光（EthD-1）在630−750 nm波段检测。</li>
		<li>根据共聚焦荧光成像结果，依据颗粒细胞死亡比例，采用改良分类法将COCs分为四类35。 &#160;V1：估计有100%存活的卵丘细胞（CCs）的COCs；V2：有10%死亡CCs的COCs；V3：有10–50%死亡CCs的COCs；V4：有50%死亡CCs的COCs。 
		注意：技术上，使用活/死细胞染色法评估卵母细胞活力较为困难；因此，可通过分析线粒体超微结构或其活性等方式进行估计。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过透射电子显微镜（TEM）对体外成熟（IVM）后卵母细胞的超微结构进行检查。
	<ol>
		<li>将COCs置于100 µL含2.5%戊二醛的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2，室温）中固定2小时。</li>
		<li>将COCs浸入100 µL 0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中（4 °C过夜），并用相同缓冲液冲洗。</li>
		<li>用含1%四氧化锇的0.1 M二甲胂酸钠缓冲液（室温）对COCs进行后固定1小时。</li>
		<li>经醋酸铀（1%）染色后，将COCs依次用浓度递增的乙醇溶液（50%、60%、70%、90%和100%）进行脱水，室温下渗透过夜，随后更换两次树脂，最后包埋于LR White树脂中。</li>
		<li>随后，为定位和评估样本，使用亚甲蓝/天青II对半薄切片（1 µm）进行染色。</li>
		<li>最后，在透射电子显微镜（TEM）下对双重染色的超薄切片进行超微结构水平的观察。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

不仅维持卵母细胞体外生长，同时维持其周围卵丘细胞的生长并支持卵母细胞成熟，这对于辅助生殖技术的成功以及深入理解体细胞与卵母细胞之间的相互作用至关重要，尤其是在人类或猪等经历较长卵泡发育周期的物种中尤为如此。不断改进的体外成熟（IVM）技术正成为一种有用的工具，可用于多囊卵巢综合征（PCOS）、卵巢早衰或确定性不孕（如癌症治疗后）等情况下生育力的保存。此外，由于某些卵巢功能障碍可能由卵泡发育调控异常引起，阐明调控卵母细胞正常发育的分子与细胞机制，可为这些疾病的病理生理学机制及合理治疗提供重要见解。为在IVM过程中维持卵丘-卵母细胞复合体（COCs）三维结构的体外培养系统，需将其包封于基质或生物反应器中的步骤。本文描述了一种适用于猪卵母细胞培养的实验方案。本文所介绍的两种用于诱导猪COCs生长与发育的三维体外培养系统均操作简便，可有效调控卵母细胞和卵丘细胞的存活。
本文首次介绍了一种利用卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包埋于纤维蛋白-海藻酸盐水凝胶微珠（FAB）中的体外培养方法，可实现卵母细胞在具有活跃细胞响应性的基质环境中进行三维生长。此前发表的基于海藻酸盐水凝胶的实验方案通常用于研...

开发各种培养系统（包括三维（3D）培养系统）旨在为从卵泡中分离出的早期阶段卵母细胞提供最佳的生长和成熟条件。这对于辅助生殖技术（ART）具有重要意义，特别是考虑到越来越多女性在癌症治疗后面临不孕问题1。卵母细胞在体外条件下的成熟（IVM）已成为一项成熟的技术，主要用于家畜繁殖中的体外胚胎生成2。然而，在大多数哺乳动物物种中，即使卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的成熟率较高（范围为60至90&#160;％）3，其发育潜能仍无法满足实际需求。这是因为通过该方式获得的受精卵即使发育至囊胚阶段的比例也较低，且移植到代孕动物体内后其妊娠至足月的存活率下降。因此，有必要提高经IVM程序处理的卵母细胞所获得胚胎的发育潜能4。为此，研究人员正在设计新的成熟培养基5，测试不同的体外培养时间6,7，并尝试在培养基中添加各种生长因子和分子8,9。
任何完整的体外成熟（IVM）系统的首要步骤是在体外培养期间为卵母细胞的可持续生长创造最佳条件。卵母细胞的生长是其恢复减数分裂能力的特异性指标之一10,11。此外，一个合适的卵母细胞体外培养系统必须能够支持其核成熟和胞质分化12。卵丘-卵母细胞复合体（COC）的形态是辅助生殖技术（ART）临床中用于选择最适合进行后续体外受精（IVF）程序的人类和家畜卵母细胞的另一个重要指标12,13。所考虑的COC形态学特征包括：卵母细胞直径、胞质颗粒化程度以及第一极体的完整性14,15。此外，卵母细胞的发育潜能还与其卵丘细胞的外观、致密程度以及围绕卵母细胞的细胞层数相关。适当的卵母细胞体外培养系统还必须维持卵母细胞与卵丘细胞之间的正常相互作用以及细胞骨架的稳定性16,17,18,19。迄今为止，已在人类卵丘-卵母细胞复合体中成功实现卵母细胞的体外生长20。使用牛的卵丘-卵母细胞复合体也已获得活产个体：这些复合体从不成熟卵巢卵泡中分离后，在体外培养14天，直至卵母细胞达到足够大小以进行IVF操作21。类似地，从狒狒窦状卵泡中分离的卵丘-卵母细胞复合体经体外培养后进行IVM，可产生能够重新启动减数分裂并发育至第二次减数分裂中期（MII期）且纺锤体结构正常的卵母细胞22。然而，在该研究中作者并未尝试对这些卵母细胞进行受精。尽管如此，这些结果表明，类似的程序不仅可应用于这些特定哺乳动物物种，也可应用于从卵泡中获取的人类卵丘-卵母细胞复合体，从而有望获得高质量的卵母细胞，适用于成功的IVF技术。
上述结果是在应用常规体外成熟（IVM）方案期间获得的，期间卵母细胞在二维（2D）培养系统中进行培养。在2D培养系统中的常规操作是将卵母细胞浸入适当培养液的液滴中，并以矿物油覆盖23,24假设在体外卵母细胞培养过程中使用油层覆盖可防止液体蒸发，从而确保培养环境的pH值和渗透压维持在适宜水平。尽管这种二维培养体系能够获得高达87%的成熟猪卵母细胞25已证实，矿物油覆盖层会导致对卵母细胞正常发育至关重要的脂溶性物质发生显著扩散26此外，由于类固醇（孕酮和雌激素）在卵母细胞培养过程中扩散至矿物油中，导致猪卵母细胞的核成熟延迟，且发育能力降低。这可能导致获得的受精卵数量较少，且这些受精卵进一步表现出向囊胚阶段发育的能力低下，以及移植至受体动物后存活率差的特点。27因此，研究人员正致力于通过为卵丘细胞（CCs）复合体中的卵母细胞创造最佳培养条件，以实现其细胞质和细胞核的同步成熟，从而提高体外成熟（IVM）后获得的卵母细胞所来源胚胎的发育潜能，尤其是采用三维（3D）培养系统。在过去二十年中，已开发出多种创新的3D体外培养系统。28,29这些设计旨在维持细胞的天然空间结构，避免其在培养皿中发生扁平化，而这在传统的二维培养中无法实现。通过保持卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的正常结构以及各组分之间经由间隙连接的正常通讯，可确保其在培养过程中的结构完整性和功能活性。30已采用天然生物材料（如细胞外基质（ECM）中的胶原蛋白和透明质酸等组分）评估生物支架在卵丘-卵母细胞复合体三维体外培养中的适用性。31 或惰性聚合物（海藻酸盐）32这些在多个物种中进行的尝试，在卵母细胞减数分裂恢复及其完全成熟能力的获得方面取得了令人鼓舞的结果33,34,35然而，迄今为止，尚未开发出适用于从包括猪在内的大型家畜中分离的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）成熟的3D培养系统。
本研究描述了两种可用于猪卵丘-卵母细胞复合体（COCs）三维培养的方案。第一种方案描述了在纤维蛋白-海藻酸盐微珠（FAB）中的包封技术。FAB可通过同时混合海藻酸盐溶液和纤维蛋白溶液并使其发生同步凝胶化过程而形成。这种组合提供了动态的机械环境，因为两种组分均对基质刚性有贡献。此前已有研究将类似溶液用于小鼠卵巢卵泡的培养与成熟36。在本方案中，为避免海藻酸盐-纤维蛋白网络过早降解，采用了适当较高浓度的氯化钙溶液，以确保凝胶化过程快速且稳定。该动态机械环境可模拟COCs在体内自然卵泡内环境中生长并增大的条件。此外，本研究还展示了COCs三维培养系统的代表性结果，其中将COCs悬浮于液滴中，并用氟乙烯丙烯（FEP；六氟丙烯与四氟乙烯的共聚物）粉末颗粒包裹，形成微型生物反应器（液态弹珠，LM）。液态弹珠是一种三维生物反应器形式，此前已被证明可支持多种生物体系的生长，包括活体微生物37、肿瘤球状体38和胚胎干细胞39。液态弹珠也已成功应用于绵羊卵母细胞的培养40。在大多数使用液态弹珠的实验中，生物反应器通常采用粒径为1 μm的聚四氟乙烯（PTFE）粉末床制备41。本方案采用FEP，其组成和性质与氟聚合物PTFE非常相似，但FEP比PTFE更易成型、质地更柔软，且尤为关键的是具有高度透明性。
两种3D系统均能维持体外培养的气体环境。它们还能通过防止卵丘复合体（COCs）变平以及间隙连接随之被破坏，保持其三维结构，从而维持卵母细胞与其周围卵泡细胞之间的功能关系。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;常规&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）100 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td>处理培养基中终浓度为2.5%。PBS中为1%（步骤1.2）</td></tr><tr><td>DMEM/F12（500 ml）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td>处理培养基和成熟培养基</td></tr><tr><td>DPBS（不含Ca、Mg），1×，500 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS（100 ml）</td><td>Thermo Fisher</td><td>16140063</td><td>处理培养基和成熟培养基中终浓度均为10%（步骤：1.5，2.6）</td></tr><tr><td>PBS（1×，pH 7.4）500 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TBS储存液（10×，pH 7.4）500 ml</td><td>Cayman Chemicals</td><td>600232</td><td>终浓度为1×。可使用其他品牌</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;成熟培养基&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG（1瓶，10,000 U）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>BioVendor</td><td>RP1782721000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;纤维蛋白-海藻酸盐微珠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>海藻酸盐裂解酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1603</td><td>（步骤2.11.1）</td></tr><tr><td>凝血酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9326-150UN</td><td>（步骤2.1）</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>（步骤2.1）</td></tr><tr><td>纤维蛋白原（250 mg）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3879</td><td>（步骤2.2）</td></tr><tr><td>海藻酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W201502</td><td>（步骤2.3）用于配制海藻酸盐溶液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;液态弹珠&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP</td><td>Dyneon GmbH 3M AdMD</td><td>A-66670</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;形态学检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>哺乳动物细胞活力/细胞毒性检测试剂盒（LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit）</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td>（步骤4.1）荧光发射波长：钙黄绿素为494 nm，EthD-1为528 nm；检测波长：钙黄绿素为517 nm，EthD-1为617 nm</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>封片介质</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;超微结构检测&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>戊二醛溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>终浓度为2.5%（步骤4.2.1）</td></tr><tr><td>LR White 树脂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9774</td><td>（步骤4.2.4）</td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>（步骤4.2.5）</td></tr><tr><td>四氧化锇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O5500</td><td>（步骤4.2.3）</td></tr><tr><td>三水合二甲胂酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td>用于配制0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.2）</td></tr><tr><td>醋酸铀</td><td>POCH</td><td>868540111</td><td>（步骤4.2.4）</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;专用仪器与工具&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm 培养皿</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 体外受精培养皿</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Grid Premium 细胞操作移液器</td><td>RI Life Sciences</td><td>8-72-288</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Tip</td><td>RI Life Sciences</td><td>8-72-4155/20</td><td></td></tr><tr><td>加热台</td><td>SEMIC</td><td></td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AIC-PE</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>无菌培养皿（10 cm）</td><td>NEST Biotechnology</td><td>704002</td><td></td></tr><tr><td>带0.2 &amp;micro;m 滤膜的无菌注射器滤器</td><td>GOOGLAB SCIENTIFIC</td><td>GB-30-022PES</td><td></td></tr><tr><td>保温瓶</td><td>Quechua</td><td>5602589</td><td>可使用其他品牌</td></tr></tbody></table>

蛋白酶可降解的海藻酸盐水凝胶与疏水性微型生物反应器用于猪卵母细胞包封

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

在生殖生物学中，始于人工授精和胚胎移植技术的生物技术革命，推动了辅助生殖技术的发展，例如卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）以及通过体细胞核移植实现的家畜克隆。其中，IVM技术具有特别重要的意义。该技术是为多种应用提供成熟、高质量卵母细胞的基础平台，这些应用包括缩短具有重要经济价值或濒危物种的世代间隔、人类体外生殖相关研究，以及用于细胞治疗的转基因动物生产。卵母细胞质量这一术语涵盖了其完成成熟、受精并最终产生健康后代的能力。这意味着高质量的卵母细胞对于包括IVF在内的成功受精过程至关重要。然而，要建立一种可靠的培养方法，不仅支持人类卵母细胞，还能支持其他大型哺乳动物卵母细胞的生长，仍面临诸多挑战。IVM的第一步是卵母细胞的体外培养。本研究描述了两种猪卵母细胞三维（3D）培养的方案。第一种方案中，将三维模型的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包埋于纤维蛋白-海藻酸盐微珠互穿网络结构中，其中纤维蛋白与海藻酸盐混合物同时发生凝胶化。第二种方案中，将COCs悬浮于液滴中，并用氟乙烯丙烯（FEP；六氟丙烯与四氟乙烯的共聚物）粉末颗粒包裹，形成被称为“液态弹珠”（LM）的微型生物反应器。这两种3D培养系统均能维持稳定的气体环境以支持体外培养。同时，它们通过防止COCs扁平化及其导致的间隙连接破坏，保持了COCs的三维结构，从而维系了卵母细胞与其周围卵泡细胞之间的功能关系。

在使用两种IVM系统的COCs中，颗粒细胞彼此紧密黏附，且大多数回收的COCs具有完整的卵丘细胞层（图1A,B）。此外，仍有相当比例的卵丘细胞得以保留。
从卵丘-卵母细胞复合体（COCs）活力分析获得的结果证实，两种用于在三维体外条件下包封猪卵母细胞的系统均能确保最佳生长条件（图2）。在两组实验中均仅观察到高活力的卵母细胞，其中FAB组V1为13%，V2为87%，LM组V1为10%，V2为90%（表1）。
通过透射电子显微镜（TEM）观察，线粒体在卵母细胞中呈均匀分布，体外成熟（IVM）后的线粒体形态呈壳状45。仅有少数线粒体呈伸长形态，且其聚集现象偶见发生（图1C,D）。内质网可见，或与线粒体相关联，...

本文展示了两种在三维培养条件下包封猪卵母细胞的实验方案。第一种方法是将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）包封于纤维蛋白-海藻酸盐微珠中；第二种方法是将其与氟化乙烯丙烯粉末颗粒（微型生物反应器）共同封装。这两种系统均可提供最佳条件，以维持卵母细胞的三维结构。

在生殖生物学领域，始于人工授精和胚胎移植技术的生物技术革命推动了……的发展

这种猪卵母细胞包封方案能够维持卵丘复合体（COCs）的球形结构，防止其扁平化，从而避免卵母细胞与周围卵泡细胞之间的缝隙连接受到破坏。所描述的两种方案主要优势在于操作简便，且能有效控制卵母细胞和化学感受细胞的存活。这两种培养系统都是生殖生物学基础研究的有力工具，可能对改善不孕症治疗具有临床意义。它们还可用于开发新型生物技术方法以及改良家畜。在冲洗卵巢后，将其转移至盛有HM培养基的烧杯中，并在后续所有操作过程中置于38摄氏度的培养箱中保存。吸取大型猪卵泡中的卵泡液，在室温下以100 × g离心10分钟。然后，使用连接无菌注射器的0.2微米孔径滤膜过滤上清液，并在-80摄氏度下迅速冷冻。为从中小型卵泡中分离卵丘-卵母细胞复合体（COCs），将两到三个卵巢转移至盛有HM的无菌10厘米培养皿中。用无菌外科15号刀片轻轻切割突出的卵巢卵泡表面，使卵泡液和COCs流出进入培养皿中。用连接一次性注射器的28号针头抽吸卵泡内容物，并将其转移至另一个培养皿中。准备体外受精用培养皿时，在中央孔中加入1毫升HM，在外圈加入3至4滴HM。然后使用聚碳酸酯微量移液管将未受损的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至外圈的HM液滴中，并短暂冲洗3至4次。操作完成后，将它们分别转移至中央孔中。将体外受精板存放于培养箱中。按照文本稿件中的描述配制凝血酶和纤维蛋白原溶液。在操作当天，将纤维蛋白原溶液置于冰上缓慢解冻，并在使用前恢复至室温。将0.5%海藻酸钠溶液与纤维蛋白原溶液按1:1比例混合，终体积为2毫升，轻轻涡旋混匀。通过在玻璃显微镜载玻片上贴附薄层石蜡膜来修复培养腔室。用移液器吸取7.5 µL FA混合液，滴加到带有间隔垫片的石蜡膜包被的玻片上，每片放置8至10滴，排列成两行。使用微量移液器将3至5个COCs连同最小体积的成熟培养基转移至FA液滴的中央。在每个FA液滴上方加入7.5 µL凝血酶溶液，以覆盖液滴表面。无需混合，因为凝胶几乎会立即形成。用预先准备好的盖玻片覆盖孵育室，然后将孵育室倒置，放入内衬湿润滤纸的100毫米培养皿中。将培养皿置于含5%二氧化碳、38摄氏度的培养箱中孵育5至7分钟。孵育后，将每个FA胶囊转移至含有100 µL成熟培养基的96孔板的孔中。每两天用新鲜预平衡的成熟培养基更换一半培养基。使用倒置光学显微镜在10倍放大倍数下对COC进行成像。将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）培养四天后，从孔中移除成熟培养基，并加入100微升含10国际单位/毫升藻酸酶裂解液的DMEM培养基。将培养板置于培养箱中孵育25至30分钟。从溶解的胶囊中取出COCs。用DMEM洗涤数次，然后将其转移至含有PBS的IVF培养皿的内圈中。在30毫米的培养皿中铺一层5克FEP粉末。将含有3至5个COCs的成熟培养基单滴分布于FEP粉末上。轻轻旋转培养皿，使其做圆周运动，确保颗粒完全覆盖液滴表面，形成液态弹珠（liquid marbles，简称 LMs）。准备数个 60 毫米的 IVF 培养皿，在外圈加入 3 至 4 毫升无菌水，以创建一个湿度环境。使用 1000 微升移液器吸取形成的液态弹珠，并将其转移至中央孔洞中。将类球体在38摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育四天。更换培养基时，向每个LM中加入30 µL成熟培养基，使其铺展。当类球体内容物溶解后，将从生物反应器中释放出的卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至培养皿中新鲜成熟培养基的液滴中。在成熟培养基中洗涤三到四次后，将COCs连同30微升新鲜培养基转移至FEP粉末床中。轻轻旋转培养板作圆周运动，确保粉末颗粒完全覆盖液滴表面，并形成新的LM。随后，将LM转移至体外受精（IVF）培养皿中。两种体外成熟体系均获得颗粒细胞紧密黏附、卵丘细胞层完整的COCs。囊胚细胞活力分析证实，两种包封系统均达到了最佳生长条件。在两组中均仅观察到高活力的卵母细胞区域。采用透射电子显微镜对卵母细胞进行成像。 线粒体呈均匀分布，具有壳状形态。仅有少数线粒体呈拉长状，且其聚集现象偶见。内质网或与线粒体相关联，或游离于卵母细胞胞质中。液滴呈现为微小、深色、圆形的结构，高尔基体则表现出扩张的扁平囊。将受精胶囊从孵育室转移至培养板，以及拾取并转移受精格式LM至体外受精培养皿时，操作必须精确且小心。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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